Содержание к диссертации
Введение
1 Общая характеристика работы 9
2 Обзор литературы 18
2.1 Особенности газообразных посредники как регуляторов физиологических функций 18
2.2 Оксид азота (II) 20
2.2.1 Оксид азота (II) и его физико-химические характеристики 20
2.2.2 Доноры и инактиваторы NO 22
2.2.3 Мишени действия и функции NO 24
2.2.4 Эффекты NO в нервной системе 28
2.2.5 Влияние NO на нервно-мышечную передачу 30
2.3 Монооксид углерода 33
2.3.1 Физико-химические свойства СО, токсикологические эффекты 34
2.3.2 Синтез монооксида углерода 35
2.3.2.1 Субстрат синтеза СО - гем 35
2.3.2.2 Гемоксигеназная система 39
2.3.2.3 Распределение гемоксигеназ в различных тканях 43
2.3.2.4 Регуляция активности гемоксигеназной системы 47
2.3.2.5 Сравнение СО и NO генерирующих систем 49
2.3.3 Физиологические эффекты СО 51
2.3.3.1 Эффекты СО в нервной системе 51
2.3.3.2 Эффекты СО в сердечно-сосудистой системе 53
2.3.3.3 СО как гиперполяризущий медиатор в желудочно-кишечном тракте 55
2.3.4 Механизмы действия СО 58
2.4 Сероводород 56
2.4.1 Сероводород, структура, физико-химические свойства 59
2.4.2 Синтез сероводорода 60
2.4.2.1 Метаболизм серосодержащих аминокислот 60
2.4.2.2 Молекулярная биология цистатионин р-синтазы и цистатионин у-лиазы 63
2.4.2.3 Ферментативный синтез сероводорода 66
2.4.2.4 Неферментативный синтез сероводорода 69
2.4.3 Катаболизм сероводорода 71
2.4.4 Токсичные эффекты и эндогенные концентрации сероводорода 72
2.4.5 Физиологическая роль сероводорода и мишени его действия 76
2.4.5.1 Эффекты сероводорода в нервной системе 76
2.4.5.2 Сероводород в гладкой мышце 81
2.5 Взаимодействие газообразных посредников - сероводорода, оксида азота (И) и монооксида углерода 84
3 Объекты и методы исследования 88
3.1 Объекты исследования 88
3.2 Растворы и фармакологические вещества 88
3.3 Электрофизиологические методы исследования 92
3.3.1 Экспериментальная ванночка и система перфузии 92
3.3.2 Изготовление, заполнение и подведение микроэлектродов 93
3.3.3 Регистрация биопотенциалов 95
3.3.4 Анализ синаптических сигналов 96
3.4 Иммуногистохимический метод 97
3.5 Проведение полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией 98
4 Результаты исследования и их обсуждение 103
Глава 1 Молекулярные механизмы действия оксида азота (II) на нервно-мышечную передачу 103
1.1 Результаты исследования 103
1.1.1 Эффекты экзогенных и эндогенных доноров оксида азота (II) на вызванную секрецию медиатора и ионные токи двигательного нервного окончания лягушки 103
1.1.2 Исследование эффектов L-аргинина - субстрата для NO-синтазы на секрецию медиатора и ионные токи двигательного нервного окончания 18
1.1.3 Исследование роли гуанилатциклазной системы в эффектах NO на секрецию медиатора и ионные токи нервного окончания 114
1.1.4 Исследование роли аденилатциклазной системы в эффектах N0 на секрецию медиатора и ионные токи нервного окончания 117
1.1.5 Исследование роли цГМФ-ингибируемой цАМФ-специфичной фосфодиэстеразы в эффектах N0 на секрецию медиатора и ионные токи нервного окончания 120
1.1.6 Исследование роли цГМФ-стимулируемой цАМФ-специфичной фосфодиэстеразы в эффектах NO на секрецию медиатора и ионные токи нервного окончания 122
1.1.7 Исследование роли протеинкиназы А в эффектах N0 на ионные токи нервного окончания и вызванную секрецию медиатора 125
1.2 Обсуждение результатов 127
1.2.1 Оксид азота угнетает вызванное освобождение медиатора и усиливает потенциалзависимые калиевые токи двигательного нервного окончания 127
1.2.2 Модуляция эндогенного синтеза NO с помощью субстрата и блокатора NO-синтаз. Влияние высоких и низких концентраций L-аргинина на секрецию медиатора и ионные токи двигательного нервного окончания 129
1.2.3 Изменение уровня циклических нуклеотидов опосредует эффекты N0 в двигательном нервном окончании лягушки 132
1.2.4 Роль цГМФ-зависимых фосфодиэстераз в эффектах оксида азота на вызванное освобождение ацетилхолина 133
Глава 2 Исследование роли монооксида углерода в регуляции нервно-мышечной передачи 138
2.1 Результаты исследования 138
2.1.1 Влияние экзогенного СО на секрецию медиатора и ионные токи двигательного нервного окончания 138
2.1.2 Влияние ингибитора гемоксигеназы (ZnPP-IX) на ионные токи нервного окончания и секрецию медиатора 142
2.1.3 Исследование роли гуанилатциклазной системы в эффектах СО на функцию двигательного нервного окончания 145
2.1.4 Исследование роль аденилатциклазной системы в эффектах СО 149
2.1.5 Исследование роли цГМФ-зависимых фосфодиэстераз в эффектах монооксида углерода на вызванное освобождение ацетилхолина 152
2.1.6 Иммуногистохимическое определение гемоксигеназы-2 в скелетных мышечных волокнах 154
2.2 Обсуждение результатов 154
2.2.1 Пресинаптические эффекты СО в нервно-мышечном синапсе лягушки 154
2.2.2 Эффект СО опосредуется цАМФ- и цГМФ-зависимыми сигнальными путями 156
2.2.3 Роль цГМФ-зависимых фосфодиэстераз в реализации эффектов СО 158
2.2.4 СО синтезируется в области нервно-мышечного синапса и модулирует освобождение медиатора из двигательного нервного окончания 160
Глава 3 Выявление эффектов и механизмов действия сероводорода на освобождение медиатора в нервно-мышечном соединении 164
3.1 Результаты исследования 164
3.1.1 Влияние сероводорода и гидросульфида натрия на вызванную секрецию медиатора и электрогенез двигательного нервного окончания лягушки в условиях низкого содержания ионов Са в растворе 164
3.1.2 Влияние гидросульфида натрия на спонтанные и вызванные потенциалы концевой пластинки при нормальной концентрации ионов Са2+ в растворе 168
3.1.3 Исследование роли аденилатциклазной системы в эффектах сероводорода на секрецию медиатора 170
3.1.4 Исследование роли гуанилатциклазной системы в эффектах сероводорода на секрецию медиатора и ионные токи нервного окончания 173
3.1.5 Исследование роли рианодиновых рецепторов внутриклеточных Са~+-депо в эффектах сероводорода на секрецию медиатора 175
3.1.6 Влияние субстрата и блокаторов синтеза сероводорода на секрецию медиатора в двигательном нервном окончании лягушки 177
3.1.7 Влияние гидросульфида натрия на спонтанную и вызванную секрецию медиатора в нервно-мышечном синапсе мыши 179
3.1.8 Влияние блокаторов синтеза сероводорода на секрецию медиатора из двигательного нервного окончания мыши 180
3.1.9 Выявление ферментов, генерирующих сероводород, в скелетной мышце мыши методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией 182
3.2 Обсуждение результатов 186
3.2.1 Пресинаптическое влияние сероводорода в нервно-мышечном синапсе лягушки 186
3.2.2 Роль циклических нуклеотидов в реализации эффектов сероводорода на нервно-мышечную передачу 188
3.2.3 Роль внутриклеточных Са -депо в реализации эффектов сероводорода на нервно-мышечную передачу 190
3.2.4 Возможность синтеза сероводорода в области нервно-мышечного синапса лягушки 192
3.2.5 Экзогенный сероводород усиливает, а блокаторы его синтеза снижают вызванное освобождение медиатора в нервно-мышечном синапсе мыши 193
3.2.6 Выявление экспрессии ферментов синтеза сероводорода в диафрагмальной мышце мыши 194
Заключение 197
Выводы 202
Список литературы 206
- Монооксид углерода
- Сероводород, структура, физико-химические свойства
- Иммуногистохимический метод
- Исследование роли протеинкиназы А в эффектах N0 на ионные токи нервного окончания и вызванную секрецию медиатора
Введение к работе
Актуальность исследования
В конце прошлого века был открыт новый класс биологически активных веществ - так называемых газообразных посредников, осуществляющих как межклеточную, так и внутриклеточную регуляцию разнообразных физиологических функций (L.J.Ignarro, 1999; E.Baranano et al., 2001; D.Boehning, S.H.Snyder, 2003). В настоящее время к этому классу относят такие газы как оксид азота (II), монооксид углерода и сероводород (M.D.Maines, 2004; R.Wang, 2002). Оказалось, что физиологическое значение газов не ограничивается регуляцией функций желудочно-кишечного тракта и сосудистой системы, где оно было определено первоначально, но распространяется также на центральную и на периферическую нервную систему (Г.Ф.Ситдикова, А.Л. Зефиров, 2006; R.Wang, 2004; G.F.Sitdikova et al., 2007; Е.В.Герасимова и др., 2008).
Оксид азота (II) (NO) был первой газообразной молекулой, открытие которой привело к пересмотру классических представлений о клеточной сигнальной трансдукции (L.J.Ignarro, 1999). NO был сначала идентифицирован как эндотелиальный фактор расслабления сосудов и медиатор бактерицидного действия макрофагов (L.J.Ignarro, 1987). Впоследствии было обнаружено, что глутамат, действуя на НМДА-рецепторы в центральной нервной системе, вызывает высвобождение химического агента, свойства которого сходны со свойствами эндотелиального фактора расслабления сосудов, и были получены доказательства нейрональной роли NO (D.S.Bredt, S.H.Snyder, 1992; J.Garthwaite, C.L.Boulton, 1995). Спустя несколько лет было показано, что NO модулирует секрецию медиаторов в центральной и периферической нервной системе в условиях как in vitro, так и in vivo (E.M.Schuman, D.V.Madison, 1994; H.Prast, A.Philippu, 2001; A.Bishop, J.E.Anderson, 2005). NO является модулятором освобождения ацетилхолина в нервно-мышечных соединениях как холоднокровных, так и теплокровных животных (S.A.Lindgren, M.W.Laird, 1994; А.Л.Зефиров и др., 1999; M.R.Mukhtarov et al., 1999; S.Thomas, R.J.Robitaille, 2001; S.J.Etherington, A.W.Everett, 2004; T.J.Nickels et al., 2007). Основным «рецептором» для NO в различных тканях является растворимая гуанилатциклаза (W.P.Arnold et al., 1977), активация которой приводит к повышению внутриклеточной концентрации цГМФ и соответствующих протеинкиназ (S.Andreopoulos, A.Papapetropoulos, 2000; K.A.Lucas et al., 2000). Значительная неоднородность эффектов NO, их видо- и тканеспецифичность предполагает наличие цГМФ-независимых механизмов реализации функций NO (S.Thomas, R.J.Robitaille, 2001; А.В.Яковлев и др., 2002; T.J.Nickels et al., 2007).
Монооксид углерода (угарный газ, СО) хорошо известен своими токсическими свойствами, однако, оказалось, что СО синтезируется эндогенно в микромолярных концентрациях в результате расщепления гема ферментом гемоксигеназой (M.D.Maines, 1997; 2004). Исследования функций СО как сигнальной молекулы в мозге, были вызваны тем, что активность гемоксигеназы в мозге приближается к таковой в тканях, разрушающих гем эритроцитов (например, в селезенке) (T.Ingi et al., 1996). Впоследствии по аналогии с NO-синтазой было предположено, что одна из функций гемоксигеназы - синтез СО, который активирует растворимую гуанилатциклазу с последующим увеличением уровня цГМФ в ткани (T.Morita, 1995). Однако, CO является слабым активатором растворимой гуанилатциклазы (J.R.Stone, M.A.Marletta, 1994; T.Ingi et al., 1996). По-видимому, в отличие от NO, который является сильным, но коротко живущим стимулятором синтеза цГМФ, СО за счет своей химической стабильности может оказывать хотя и слабые, но долговременные тонические эффекты (L.Wu, R. Wang, 2005). В отличие от кровеносных сосудов, где показаны кооперативные эффекты NO и CO, в некоторых областях мозга они оказывают антагонистическое действие (C.Thorup et al., 1999). Исследование клеточных механизмов регуляции активности гемоксигеназы показало, что синтез СО увеличивается в ответ на повышение цитозольной концентрации кальция, активацию протеинкиназы С и тирозинкиназ (D.Boehning et al., 2003). Показано, что СО также как NO является ретроградным мессенджером, участвующим в развитии и поддержании долговременной потенциации в гиппокампе (M.Zhuo et al., 1999). Исследований влияния СО на синаптическую передачу в системе мотонейрон-скелетная мышца не проводилось.
Предположения о физиологической роли сероводорода (H2S) возникли только в последнее время, что было связано с обнаружением высоких эндогенных концентраций сульфидов в крови и тканях мозга млекопитающих и других позвоночных животных (M.F.Warenycia et al., 1989; W.Zhao et al., 2001; J.E. Doeller et al., 2005). Эндогенно H2S синтезируется из L-цистеина пиридоксаль-5’-фосфат-зависимыми ферментами - цистатионин -синтазой и цистатионин -лиазой, экспрессирующимися практически во всех тканях (P.Kamoun, 2004). Также как NO и CO, H2S участвует в расслаблении гладкой мускулатуры (W. Zhao, R. Wang, 2002; B.Teague et al., 2002), физиологические концентрации этого газа усиливают активность НМДА рецепторов и облегчают индукцию долговременной потенциации в гиппокампе (K.Abe, H.Kimura, 1996). Исследования механизмов влияния сероводорода в нервной системе начались совсем недавно, а выявления его роли в периферической нервной системе не проводилось.
По-видимому, газы образуют единую систему посредников, легко проникающих через мембрану и регулирующих ферментативные реакции клетки. Данных о механизмах действия газов в нервной системе очень мало. Исследование внутриклеточных механизмов влияния NO и CO, H2S в системе мотонейрон – скелетная мышца позволит выявить основные мишени их действия при модуляции синаптических функций.
Цель и задачи исследования
Цель настоящего исследования – выяснение роли газообразных посредников - оксида азота (II), монооксида углерода и сероводорода в регуляции секреции медиатора из двигательного нервного окончания и анализ внутриклеточных механизмов действия газов на синаптическую передачу. В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:
-
Изучить эффекты экзогенных и эндогенных доноров NO, субстрата синтеза NO - L-аргинина и блокатора синтеза NO - L-NAME на вызванную секрецию медиатора и электрогенез двигательного нервного окончания лягушки.
-
Выявить роль системы гуанилатциклазы и аденилатциклазы в эффектах NO на нервно-мышечную передачу.
-
Проанализировать участие цГМФ-зависимых фосфодиэстераз в реализации эффектов NO на секрецию медиатора и потенциалзависимый калиевый ток нервной терминали.
-
Изучить эффекты экзогенного монооксида углерода и ингибитора гемоксигеназы на электрогенез нервного окончания и секрецию медиатора.
-
Выявить роль аденилат- и гуанилатциклазной систем в эффектах монооксида углерода на вызванное освобождение медиатора.
-
Проанализировать участие цГМФ-зависимых фосфодиэстераз в реализации эффектов СО на секрецию медиатора.
-
Определить локализацию фермента гемоксигеназы-2 в кожно-грудинной мышце лягушки с помощью иммуногистохимического метода.
-
Изучить эффекты сероводорода, его донора сероводорода - гидросульфида натрия и блокаторов ферментов синтеза газа на секрецию медиатора и ионные токи двигательного нервного окончания лягушки.
-
Проанализировать роль системы гуанилатциклазы/цГМФ и аденилатциклазы/цАМФ в эффектах сероводорода.
-
Выявить роль рианодиновых рецепторов внутриклеточных кальциевых депо в эффектах сероводорода.
-
Исследовать эффекты сероводорода и блокаторов ферментов синтеза газа на секрецию медиатора в нервно-мышечном синапсе мыши.
-
Определить экспрессию генов ферментов синтеза сероводорода в диафрагмальной мышце мыши методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией.
Положения, выносимые на защиту
1. Оксид азота (II) угнетает вызванную секрецию медиатора и активирует потенциалзависимые калиевые токи в двигательном нервном окончании лягушки. Гуанилатциклазная и аденилатциклазная внутриклеточные сигнальные системы опосредуют эффекты оксида азота через изменение активности цГМФ-стимулируемой цАМФ-специфичной фосфодиэстеразы (фосфодиэстеразы II).
2. Монооксид углерода вызывает усиление освобождения медиатора в нервно-мышечном синапсе лягушки без изменения электрогенеза двигательного нервного окончания. Эффекты монокосида углерода реализуются через повышение уровня цАМФ за счет активации синтеза аденилатциклазой и снижения деградации циклического нуклеотида посредством цГМФ-ингибируемой цАМФ-специфичной фосфодиэстеразы (фосфодиэстеразы III).
3. Сероводород усиливает спонтанную и вызванную секрецию медиатора в нервно-мышечном синапсе лягушки и мыши. Активация рианодиновых рецепторов эндоплазматического ретикулума опосредует пресинаптические эффекты сероводорода в нервно-мышечном синапсе лягушки.
4. Газообразные посредники – оксид азота (II), монооксид углерода и сероводород являются пресинаптическими модуляторами освобождения медиатора из двигательного нервного окончания и эндогенно синтезируются в области нервно-мышечного синапса.
Научная новизна
Впервые показано модулирующее влияние NO, СО и H2S на освобождение медиатора из двигательного нервного окончания холоднокровных животных. Проведен анализ внутриклеточных механизмов действия NO, СО и H2S на синаптическую передачу. Показано, что повышение внутриклеточной концентрации циклических нуклеотидов (цГМФ и цАМФ) снимает ингибиторное действие NO и облегчающее действие СО на секрецию ацетилхолина. Предполагается, что изменение концентрации цАМФ под действием NO или СО опосредуется цГМФ-стимулируемой или цГМФ-ингибируемой цАМФ-специфичными фосфодиэстеразами. Показано, что в основе эффектов сероводорода на секрецию медиатора лежит увеличение внутриклеточной концентрации Са2+ за счет активации рианодиновых рецепторов эндоплазматического ретикулума. Ингибирование ферментов синтеза СО, NO и H2S приводит к эффектам противоположным действию газов. Кроме того, впервые показана экспрессия фермента синтеза СО гемоксигеназы-2 в скелетных мышечных волокнах лягушки. Также выявлена экспрессия мРНК ферментов синтеза H2S - цистатионин –синтазы (CBS) и цистатионин –лиазы (CSE) в диафрагмальной мышце мыши. Указанные результаты предполагают возможность эндогенного синтеза СО, NO и H2S в области нервно-мышечного синапса.
Научно-практическая ценность
Полученные в работе данные расширяют представления о модуляции синаптической передачи эндогенными физиологически активными соединениями. Это, в частности, касается вопросов о влиянии нового класса соединений - газообразных посредников, имеющих уникальные свойства, отличающие их от классических медиаторов, на функционирование нервной системы. Впервые исследованы внутриклеточные механизмы действия оксида азота, монооксида углерода и сероводорода на синаптическую функцию. Полученные экспериментальные данные могут служить основой для понимания возможных взаимодействий газообразных посредников с другими медиаторными и гормональными системами, так впервые показано, что активация как аденилат- так и гуанилатциклазных систем опосредуют эффекты NO и CO на освобождение медиатора. Научную ценность представляют данные об участии рианодиновых рецепторов эндоплазматического ретикулума в эффектах сероводорода. Особенности действия газов позволяют предположить их важную роль в формировании кратковременных и долговременных изменений в синаптических структурах, в процессах памяти и обучения. Поэтому выяснение молекулярных систем синтеза, инактивации и клеточных мишеней действия газообразных посредников позволит вести поиск и разработку фармакологических агентов, которые могут быть использованы для лечения и профилактики заболеваний, сопровождающихся нарушением синаптической функции, а также для целенаправленного синтеза новых фармакологических агентов, модулирующих работу ионных каналов нервного окончания и синаптическую передачу. Поскольку основные закономерности функционирования нервно-мышечного синапса идентичны процессам, происходящим в синапсах центральной нервной системы, результаты работы могут быть использованы также для объяснения механизмов регуляции процессов секреции нейромедиаторов и гормонов эндогенными газообразными посредниками в секреторных, нейросекреторных клетках и нейронах. Результаты исследования представляют практическую ценность для физиологов, биофизиков, биохимиков, фармакологов и нейрохимиков. Полученные данные используются при чтении лекций на кафедре физиологии человека и животных Казанского государственного университета, Казанского государственного медицинского университета, Татарского государственного гуманитарно-педагогического университета.
Работа выполнена при финансовой поддержке грантов РФФИ (02-04-48822, 03-04-96252, 05-04-48428, 06-04-49125); «Ведущая научная школа» (00-15-97763, НШ 1383.2003.4 НШ-4520.2006.4, НШ-3368.2008.4); АН РТ (03.-3.10.-222 (2003-2005).
Апробация работы
Основные результаты диссертационной работы доложены на XVIII, XIX, XX Съездах физиологического общества им. И.П. Павлова (Казань, 2001, Екатеринбург, 2004, Москва 2007), Всероссийском научном симпозиуме «Растущий организм: адаптация к физической и умственной нагрузке» (Казань, 2002, Казань 2006), Международной школе-конференции «Фармакология синаптической передачи в нервной системе» (Киев, 2002), IV, V, VI Съездах физиологов Сибири (Новосибирск, 2002, Томск, 2005, Барнаул, 2008), Международной конференции «Функциональная роль монооксида азота и пуринов» (Минск, 2001), Международной конференции по физиологии мышц и мышечной деятельности (Москва, 2003, 2005, 2006, 2007, 2008), Международном Симпозиуме «Внутриклеточная регуляция дифференциации и пластичности нейрона» (Москва, 2003), Международной конференции «Медиаторы в формировании нейрональных сетей» (Ля Сиота, Франция, 2003, 2004), I Съезде физиологов СНГ (Сочи, Дагомыс, 2005), XII Международном совещании и IV Школе по эволюционной физиологии (Санкт-Петербург, 2006), Всероссийской научной конференции «Нейрохимия: фундаментальные и прикладные аспекты» (Москва, 2005), научной конференции «Нейроспецифические метаболиты и энзимологические основы деятельности ЦНС» (Пенза, 2006), 1 международном междисциплинарном Конгрессе "Нейронаука для медицины и психологии" (Судак, 2006), VIII региональной конференции международного общества нейробиологии беспозвоночных «Простые нервные системы» (Казань, 2006), Международной научной конференции «Свободные радикалы, антиоксиданты и старение» (Астрахань, 2006), Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2003, 2005, 2007), Международном симпозиуме “Биологическая подвижность” (Пущино, 2004, 2006, 2008), Европейском форуме по нейронаукам FENS (Женева, Швейцария, 2008).
По теме диссертации опубликовано 57 работ.
Структура и объем диссертации
Диссертация объемом 251 страница состоит из введения, обзора литературы, изложения объектов и методов исследования, 3 глав результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Список цитируемой литературы включает 416 названий, из них 31 отечественных и 385 иностранных авторов. Диссертация содержит 48 рисунков и 4 таблицы.
Монооксид углерода
Еще в середине 19 века Клод Бернар обнаружил, что СО обратимо связывается с гемоглобином, что вызывает асфиксию [55]. Столетие спустя было показано, что СО образуется в организме in vivo при деградации гемоглобина [326]. Впоследствии были обнаружены ферменты, ответственные за распад гема и синтез СО. В 1974 г. была идентифицирована индуцибельная форма гемоксигеназы (гемоксигеназа-1) и в 1986 г. -конститутивная форма фермента (гемоксигеназа-2) [392]. Скорость образования СО в организме человека составляет 16,4 мкМ/ч и ежедневный синтез СО достигает 12 мл (500 мкМ) [91]. Физиологические концентрации СО в тканях, исходя из содержания карбоксигемоглобина (СОНЬ) (1-2%), оценивают в среднем в наномолярных пределах [283]. Однако, надо учитывать, что СО, образующийся в цитозоле, может связываться в клетках до выхода в кровеносное русло, где формируется СОНЬ [392]. В обонятельной луковице эндогенный уровень СО оценивают в пределах 10-30 мкМ[172]. В 1991 г. возникло первое предположение о физиологическом значении синтезирующегося СО [238].
Исследования функций СО как сигнальной молекулы, генерирующей цГМФ в мозге, были вызваны открытием, что активность гемоксигеназы в мозге приближается к таковой в печени и селезенке, где гемоксигеназа деградирует гем гемоглобина [172]. Первые исследования, основанные на применении ингибиторов гемоксигеназы и гистологической локализации фермента, обнаружили роль СО как эндогенного посредника в нервной системе [365]. В дальнейшем было показано, что СО вовлечен в релаксацию гладких мышц желудочно-кишечного тракта, дыхательных путей и сердечно-сосудистой системы [392]. СО — это двухатомный оксид углерода. При температуре выше -190С СО представляет собой газ без цвета и без запаха. Удельный все СО составляет 0.967 относительно воздуха и плотность - 1.25 г/л при стандартной температуре и давлении. СО - химически стабильная молекула благодаря его тройной связи. Химическое восстановление СО требует высоких температур (более 100С). Растворимость в воде низкая - 354 мл/дл при стандартной температуре и давлении [38]. СО не взаимодействует с водой. Даже для молекулярного кислорода скорость реакции с СО очень низкая и требует высокой энергии активации (213 кДж/моль). Теоретически СО может вовлекаться в окислительно-восстановительные реакции [38]. Свободный СО не реагирует с восстановителями, включая водород [392]. Карбонилы металлов относительно стабильны до тех пор, пока СО не заместится, например, молекулярным кислородом Ог. Интоксикации СО могут быть смертельными и его называют «безмолвным убийцей». Небольшое увеличение уровня СО необязательно ведет к интоксикации человека, это зависит от функционального статуса дыхательной системы, буферной способности, т.е уровня карбоксигемоглобина А (СОНЬ), парциального давления СО и кислорода.
Увеличение уровня СО ведет к ускорению связывания СО с гемоглобином и образованию СОНЬ. При этом функция переноса кислорода гемоглобином значительно снижается, так как сродство СО к гемоглобину в 210-250 раз больше, чем к кислороду. Уменьшение содержания кислорода в артериях и тканях вызывает гипоксию [335]. Мозг и сердце - ткани, наиболее подверженные к СО-вызванной острой гипоксии вследствие их высокого потребления кислорода. Неврологические проявления выражаются в головной боли, головокружении, слабости, тошноте, рвоте, дезориентации, визуальным нарушениям и ведут к коме. Без немедленного лечения неврологические нарушения могут быть смертельными. Острые или хронические интоксикации СО развивающегося плода могут увеличивать риск развития нарушения ЦНС с аномалиями зрительного восприятия, двигательной активности, обучения, уровня внимания. Хроническая экспозиция СО взрослых людей или экспериментальных животных вызывают сердечно-сосудистые заболевания, включая атеросклероз и кардиальную гипертрофию [376]. Связывание СО с цитохромом Р450,, цитохром с оксидазой, каталазой, миоглобином может оказывать вклад в токсические эффекты СО [283]. Однако, надо отметить, что живые клетки устойчивы к СО в концентрации 0.01% (100 ррт) в течение нескольких часов [276]. Постоянная экспозиция 500 ррт СО в течение 2 лет не оказывала значительного повреждающего действия на грызунов [276]. Субстратом для образования монооксида углерода является гем (Fe-протопорфирин IX, гемин) - жизненно важная молекула, участвующая в окислительных реакциях и процессах переноса электронов и доставляющая кислород к клеткам. Гем представляет собой тетрапиррол с 4 пиррольными кольцами (Рис.1), объединенными мостиками из углеводородных атомов [232]. Конъюгация тетрапиррольного макроцикла придает цвет, пространственные и флуоресцентные характеристики порфиринам. Молекулы порфирина не могут связывать кислород или участвовать в фермент-зависимых окислительных реакциях и процессах переноса электронов, данные свойства макроциклические молекулы приобретают при связывании с ионами металлов. С порфириновым кольцом могут формировать комплекс ряд металлов: Fe, Mg, Си, Zn, Sn, Cd, Co, Ag. Железосодержащие комплексы служат простетической группой цитохромов и глобинов, а Mg-порфириновый комплекс является фоторецептором для фотосинтеза [232]. В настоящее время известно, что гем синтезируется во всех ядерных клетках млекопитающих с использованием глицина и сукцинил СоА в качестве предшественников. В синтезе гема принимают участие 8 ферментов, реакция синтеза начинается в митохондриях, продолжается в цитозоле и заканчивается в митохондриях, вставкой атома железа ферментом феррохелатазой с образованием Fe протопорфирина IX. Железо вводится в молекулу гема феррохелатазой [232]. Кругооборот гема очень быстрый.
Например, в культуре мозжечковых гранулярных нейронов 17% всего гема используется для синтеза от 1 до 5 мкМ СО в течение 5 ч [172]. Физиологический уровень свободного гема в нормальных клетках менее 1 мкМ [310]. Внеклеточный гем транспортируется в клетку с помощью специального транспортера [232]. Благодаря его липофильной природе гем легко перемещается среди различных органелл [172] и связывается с множеством клеточных мембран и органелл, включая липидные бислои, митохондрии, цитоскелет, ядро, внутриклеточные энзимы [267, 308]. Свободный гем в высоких концентрациях катализирует окислительные реакции, генерирующие активные формы кислорода [176]. Патологически высокий уровень гема коррелирует со многими заболеваниями, такими как заболевания почек, некроз скелетных мышц или дестабилизация внутриклеточных гем-содержащих белков (цитохромов) при ишемии-реперфузии и нефротоксических почечных повреждениях [392]. Когда уровень свободного гема повышается при физиологических условиях, его цитотоксическая роль доминирует над его конститутивной ролью в формировании гем-содержащих белков. Активность гемоксигеназы в покое необходима для устранения прооксидантного гема [176]. Доступность и источники гема для синтеза СО различны. Большинство клеток млекопитающих содержат пул свободного гема для синтеза гем-содержащих белков и СО [286]. Во-первых, это вновь синтезированный «свободный» гем, который легко деградируется системой гемоксигеназы, и
Сероводород, структура, физико-химические свойства
Сероводород (H2S) - бесцветный газ с сильным запахом. Сероводород растворим в воде, при нормальном давлении и 20С его концентрация в водных растворах соответствует 0,098 М. Раствор сероводорода в воде (сероводородная вода) является очень слабой двухосновной кислотой. В водных растворах при рН=7,4 около одной трети H2S не подвергается диссоциации и две трети диссоциируют до ЬҐ и HS" (гидросульфидного аниона), который в последствии может разложиться до ЬҐ и S2". Н28 - ЬҐ + HS" - 2H " + S2" Однако, последняя реакция происходит только при высоком рН, поэтому концентрация S2" in vivo незначительна [23, 32, 219]. В окислительно-восстановительном отношении H2S — сильный восстановитель. В реакции с окислителями его молекула теряет 2, 6 и 8 электронов [23]. Гидросульфид натрия (NaHS) обычно используют как донор H2S, так как в водной среде он диссоциирует до Na + и HS", далее HS" взаимодействует с Н и формирует недиссоциированный H2S [219]. Показано, что NaHS количественно является таким же эффективным, как и раствор, полученный при перфузии газообразным сероводородом [403]. Показано;, что при рН-7.4 и температуре 20 раствор сероводорода содержит около 30-33% газа (H2S) и 67-70% HS" [32, 105]. Продуктами окисления сероводорода могут быть- элементарная сера (S"), оксид серы (S02) и сульфаты [23]. Подобно NO и СО, H2S липофилен и свободно проникает через; плазматическую мембрану, хотя его; проницаемость ниже; чем для NO и СО в? связи с частичной диссоциацией [219]: Эндогенно H2S может синтезироваться двумя? путями.
Первый ферментативный путь синтеза H2S из Іі-цистеина двумя1 цитозольными пиридоксаль-5 -фосфат-зависимыми ферментами - цистатионин: Р синтазой (GBS) и цистатионину-лиазой (CSE) [134, 292, 377]. Второй неферментативный путь . синтеза H2S из глюкозы в присутствии элементарной серы [62, 318]. Серосодержащие аминокислоты являются главнымиисточникамиэндогенного синтеза сероводорода. . Серосодержащие аминокислоты — это основные, предшественники эндогенного синтеза H2S. Они являются важным фактором для клеточной стабильности; их антиоксидантные и нейтрализующие свойства очень важны в метаболизме клетки. Так как серосодержащие аминокислоты играют важную роль в регуляции гомеостаза, то изменение их метаболизма может привести к различным нарушениям в клетке, в том числе к изменению синтеза H2S. Метаболизм этих аминокислот в клетках млекопитающих регулируется через баланс синтеза и утилизации клеточного гомоцистеина и цистеина (Рис. 3) [134]. Основным субстратом эндогенного синтеза H2S является L-цистеин, серосодержащая аминокислота. Она может поступать из пищи, синтезироваться из L-метионина в процессе транссульфирования, где промежуточным звеном является гомоцистеин (Нсу), или образовываться в результате распада белков [219]. Рассмотрим схему синтеза цистеина. Гомоцистеин образуется из метионина, который с помощью S-аденозилметионин синтазы трансформируется до S-аденозилметионина (SAM), являющегося источником метальных групп для различных реакций метилирования. Далее из S-аденозилметионина образуется S-аденозилгомоцистеин (SAH), который впоследствии гидролизуется SAH-гидролазой до аденозина и гомоцистеина (Нсу). Гомоцистеин может реметилироваться до метионина с помощью метионин синтазы (MS), которая использует витамин В12, как кофактор и 5-метилтетрагидрофолат (5-CH3THF) как донор метильной группы. Кроме того, в пути транссульфирования гомоцистеин может взаимодействовать с серином, образуя цистатионин. Эта реакция катализируется CBS, активность которой регулируется S-аденозилметионином [34, 128].
Далее цистатионин в присутствии цистатионин у-лиазы (CSE) образует цистеин [219]. Другой источник цистеина - это поступление его с пищей и образование при распаде белков. Во внеклеточных жидкостях обнаружен димер цистеина в виде цистина, который в клетке быстро переходит в моносульфгидрильную форму [374]. В мембране клеток существует специфическая транспортная система, которая осуществляет перенос цистеина и цистина. Цистеин транспортируется аланин, серии и цистеин-специфичной системой (ASC) [220]. Это На+-зависимый транспортер, который является специфичным, для нейтральных аминокислот с боковыми цепями средней и короткой длины [134] и осуществляет перенос как внутрь, так и извне клетки и подвергается трансстимулированию [220]. Поэтому внутриклеточные концентрации цистеина зависят от внутриклеточного и внеклеточного уровня не только цистеина, но и других аминокислот. Повышение внеклеточного уровня цистеина приведет к увеличению его концентрации внутри клетки. При этом высокие внеклеточные концентрации аланина и серина приведут к избирательному ингибированию входа цистеина (z/ис-ингибирование) и будут стимулировать его выход из клетки (транс-стимулирование).
Другая транспортная система для цистеина - система Хс", регулируется вне- и внутриклеточной концентрацией глутамата и в нормальных условиях не очень активна. Внутриклеточные концентрации цистеина относительно низки, так как обычно он хранится в виде глутатиона. Глутатион освобождает цистеин непрерывно, чтобы постоянно поддерживать его внутриклеточный уровень [134]. Некоторые патологические изменения могут изменить скорость этого процесса: оксидативный стресс, истощающий запасы глутатиона, вызывает снижение уровня цистеина и его предшественников. Взаимное преобразование глутатиона и цистеина представляет собой у-глутамиловый цикл (Рис.3). Внутриклеточный цистеин используется для синтеза белков, таурина или синтез H2S [198]. Эти реакции регулируются несколькими факторами, включая S-аденозилметионин, NO, Са/кальмодулин-зависимой системой, гормонами [128, 181]. CBS и CSE очень важны для метаболизма серосодержащих аминокислот, а также для продукции H2S, аммония и пирувата из L-цистеина. Экспрессия ферментов CBS и CSE является тканеспецифичной. CBS, являющийся основным ферментом синтеза H2S в мозге, также экспрессируется в печени и почках [165, 246, 377]. Второй фермент, катализирующий синтез H2S - CSE, который в основном экспрессируется в почках, печени, сердечно-сосудистой системе, гладких мышцах [32, 221; 361, 397, 404]. Цистатионин Р-синтаза (CBS). CBS катализирует пиродоксаль-5-фосфат-зависимую Р-реакцию замены, в которой тиоловая группа L-гомоцистеина заменяет гидроксильную группу L-серина. CBS человека имеет сложную структуру и механизм регуляции [134]. Аллостерическим активатором CBS является S-аденозилметионин, который повышает активность CBS приблизительно в 3 раза, связываясь с С-концом регуляторного домена [127, 128]. CBS высших эукариот содержит уникальный гемовый остаток, назначение которого пока не известно, но он отсутствует в CBS дрожжей [197] и простейших Trypanosoma cruzi [376]. GSH - глутатион; GSHS - глутатион синтетаза; GCS - у-глутамилцистеин синтетаза, SAH - S-аденозилгомоцистеин, SAM - S-аденозилметионин, MS -метионин-синтаза, 5-CH3THF - 5-метилтетрагидрофолат, 5,10-CH2THF -5,10-метилентетрагидрофолат, MTHFR - метилентетрагидрофолат редуктаза, CBS - цистатионин (3-синтаза, CSE - цистатионин у-лиаза, Нсу -гомоцистеин. N0 и CO связываются с разной степенью аффинности с гемовым доменом фермента и модулируют его активность [181]. При этом NO связывается с CBS в 200 раз слабее, чем СО и в физиологических концентрациях не ингибирует фермент. СО имеет высокую аффинность к ферменту, и, вероятно, CBS может быть клеточной мишенью действия со. Ген CBS у человека состоит из 23 экзонов, расположенных в области от 42 до 209 пары азотистых оснований, полипептид CBS закодирован экзонами 1-14 и 16 [197].
Экспрессия гена, кодирующего CBS, тканеспецифична и регулируется через механизм, чувствительный к окислительно-восстановительному потенциалу, что связано с пролиферационным статусом клетки [225]. CBS - полипептид массой 63 кДа содержит 3 домена: гем-связывающий домен, каталитический центр и регуляторный домен, включающий N-конец из 70, центральную часть из 340 и С-конец из 140 остатков [225]. Каталитическая форма CBS представляет собой тетрамерный протеин, который зависит от пиродоксальфосфата. CBS. Преимущественно локализован в цитозоле. Km CBS для L-цистеина составляет 36 мМ, намного больше, чем для серина (2-8 мМ) и L-гомоцистенина (0.1-9 мМ) [108]. Большое количество мутаций в различных областях CBS было найдено у больных с гомоцистеинурией, это заболевание передается по наследству и связано с высоким уровнем в плазме различных аминокислот, например, L-гомоцистеина, и с пониженной активностью CBS, который катализирует переход гомоцистеина и серина в цистатионин [197]. Соответственно при гомоцистеинурии наблюдается повышение концентраций гомоцистатионина и метионина в плазме и моче и снижение уровня цистатионина и цистеина. Клинический фенотип пациентов с гомоцистеинурией включает умственную отсталость, искажение хрусталика, мышечные расстройства и сосудистые заболевания [260].
Иммуногистохимический метод
Для выявления клеточной локализации гемоксигеназы-2 проводили иммуногистохимичнеское окрашивание непрямым иммунопероксидазным методом [174]. Обездвиженных контрольных (п=3) и экспериментальных (п=3) лягушек перфузировали раствором фосфатного буфера (PBS) с последующим введением 4% раствора пара-форм альдегида. Затем выделяли кожно-грудинную мышцу и выдерживали препарат в 30% растворе сахарозы (для криопротекции). На фиксированных поперечных криостатных срезах толщиной 10 мкМ проводили иммуногистохимическую реакцию. Для выявления гемоксигеназы-2 использовали поликлональные антитела к гемоксигеназе-2 в разведении 1:500 (OSA-200 StressGen Biotechnologies, Канада). Затем проводили иммунную реакцию с первичными антителами с помощью стрептавидин-биотинового комплекса (Elite ABC Kit; Vector Laboratories). Иммунопреципитат визуализировали с помощью диаминбензидина (DAB Substrate Kit for Peroxidase, Vector Laboratories, США). Для контроля проводили окрашивание без первичных или вторичных антител (отрицательный контроль). Готовые срезы изучали под световым микроскопом. Фотографии сделаны при помощи цифровой камеры Kodak DC 120 Digital Access1. Метод полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ ПЦР) позволяет выявить экспрессию мРНК исследуемых белков в различных тканях. Метод ПЦР основан на высокоспецифичной амплификации (увеличения количества) нуклеотидных последовательностей в условиях in vitro, катализируемое ферментом ДНК-полимеразой.
Мишенью ПЦР являются молекулы ДНК. Молекулы мРНК могут быть выявлены в ПЦР после проведения реакции обратной транскрипции и синтеза одноцепочечной кДНК (клонированной ДНК). Выделение мРНК. Образец исследуемой ткани (диафрагма мыши) массой 100 мг замораживали в жидком азоте и гомогенизировали. Полученный гомогенат, объемом 50 мкл, вносили в полипропиленовые пробирки, содержащие лизирующий раствор следующего состава: 7.5М гуанидинизотиоцианат; 50% фенол, уравновешенный Трис-HCl буфером (рН=7.0); 1% Р-меркаптоэтанол; 0.5 мкг/мл дрожжевой тРНК [89]. Полученную смесь тщательно перемешивали на микроцентрифуге CV-1500 в течение 20 сек, после чего инкубировали в течение 10 мин при комнатной температуре. Затем вносили 100 мкл хлороформа, перемешивали и центрифугировали в течение 5 мин при угловой скорости 13 тыс. об/мин. Полученный супернатант переносили в чистые полипропиленовые пробирки, содержащие 300 мкл охлажденного изопропилового спирта. Смесь встряхивали на микроцентрифуге в течение 20 сек и инкубировали при температуре -20С в течение 1 ч. После этого, образцы центрифугировали 15 мин при угловой скорости 13 тыс. об/мин. Надосадочную жидкость удаляли. Полученный осадок последовательно отмывали 1 мл этилового спирта и 200 мкл 10% ацетона, осаждая РНК на центрифуге (5 мин, 13 тыс. об/мин). Осадок высушивали при температуре 65С в течение 10 мин и растворяли в 30 мкл деионизованной воды. Хранение выделенных препаратов РНК проводили при температуре -20С. Реакция обратной транскрипции..
Процесс обратной транскрипции, в результате которой на РНК-матрице синтезируют одноцепочечную цепь ДНК, при необходимости, с достройкой второй цепи, позволяет от нестабильных молекул РНК перейти к более стабильным молекулам ДНК и амплифицировать их с помощью ПЦР до количеств необходимых для детекции. ОТ-ПЦР-амплификация позволяет использовать очень малые количества исходной РНК. Реакцию обратной транскрипции проводили в смеси следующего состава: .0.25 мМ дезоксинуклеотидтрифосфаты (дНТФ), буфер для M-MuLV-обратной транскриптазы (50 мМ Трис-НС1), 3 мМ MgCl2, 75 мМ КС1, 5 мМ дитиотреитол, 2 единицы ингибитора РНКаз (Хеликон, Россия), 1 единица M-MuLV-обратной транскриптазы (СибЭнзим, Россия), олигонуклеотиды (dT)i5 (500 нг). В реакционную смесь объемом 20 мкл вносили 5 мкл препарата выделенной РНК. Реакцию проводили при 37С в течение 1 ч. Реакция ПЦР. ПЦР проводили в реакционной смеси следующего состава: дНТФ (0.2 мМ), буфер для Taq ДНК-полимеразы (ТрисНСІ, 60 мМ, MgCl2, 1.5 мМ, КС1, 25 мМ, Р-меркаптоэтанол, 5 мМ, Тритон Х-100, 0.05%), 1 единица Taq ДНК-полимеразы (СибЭнзим, Россия), олигонуклеотидные праймеры (1 мкМ). В реакционную смесь объемом 20 мкл вносили 5 мкл препарата кДНК. Амплификацию ДНК проводили с использованием системы «Терцик МС2» (ДНК-Технология, Россия) в следующем температурном режиме: 1 цикл 94С - 5 мин; 42 цикла: 94С - 1 мин, 60С -1 мин; 72С -1 мин; 1 цикл: 72С - 7 мин; хранение 4С. Ключевую роль в образовании продуктов реакции амплификации играют праймеры - искусственно синтезированные олигонуклеотиды, имеющие, как правило, размер от 15 до 30 п.о., идентичные соответствующим участкам ДНК-мишени. Для создания стартовых блоков в заданных участках ДНК используют два праймера. Праймеры комплементарны последовательностям ДНК на левой и правой границах специфического фрагмента и ориентированы таким образом, что достраивание новой цепи ДНК протекает только между ними.
Для реакции ПЦР нами были сконструированы ген-специфичные праймеры с использованием информации о нуклеотидной последовательности мРНК CSE и CBS, содержащейся в базе данных GenBank (локусы NM145953 и NM_178224). Разработанные пары праймеров получили название CSEm-f и CSEm-r, CBSm-f и CBSm-r. Данные праймеры являются гомологами олигонуклеотидов, описанных для выявления мРНК CSE и CBS у крысы Rattus norvegicus [404], и модифицированы нами с учетом нуклеотидных последовательностей мРНК, выявленных для мыши [173]. Нуклеотидные последовательности праймеров приведены ниже: CSEm-f- 5 -aagcagtggctgcgttg-3 , CSEm-r - 5 gtggtgtaatcgctgcc-3 , CBSm-f -5 -agccaacttctggcaac-3 , CBSm-r -5 -caccagcatatccagcttc-3 . Ожидаемый размер амплифицируемых фрагментов ДНК, ограниченных праймерами CSEm-f и CSEm-r, составил 232 пар оснований (п.о.), а для фрагментов ДНК, ограниченных праймерами CBSm-f и CBSm-r - 325 п.о. Вычисление оптимальных термодинамических показателей было проведено с помощью компьютерной программы «Oligo 6». На Рис. 7 и 8 представлены фрагменты мРНК CSE и CBS, амплифицируемые в ОТ ПЦР. Для проверки специфичности реакции полученные фрагменты кДНК обрабатывали рестриктазой НаеШ (СибЭнзим, Россия) в течение 2 часов при температуре 37С. Рестриктаза НаеШ разрезает полученные фрагменты в определенном месте (Рис.7 и 8, заштрихованный участок) с получением фрагментов известных размеров. Детекцию результатов проводили методом горизонтального электрофореза в 2% агарозном геле, содержащим бромистый этидий (0,5
Исследование роли протеинкиназы А в эффектах N0 на ионные токи нервного окончания и вызванную секрецию медиатора
цАМФ-зависимая протеинкиназа или протеинкиназа А опосредует большинство биологических эффектов цАМФ во всех клетках эукариот и является ключевым ферментом аденилатциклазного пути передачи сигнала. Добавление в перфузируемый раствор селективного ингибитора протеинкиназы А - Н-89 в концентрации 10 мкМ не изменяло параметров ответа нервного окончания в течение всего эксперимента, но снижало вызванную секрецию медиатора. Средняя амплитуда ТКП уже на 10 мин снижалась до 85.1±4.1% и максимальный эффект действия блокатора наступал на 35-40 мин эксперимента: средняя амплитуда ТКП падала до 58.7±2.6% (п=5; р 0.05) и квантовый состав ТКП - до 68.6±6.1% (п=5; р 0.05) относительно контроля (Рис.21).
На фоне действия Н-89 донор NO - SNAP в концентрации 250 мкМ не изменял амплитуды 3-ей фазы ответа нервного окончания. Изменение квантового состава ТКП при действии ингибитора протеинкиназы А Н-89 (10 мкМ), донора NO SNAP (250 мкМ) в контрольных условиях и SNAP на фоне Н-89. В условиях сниженной активности протеинкиназы A SNAP уменьшал среднюю амплитуду ТКП до 41.0±6.8%, а квантовый состав ТКП снижался до 39.1±5.5% (п=6; р 0.05) относительно исходной величины (Рис. 21). Таким образом, что активация потенциалзависимого К+-тока при действии NO связана со снижением активности протеинкиназы А, которая также частично опосредует эффекты NO на вызванную секрецию медиатора. NO является газообразным посредником, участвующим в регуляции целого ряда функций: передачи сигналов в нервной системе, регуляции кровяного давления, в иммунном цитохимическом ответе, в регуляции сердечного ритма и т.д. [22, 26, 28, 225, 314]. Показано, что в нервной системе NO не только выполняет роль вторичного посредника в процессах внутриклеточной сигнализации, но функционально соединяет постсинаптический и пресинаптический нейроны [56, 70, 332]. Ряд эффектов N0 связан с его влиянием на центральные и периферические синапсы, где он может оказывать как ингибирующее, так и активирующее действие [56, 122]. В двигательных нервных окончаниях 124, 214, 350]. В тоже время NO усиливает сокращение диафрагмальной мышцы крысы, вызванное раздражением диафрагмального нерва, действуя на пресинаптическом уровне [39], а также усиливает неквантовое освобождение ацетилхолина [261] и квантовую секрецию медиатора из двигательного нервного окончания крысы в условиях ингибирования аденозиновых АІ-рецептров [270]. В нашем исследовании мы использовали различные фармакологические агенты: экзогенные (нитропруссид натрия - SNP, S— nitroso-N-acetylpenicillamine - SNAP) и эндогенный (гидроксиламин) доноры NO. SNP, SNAP и гидроксиламин приводили к снижению вызванной секреции медиатора из нервной терминали.
Максимальный эффект доноров наблюдался к 30-40 мин эксперимента. С помощью NO селективного электрода показано, что 1 мМ SNAP генерирует примерно 0.8 мкМ NO [161]. Можно предположить, что 250 мкМ SNAP, использованного в наших экспериментах выделяют такое же количество NO, что и SNP в концентрации 100 мкМ. Гидроксиламин -мембранопроникающее каталазо-зависимое соединение, наиболее точно имитирующее увеличение внутриклеточного NO [5, 314]. NO-синтаза кроме L-цитруллина и NO образует (с низким выходом) гидроксиламин (NH2-OH). Гидроксиламин, покидая место синтеза, проходит через мембрану клетки и в кровеносном русле реагирует с железосодержащими белками, преимущественно с гемоглобином (НЬ) и миоглобином (Mb). В присутствии перекиси водорода соединение Mb-NO и Hb-NO окисляются с выделением N0 [194]. Кроме того, гидроксиламин может влиять на активность клеточных каталаз и цитохромов митохондрий, стимулируя образование NO в цитозоле [314]. Наши результаты согласуются с ранее полученными данными, в которых доноры NO оказывали выраженные пресинаптическое действие, угнетая выброс квантов медиатора из нервной терминали без изменения размера секретируемых везикул [214] и амплитудно-временных характеристик миниатюрных ТКП [12, 350]. Процесс освобождения медиатора из двигательного нервного окончания запускается распространяющимся потенциалом действия, амплитуда и длительность которого связаны с протеканием ионных токов через мембрану нервной терминали. На различных препаратах показано, что NO оказывает как активирующее, так ингибирующее влияние на потенциалзависимые и кальций-активируемые К+-каналы [64, 161, 177, 206]. В наших исследованиях, а также в предыдущих работах нашей лаборатории [12] было показано, что при действии NO происходит увеличение потенциалзависимых К+- и уменьшение Са2+-активируемых К+-токов нервного окончания.
Рост потенциалзависимого К+-тока уменьшает длительность потенциала действия, вход ионов Са + в нервную терминаль и снижает секрецию медиатора. Однако, эффекты NO могут быть связаны и с непосредственным угнетающим влиянием на Са +-токи нервного окончания. На это может косвенно указывать снижение амплитуды Са2+-активируемых К+-токов двигательного нервного окончания в условиях блокирования потенциалзависимых калиевых каналов [12]. Показано, что NO в разных тканях может как активировать, так и ингибировать кальциевые каналы цГМФ-зависимым или цГМФ-независимым образом. В нейронах коры головного мозга мыши NO усиливает кальциевый ток через 94 L- и Р-тип каналов, ингибируя функцию N-типа Са -каналов [156], усиливает потенциалзависимые кальциевые токи в скелетных мышцах 9-І ракообразных [121], активирует N-тип Са -каналов в ганглиозных клетках сетчатки [163]. С другой стороны N0 подавляет кальциевые токи в гладкомышечных клетках базиллярной артерии [349] и кардиомиоцитах морской свинки, снижает потенциалзависимые Са2+-токи в нейронах задних корешках спинного мозга [190]. В двигательной нервной терминали лягушки N-тип Са2+-каналов располагается вблизи активных зон [13] и регулирует секрецию медиатора из нервного окончания лягушки [2, 11, 247, 2501]. В двигательной нервной терминали лягушки было показано снижение локальной концентрации 94 ионов Са при действии NO без изменения его общей концентрации, что также может указывать на подавление входа ионов кальция [350].
