Содержание к диссертации
Введение
2 Обзор литературы 12
2.1 Особенности газообразных посредники как регуляторов физиологических функций 12
2.2 Сероводород, структура, физико-химические свойства 13
2.3 Синтез сероводорода 14
2.3.1 Метаболизм серосодержащих аминокислот 14
2.3.2 Молекулярная биология цистатионин Р-синтазы и цистатионин у-лиазы 17
2.3.3 Ферментативный синтез сероводорода 20
2.3.4 Неферментативный синтез сероводорода 22
2.3.5 Катаболизм сероводорода 23
2.4 Токсичные эффекты сероводорода 25
2.5 Физиологическая роль сероводорода и мишени его действия 26
2.5.1 Эффекты сероводорода в нервной системе 26
2.5.2 Сероводород в гладкой мышце 32
2.6 Взаимодействие газообразных посредников - сероводорода, оксида азота (И) и монооксида углерода 34
2.7 Механизмы регуляции освобождения медиатора из двигательного нервного окончания 36
2.7.1 Электрогенез нервного окончания и освобождение медиатора 36
2.7.2 Временной ход секреции медиатора 39
2.7.3 Роль циклических нуклеотидов в регуляции секреции медиатора 42
2.7.4 Роль рианодиновых рецепторов внутриклеточных Са2+ - депо в регуляции секреции медиатора 47
3 Объект и методы исследования 51
3.1 Объект исследования 51
3.2 Растворы и фармакологические вещества 52
3.3 Электро физиологический метод 54
3.4 Проведение обратно-транскриптазной полимеразной цепной реакции 59
4 Результаты исследования 62
4.1 Влияние газообразного сероводорода и, гидросульфида натрия на вызванную секрецию медиатора и электрогенез двигательного нервного окончания лягушки в условиях низкого содержания ионов кальция в растворе 62
4.2 Влияние гидросульфида натрия на кальций- активируемые калиевые токи нервного окончания 64
4.3 Влияния газообразного сероводорода и его донора -гидросульфида натрия на кинетику секреции медиатора 65
4.4 Влияние гидросульфида натрия на развитие облегчения и динамику выходящих К+-токов при ритмической стимуляции 67
4.5 Влияние гидросульфида натрия на спонтанные и вызванные постсинаптические сигналы при нормальной концентрации ионов Са2+ в растворе 69
4.6 Исследование роли аденилатциклазной системы в эффектах сероводорода на секрецию медиатора 72
4.7 Исследование роли гуанилатциклазной системы в эффектах сероводорода на секрецию медиатора и ионные токи нервного-окончания 75
4.8 Исследование роли рианодиновых рецепторов*?4-внутриклеточных Са -депо в эффектах сероводорода насекрецию медиатора 77
4.9 Влияние субстрата и блокаторов синтеза сероводорода на секрецию медиатора в двигательном нервном окончании лягушки 79
4.10 Влияние гидросульфида натрия на спонтанную и вызванную секрецию медиатора в нервно-мышечном синапсе мыши 82
4.11 Влияние блокаторов синтеза сероводорода на секрецию медиатора из двигательного нервного окончания мыши 84
4.12 Выявление ферментов, генерирующих сероводород, в скелетной мышце мыши методом обратно-транскриптазной полимеразной цепной реакцией 85
5 Обсуждение результатов исследования 90
5.1 Пресинаптическое влияние сероводорода в нервно-мышечном синапсе лягушки и мыши 90
5.2 Эффекты сероводорода на секрецию медиатора и пресинаптический ответ нервного окончания в процессе ритмической активности синапса 92
5.3 Влияние сероводорода на кинетику секреции медиатора 93
5.4 Роль циклических нуклеотидов'в реализации эффектов сероводорода на нервно-мышечную передачу 94
5.5 Роль внутриклеточных Са +-депо в реализации эффектов сероводорода на нервно-мышечную передачу 95
5.6 Возможность эндогенного синтеза сероводорода в области нервно-мышечного синапса лягушки и мыши 97
Выводы 100
Список литературы 102
- Особенности газообразных посредники как регуляторов физиологических функций
- Растворы и фармакологические вещества
- Влияние газообразного сероводорода и, гидросульфида натрия на вызванную секрецию медиатора и электрогенез двигательного нервного окончания лягушки в условиях низкого содержания ионов кальция в растворе
- Пресинаптическое влияние сероводорода в нервно-мышечном синапсе лягушки и мыши
Введение к работе
Исследование механизмов регуляции синаптической передачи является одним из актуальных направлений в нейрофизиологии . В конце прошлого века был открыт новый класс биологически активных веществ -газообразных посредников, осуществляющих как межклеточную, так и внутриклеточную регуляцию различных физиологических функций.. В. настоящее время к этому классу относят оксид азота, монооксид углерода и сероводород [23, 52, 166, 283]. Оказалось, что физиологическое значение газов не ограничивается регуляцией функций желудочно-кишечного тракта и сосудистой системы, где оно было определено первоначально, но также распространяется на центральную и периферическую нервную систему [26, 110,165,249,280]:
Сероводород - газ, обладающий хорошо известными, токсическими эффектами, связанными, с нарушением окислительного фосфорилирования в клетке [230]. В- тканях млекопитающих были обнаружены высокие концентрации сероводорода: в плазме крови крыс 46 мкМ, а в тканях мозга 50-100 мкМ [33, 86, 232, 287], что предположило возможную физиологическую роль этого газа. Также как оксид азота и монооксид углерода сероводород участвует в расслаблении гладкой мускулатуры [32, 85, 231, 286], физиологические концентрации этого газа усиливают активность К-метил-Б-аспартат-рецепторов и облегчают индукцию долговременной потенциациив гиппокампе [28] . Показано, что сероводород приводит к увеличению внутриклеточного кальция в астроцитах и вызывает кальциевые волны, опосредуя взаимодействие между нейронами и глией [176, 202]. Известными мишенями-H2S являются аденилатциклаза [121, 146] и АТФ-зависимые К+-каналы [255, 235, 263, 283]. При некоторых нейродегенеративных процессах и сердечно-сосудистых заболеваниях наблюдаются изменения уровня сероводорода в тканях [171, 173, 197, 198].
Эндогенно сероводород синтезируется из L-цистеина пиридоксаль-5 -фосфат зависимыми ферментами - цистатионин р-синтазой и цистатионин у— лиазой, экспрессирующимися практически во всех тканях [96, 98]. Показано, что эндогенный синтез сероводорода в нервной системе вызывается кратковременной активацией цистатионин р-синтазы вследствие нейронального возбуждения и входа кальция [96], что предполагает нейромедиаторную роль сероводорода, как и других газов. Исследования эффектов экзогенного и эндогенного сероводорода на секрецию медиатора и выявление внутриклеточных механизмов его влияния на функцию нервно-мышечного синапса позволит определить основные мишени действия сероводорода при модуляции синаптических функций.
Цель и задачи исследования
Целью данного исследования являлось определение механизмов, лежащих в основе действия сероводорода на секрецию медиатора, и выявление возможности его эндогенного синтеза в области нервно-мышечного синапса теплокровных и холоднокровных животных.
В соответствии с этой целью были поставлены следующие задачи:
1. Изучить эффекты газообразного сероводорода и его донора гидросульфида натрия на секрецию медиатора и ионные токи двигательного нервного окончания лягушки.
2. Исследовать эффекты сероводорода на спонтанную и вызванную секрецию медиатора в нервно-мышечном синапсе мыши.
4. Выявить роль рианодиновых рецепторов внутриклеточных кальциевых депо в эффектах сероводорода.
5. Исследовать возможность эндогенного синтеза сероводорода в нервно-мышечном синапсе лягушки и мыши с использованием блокаторов цистатионин р-синтазы и цистатионин у-лиазы.
6. Определить экспрессию генов ферментов синтеза сероводорода в диафрагмальной мышце мыши методом обратно-транскриптазной полимеразной цепной реакции.
Научная новизна
В работе впервые показано, что сероводород является пресинаптическим модулятором передачи возбуждения в нервно-мышечных соединениях холоднокровных и теплокровных животных. Установлено, что сероводород увеличивает вызванное и спонтанное освобождение медиатора, не изменяя электрогенез двигательного нервного окончания. Впервые выявлено, что блокирование ферментов синтеза сероводорода приводит к эффектам, противоположным действию газа, что говорит о его эндогенном синтезе в области нервно-мышечного синапса как холоднокровных, так и теплокровных животных. Определена экспрессия мРНК цистатионин р-синтазы и цистатионин у-лиазы - ферментов синтеза сероводорода в диафрагме мыши. Впервые исследованы внутриклеточные механизмы действия сероводорода на секрецию медиатора в двигательном нервном окончании лягушки. Показано, что в основе эффектов сероводорода на секрецию медиатора лежит увеличение внутриклеточной концентрации Са2+ за счет • активации рианодиновых рецепторов эндоплазматического ретикулума.
Особенности газообразных посредники как регуляторов физиологических функций
В последнее десятилетие был открыт новый класс газообразных посредников, к которому относятся такие газы как оксид азота (NO), монооксид углерода (СО) и сероводород (H2S) [23, 52, 166, 280, 283]. Это особая группа веществ, осуществляющих как межклеточную; так и внутриклеточную регуляцию разнообразных физиологических функций. N0, СО, H2S являются небольшими молекулами, легко проникают через мембрану. Газообразные посредники образуются в нейронах в ответ на вход ионов Са , однако, будучи газами, они выделяются из любого участка клетки, не запасаются в везикулах и не освобождаются экзоцитозом. Кроме того, для них не существует рецепторов на постсинаптической мембране, и они диффундируют в соседние клетки, где связываются с «ферментным рецептором». В отличие от классических медиаторов газы обычно участвуют в передаче ретроградного сигнала от пост- к пресинаптическому нейрону, а также могут вырабатываться в клетках глии. Данные газы эндогенно синтезируются с помощью ферментов, и их синтез является регулируемым [23, 52, 280]. В физиологических концентрациях газы проявляют хорошо выраженные специфические функции, так, например, все они являются эндогенными вазорелаксантами, участвуют в индукции и поддержании долговременной потенциации в мозге. Клеточные эффекты газов опосредуются либо через систему внутриклеточных посредников, либо они оказывают прямое влияние на субъединицы ионных каналов, белки экзоцитоза, внутриклеточные ферменты» [23, 280]. В двигательных нервных окончаниях холоднокровных животных обнаружено, что NO и СО являются модуляторами освобождения медиатора. Показано, что N0 угнетает спонтанную и вызванную секрецию медиатора и модифицирует потенциалзависимые и кальцийактивируемые калиевые каналы нервного окончания лягушки [26, 168, 267]. При этом экзогенный СО усиливает как спонтанную, так и вызванную секрецию медиатора [249]. Выявлены возможные мишени и внутриклеточные механизмы действия NO и СО в нервном окончании [26, 249]. Данные о регуляции секреции медиатора сероводородом и возможности его эндогенного синтеза в нервно-мышечном синапсе отсутствуют.
Сероводород (H2S) - бесцветный газ с сильным запахом. Сероводород растворим в воде, при нормальном давлении и 20С его концентрация в водных растворах соответствует 0,098 моль/л ( 10"1 моль/л ). Раствор сероводорода в воде (сероводородная вода) является очень слабой двухосновной кислотой. В водных растворах при рН=7,4 около одной трети H2S не подвергается диссоциации и две трети диссоциируют до БҐ и HS (гидросульфидного аниона), который в последствии может разложиться до КҐ HS2\ Н КҐ + Н8"«- 2НҐ + S2 Однако последняя реакция происходит только при высоком рН, поэтому концентрация S " in vivo незначительна [19, 28, 176]. В окислительно-восстановительном отношении H2S - сильный восстановитель. В реакции с окислителями его молекула теряет 2, 6 и 8 электронов [19].
Гидросульфид натрия (NaHS) обычно используют как донор H2S, так как в водной среде он диссоциирует до Na2+ и HS", далее HS" взаимодействует с КҐ и формирует недиссоциированный H2S [176]. Показано, что NaHS количественно является таким же эффективным, как и раствор, полученный при перфузии газообразным сероводородом [305]. Показано, что при рН-7.4 и температуре 20 раствор сероводорода содержит около 30-33% газа (H2S) и 67-70% HS-[122, 305].
Продуктами окисления сероводорода могут быть элементарная сера (S"), оксид серы (SO2) и сульфаты, такие как серная кислота (H2S04) [19]. Подобно NO и СО, H2S липофилен и свободно проникает через плазматическую мембрану, хотя его проницаемость ниже, чем для N0 и СО в связи с частичной диссоциацией [176].
Эндогенно H2S может синтезироваться двумя путями. Первый -ферментативный путь синтеза H2S из L-цистеина двумя цитозольными пиридоксаль-5 -фосфат-зависимыми ферментами - цистатионин 3-синтазой (CBS) и цистатионин у-лиазой (CSE). Экспрессия ферментов CBS и CSE является тканеспецифичной. В печени, почках, кишечнике, гладкомышечных клетках H2S синтезируется CSE, тогда как в мозге основным ферментом синтеза H2S является CBS [102, 226, 283]. Второй - неферментативный путь синтеза H2S из глюкозы в присутствии элементарной серы [52, 246, 283]. Серосодержащие аминокислоты являются главными источниками эндогенного синтеза сероводорода.
Растворы и фармакологические вещества
Стандартный раствор Рингера для холоднокровных имел следующий состав (вмМ): NaCl - 115; КС1 - 2.5; СаС12 - 1.8; HEPES - 5 (t=20C5 рН 7.2-7.4). А также использовали стандартный раствор Крепса для теплокровных животных (в мМ): NaCl - 154; КС1 - 5; СаС12 - 2; HEPES - 5, MgCl2 - 1, глюкоза- 11 (t=20C, рН 7.2-7.4). Для устранения сокращения мышц в раствор добавляли d-тубокурарин в концентрации 20-30 мкМ или использовали раствор Рингера с пониженной концентрацией ионов кальция ([Са2+]0 ) (0.2-0.4 мМ) и повышенной концентрацией ионов магния ([Mg )0) (2-4 мМ). Раствор Крепса префузировали карбогеном в течение всего эксперимента.
В электрофизиологических экспериментах использовали фармакологические препараты фирмы Sigma (табл. 1) Все вещества хранили при температуре -20С. Водонерастворимые вещества растворяли в диметилсульфоксиде (DMSO). Концентрация DMSO растворах не превышала 0.01%.
Газообразный H2S получали в реакции: Na2S+2HCl = 2NaCl + H2S, которую проводили в вытяжном шкафу [14]. В двугорлую колбу помещали Na2S и медленно по каплям добавляли 20%-ную НС1, вращая колбу для равномерного перемешивания. Образовавшимся в результате реакции H2S насыщали 20 мл раствора Рингера в течение 30 мин непосредственно перед экспериментом. С учетом растворимости H2S концентрация базового раствора составляла 98 мМ [19]. Данный раствор сразу же доводили до необходимой концентрации H2S и добавляли в систему перфузии. NaHS широко используется в научных исследованиях в качестве донора H2S [28], так как в водных растворах диссоциирует до иона натрия (Na+) и гидросульфидного аниона (HS"), который реагирует с протоном (ЬГ), образуя H2S. Известно, что в физиологическом растворе одна треть H2S находится в недиссоциированной форме, а остальные две трети существуют в виде HS" [28]. Таблица 1
Химические вещества, использованные в электрофизиологической части исследования Вещество Концентрация, мкМ Действие H2S 500 Газообразный сероводород NaHS 10-500 Донор сероводорода 4-аминопиридин 100 Блокаторпотенциалзависимых К+-каналов L-цистеин 100-1000 Субстрат синтеза H2S Аминооксиацетиловая кислота (АОАК) 1000 Ингибитор CBS Р-цианоаланин ( р-ЦА) 1000 Ингибитор CSE cisN-(2-phenylcyclopentyl) azacyclotridecl-en-amine hydrochloride (MDL-12330A) 0.8 мкМ Ингибитор аденилатциклазы 8(4-chlorophenylthio)-adenosine-3,5-cyclic monophosphat (pCPT-cAMP) 100 мкМ Аналог цАМФ lH-[l,2,4]-oxadiazolo[4,3-a]quinoxalin-l-one (ODQ) 0.1 мкМ Ингибитор гуанилатциклазы 8(4-chlorophenylthio)-guanosine-3,5-cyclic monophosphat (pCPT-cGMP) 100 мкМ Аналог цГМФ дантролен 25мкМ Ингибитор рианодиновых рецепторов кофеин ЗмМ Активатор рианодиновых рецепторов 3.3 Электрофизиологический метод 3.3.1 Экспериментальная ванночка и система персэузии
Ванночка (рис: 5);. где размещался- нервнотмышечный препарат, была изготовлена из; органического стекла и имела рабочийобъем 3 мл, к ней была подсоединена; . перфузионная система; Каждая из трех пар емкостей перфузионной» системы состояла из основного стаканчика (емкостью 250 мл) и; переходного (50 мл), соединенных поливиниловыми трубками, таким? образом, что скорость перфузии в течение эксперимента была постоянной; Все эксперименты, выполнены в условиях постоянной наружной перфузии препарата со скоростью 5 мл/мин. Из ванночки растворы откачивали» активно с: использованием микрокомпрессора! Нерв; всасывали в пластмассовую: пипетку, укрепленную- в стенке ванночки; где были расположены два серебряных раздражающих электрода.
Изготовление, заполнение и подведение микроэлектродов
Для регистрации? ответов нервного окончания; (НО), токов; концевой пластинки; (ТКИ), потенциалов концевой пластинки- и спонтанной секреции медиатораt использовали стеклянные микроэлектродьг из стекла; «Нирекс» [17] ". Электроды изготавливали на полу автоматическойвертикальной кузнице: из специальных- заготовок.. Изготовление и; заполнение электродов; производили непосредственно перед экспериментом [13]:
Микроэлектроды с диаметром кончика 2-3 мкм имели сопротивление 2-5 МП. Микроэлектрод закрепляли на сцециальном держателе и соединяли с усилителем. Для этого непосредственно в микроэлектрод вводили тонкую серебряную хлорированную проволоку. Индифферентный электрод представлял собой аналогичную неполяризующуюся систему без микроэлектрода, который помещали в специальное гнездо ванночки, сообщающееся с основной камерой. Держатели активных электродов закрепляли в микроманипуляторах.
Основную часть экспериментов выполняли- с использованием оптической системы на базе польского поляризационно-интерференционного микроскопа «Биолар» под большим увеличением» (хЗОО). Используя такой микроскоп, можно увидеть живые, неокрашенные нервные терминали и под визуальным контролем подводить к ним электроды. Единственным-недостатком этого микроскопа является маленькое рабочее расстояние (расстояние от объектива до мышцы 1-2 мм), поэтому отводящие электроды специально изгибали (нагреванием) в двух местах (Рис. 5).
Регистрация биопотенциалов Раздражение двигательного нерва производили прямоугольными электрическими импульсами сверхпороговой амплитуды длительностью 0.2-0.3 мс одиночными стимулами с частотой 0.2-0.4 имп/с или пачками ритмических стимулов (500 раздражений) с частотой 10 или 50 имп/с.
Стимулирующие электроды соединяли с выходными клеммами изолирующего» трансформатора электростимулятора ЭСЛ-2. Активный потенциальный- и индифферентный электроды соединяли с усилителем биопотенциалов. С усилителя- сигнал параллельно подавался на осциллограф G1-83 и на интерфейсную, плату персонального компьютера Pentium- II. Частота квантования составляла 5 мкс на точку. Зарегистрированные сигналы-усиливали и подавали на вход 32 разрядного АЦП.
Влияние газообразного сероводорода и, гидросульфида натрия на вызванную секрецию медиатора и электрогенез двигательного нервного окончания лягушки в условиях низкого содержания ионов кальция в растворе
При внеклеточном отведении добавление газообразного H2S (500 мкМ) в перфузируемый раствор с низкой [Са2+]0 (0,2-0,4 мМ) приводило к быстрому и обратимому увеличению амплитуды ТКП, которая к 15 минуте эксперимента увеличилась относительно.контроля до 216±29% (рис. 6 А, Б). Увеличение амплитуды сопровождалась ростом квантового состава ТКП до 320±42% (п=5 р 0.05) (рис. 6 А). Донор H2S - гидросульфид натрия (NaHS) (500 мкМ) к 15 минуте эксперимента также обратимо повышал амплитуду и квантовый состав ТКП до 225±21% и 288±31% (л=5; р 0.05) (рис 6 А, Б), соответственно. Параметры ответа НО1 как при добавлении газообразного H2S, так и-NaHS не изменялись (табл. 2).
Таким образом, газообразный H2S и его донор - NaHS вызывают сходные изменения квантового состава ТКП, что позволило нам в дальнейшем использовать NaHS в качестве донора сероводорода.
В условиях пониженной [Са ]о (0.2-0.4 мМ).в растворе при одиночном раздражении исследовали эффекты NaHS (10-500 мкМ) на вызванную секрецию медиатора: Эффект NaHS был дозозависимым в пределах концентраций от 10 до 500 мкМ. 2 мс А - Изменения квантового состава токов концевой пластинки на фоне действия H2S (500 мкМ) и NaHS (500 мкМ) при одиночной стимуляции (-H2S, А - NaHS). Б - Усредненные ответы нервного окончания и следующие за ними токи концевой пластинки (30 реализаций) в контроле, при действии H2S (500 мкМ) и NaHS (500 мкМ) в отдельных экспериментах. В - Кривая дозозависимости эффектов NaHS на квантовый состав токов концевой пластинки. ([Са2+]0 =0.2-0.4 мМ, [Mg2+]0= 2-4 мМ)
NaHS в концентрации 10 мкМ не вызывал увеличения квантового состава ТКП, в концентрации 25 мкМ к 20 минуте действия NaHS увеличивал квантовый состав ТКП до 138±16% (n=4; р 0.05), NaHS - 50 мкМ увеличивал квантовый состав ТКП до 153±13% (п=4; р 0.05), не изменяя амплитуды ТКП. Увеличение квантового состава ТКП при аппликации NaHS в концентрации 100 мкМ до 246±27% сопровождалось ростом амплитуды ТКП до 165±41% (п=б; р 0.05) относительно контроля, при этом ионные токи НО не менялись. NaHS в концентрации 500 мкМ к 20 минуте эксперимента повышал квантовый состав и амплитуду ТКП относительно контроля до 288±32% и 225±21% (п=5; р 0,05) соответственно. На рис. 6 В представлена кривая дозозависимости эффектов NaHS на квантовый состав ТКП, ЕС5о =72±31 мкМ.
Во всех случаях NaHS не вызывал изменения ответа НО, что свидетельствует об отсутствии эффектов H2S на потенциалзависимые Na+ и К+-токи двигательного НО (табл. 2).
В, дальнейших экспериментах использовали NaHS в концентрации-100 мкМ. Для выявления влияния H2S наСа -активируемые К токи использовали раствор Рингера с нормальной [Са2+]0 (1.8 мМ), в который добавляли блокатор потенциалзависимых К+-каналов - 4-аминопиридин (100 мкМ). Добавление 4-аминопиридина в перфузируемый раствор приводило к повышению амплитуды третьей фазы ответа НО-за счет усиления Са -активируемого К -тока и появлению повторной активности двигательного НО. В данных условиях амплитуда 3 фазы ответа НО в отражает величину Са2+-активируемого К+тока [11]. Добавление NaHS (100 мкМ) на фоне действия 4-аминопиридина не приводило к достоверному изменению амплитуды и длительности третьей фазы ответа НО, то есть NaHS не влиял на Са -активируемый К+-ток НО (табл. 2). Таблица 2 Эффекты NaHS на ионные токи нервного окончания Ответы нервного окончания Токи нервного окончания , Контроль, % NaHS, %. 2 фаза Потенциал зависимые Na+(Ca2+ 0.2-0.4 мМ) 100 105 ±6 3 фаза Потенциал зависимые К+(Са2+0.2-0.4 мМ) 100 98 ±5 -» 3 фаза Ga2+ активируемые К+ (Са 2+ 1.8 мМ, ТБК, 4-АП) 100 109 ±10
Примечание. 4АП - 4-аминопиридин, блокатор потенциалзависимых К -каналов. Даны средние значения ± стандартные ошибки, п- количество экспериментов.
В условиях низкой [Са ]0 когда потенциал действия вызывает выброс не более одного кванта медиатора, распределение синаптических задержек одноквантовых ТКП является показателем асинхронности секреции медиатора [64, 137, 273, 303]. На основе расчета синаптических задержек в контроле, при действии газообразного H2S (100 мкМ) и NaHS (100 мкМ) строили гистограммы распределения и кумулятивные кривые. Определялись минимальная и максимальная синаптические задержки, отражающие выделение самого «быстрого» и самого «медленного» кванта медиатора, главную моду гистограммы распределения задержек. По кумулятивным кривым анализировали параметры Р5о и параметр Р9о, характеризующие временной интервал, в который попадает 50% и 90% значений синаптических задержек, ранжируемых по возрастанию. Достоверных изменений исследованных параметров при действии H2S и NaHS выявлено не было. На рис. 7 Б и А в качестве примера представлены гистограммы и кумулятивные кривые синаптических задержек, полученные в одном эксперименте.
Пресинаптическое влияние сероводорода в нервно-мышечном синапсе лягушки и мыши
Полученные нами данные свидетельствуют о том, что экзогенный сероводород микромолярных концентрациях оказывает облегчающее влияние на спонтанное и вызванное освобождение медиатора в нервно-мышечном синапсе лягушки. Анализ влияния сероводорода на спонтанную секрецию медиатора показал увеличение частоты МПКП без изменения их амплитудно-временных параметров, что свидетельствует об отсутствии влияния сероводорода на чувствительность постсинаптических холинорецепторов. При этом наблюдалось увеличение амплитуды ПКП за счет усиления квантового состава, что было показано в условиях внеклеточного отведения- ТКП. Увеличение амплитуды ПКП и частоты МПКП1 наблюдалось и при исследовании эффектов сероводорода на освобождение медиатора у теплокровных животных. Увеличение частоты МПКП не сопровождалось изменением их амплитудно-временных параметров.
Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что H2S усиливает секрецию медиатора из двигательного НО как холоднокровных, так и теплокровных животных.
В ходе исследования дозозависимости действия донора H2S - NaHS было отмечено увеличение вызванной секреции медиатора уже при концентрации 25 мкМ, а при 100 мкМ эффект выходил «на плато». Данные концентрации находятся в рамках физиологических концентраций НгЭи не оказывают токсического действия [28]. Bs мозге млекопитающих эндогенно синтезируемый сероводород присутствует в относительно высоких концентрациях (50-160 мкМ), что предполагает его физиологическую функцию, наряду с другими газообразными посредниками - оксидом азота (II) и монооксидом углерода [23, 28, ИЗ, 280, 283]. Исследований эффектов сероводорода на синаптическую передачу практически не проводилось. В гиппокампе крысы показано, что физиологические концентрации NaHS (10-130 мкМ) облегчают индукцию долговременной потенциации, увеличивая проводимость НМДА-рецепторов [28]. При этом в концентрациях менее 130 мкМ NaHS не изменял вызванных постсинаптических потенциалов в СА1 области гиппокампа. В высоких концентрациях (320 и 640« мкМ) донор сероводорода — NaHS ингибировал синаптическую передачу [28]. В срезах гипоталамуса крысы аппликация донора H2S - NaHS приводила к уменьшению KCL-вызванного освобождения» кортикотропного гормона [82], однако, в данном исследовании также использовались высокие концентрации NaHS-(l и 10 мМ), вызьшающие нарушения оксилительногофосфорилирования [43]. В сердечно-сосудистой и репродуктивной системах и желудочно-кишечном тракте млекопитающих сероводород вызывает преимущественно расслабление гладких мышц [122, 265, 306]. Вазоактивные эффекты H2S наблюдались у представителей практически всех классов позвоночных животных и включали расслабление, сокращение и многофазные ответы, в зависимости от вида и типа сосудов [212]. H2S вызывал сократительный ответ изолированного мочевого пузыря крысы, путем усиления» освобождения тахикининов из первичных афферентных нервных терминалей, подобно капсаицину. Тахикинины, активируя NK1 и NK2 рецепторы, вызывают моторный ответ гладкой мышцы [215]. Исследование молекулярных мишеней действия обнаружило, что эффект NaHS был чувствительным к рутению красному, являющимся неселективным блокаторомТКРУІ катионных каналов [216].
Увеличение освобождения медиатора может быть связано с изменение элекрогенеза двигательного НО и усилением входящего кальциевого тока. Однако, нами было показано, что H2S не изменял ни натриевого, ни потенциал зависимого и кальций-активируемого калиевых токов НО. Однако, нельзя исключить прямого влияния сероводорода на входящие кальциевые токи НО. Так показано; что гипералгезия, вызванная аппликацией NaHS, может быть связана с активацией Т-типа Са -каналов в первичных афферентных нейронах у крысы [139]. Также сероводород вызывал повышение цитозольной концентрации ионов кальция в нейрональных клетках путем активации L-тип Са -каналов. [107]. Кроме того; показано; что-вазоконстрикция-у рыб может быть связана с изменением внутриклеточной концентрации ионов Са2+ за счет усилением входящего кальциевого тока или высвобождения из .внутриклеточных депо [212].
Возможно также; что H2S непосредственно вмешивается в механизмы экзоцитоза синаптических везикул, связанные с трансформацией белков SNARE-комплекса, о чем свидетельствует увеличение частоты МПКП. Известно, что вшодных растворах H2S обладает свойствами, восстановителя [283] и способен восстанавливать дисульфидные связи, белковых молекул-[226, 283]. Можно- предположить, что H2S приводит к изменению окислительно-восстановительного статуса SNARE комплекса, что влияет на стабильность белковых взаимосвязей [94, 172].
