Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 13
1.1. Клинико-патогенетические особенности хронического вирусного гепатита С 13
1.2. Роль полиморфизма генов человека. в формировании предрасположенности/резистентности к хроническому вирусному гепатиту С 16
1.2.1. Роль полиморфизма генов иммунной системы в патогенезе HCV-инфекции 18
1.2.2. Роль полиморфизма генов метаболизма в патогенезе хронической HCV-инфекции 27
1.3. Молекулярные механизмы участия генов АРОЕ, HFE, SOD2 и IL6 в патогенезе хронического вирусного гепатита С и других заболеваний 31
1.3.1. Ген аполипопротеина Е 31
1.3.2. Ген гемохроматоза 38
1.3.3. Ген супероксиддисмутазы 2 40
1.3.4. Ген интерлейкина 6 44
Заключение 48
Глава 2. Материал и методы исследования 49
2.1. Характеристика обследованных больных 49
2.2. Методы исследования 52
2.2.1. Выделение ДНК методом фенол-хлороформной экстракции 53
2.2.2. Амплификация ДНК методом полимеразной цепной реакции 54
2.2.2.1. Амплификация гена АРОЕ 54
2.2.2.2 Амплификация гена HFE 54
2.2.2.3. Амплификация гена SOD2 55
2.2.2.4. Амплификация гена IL6 56
2.2.3. Изучение полиморфизма генов методом анализа полиморфизма длин фрагментов рестрикции 56
2.2.4. Статистический анализ результатов исследования 58
Глава 3. Результаты исследований 59
3.1. Анализ распространенности полиморфизма гена АРОЕ среди здоровых доноров и больных хронической HCV-инфекцией 59
З.1.1.- Оценка частот встречаемости полиморфных вариантов гена АРОЕ у больных хронической HCV-инфекцией 59
3.1.2. Анализ взаимосвязи между активностью воспаления в печени и носительством вариантных аллелей гена АРОЕ у больных хронической HCV-инфекцией 60
3.1.3. Анализ взаимосвязи между прогрессированием фиброза печени и носительством вариантных аллелей гена АРОЕ у больных хронической HCV-инфекцией 62
3.2. Анализ распространенности полиморфизма Ala(-9)Val гена SOD2 среди здоровых доноров и больных хронической HCV-инфекцией 64
3.2.1. Оценка частот встречаемости полиморфных вариантов гена SOD2 у больных хронической HCV-инфекцией 64
3.2.2. Анализ взаимосвязи между активностью воспаления в печени и носительством вариантных аллелей гена SOD2 у больных хронической HCV-инфекцией 65
3.2.3. Анализ взаимосвязи между прогрессированием фиброза печени и носительством вариантных аллелей гена SOD2 у больных хронической HCV-инфекцией 66
3.3. Анализ распространенности полиморфизмов H63D и C282Y гена HFE среди здоровых доноров и больных хронической HCV-инфекцией 68
3.3.1. Оценка частот встречаемости полиморфных вариантов гена HFE у больных хронической HCV-инфекцией 68
3.3.2. Анализ взаимосвязи между активностью воспаления в печени и носительством вариантных аллелей гена HFE у больных хронической HCV-инфекцией 70
3.3.3. Анализ взаимосвязи между прогрессированием фиброза печени и носительством вариантных аллелей гена HFE у больных хронической HCV-инфекцией 72
3.4. Анализ распространенности полиморфизма G174C в промоторной области гена IL6 среди здоровых доноров и больных хронической HCV-инфекцией 75
3.4.1. Оценка частот встречаемости полиморфных вариантов гена IL6 у больных хронической HCV-инфекцией 75
3.4.2. Анализ взаимосвязи между активностью воспаления в печени и носительством вариантных аллелей гена IL6 у больных хронической HCV-инфекцией 76
3.4.3. Анализ взаимосвязи между прогрессированием фиброза печени и носительством вариантных аллелей гена IL6 у больных хронической HCV-инфекцией 77
Глава 4. Обсуждение результатов исследования 80
Выводы 94
Список литературы 95
- Роль полиморфизма генов иммунной системы в патогенезе HCV-инфекции
- Характеристика обследованных больных
- Анализ взаимосвязи между активностью воспаления в печени и носительством вариантных аллелей гена HFE у больных хронической HCV-инфекцией
- Анализ взаимосвязи между прогрессированием фиброза печени и носительством вариантных аллелей гена IL6 у больных хронической HCV-инфекцией
Введение к работе
Актуальность исследования. Хронический вирусный гепатит С представляет собой медленную инфекцию, исходом которой является развитие латентного хронического воспаления печени с дальнейшим прогрессированием в цирроз печени и гепатоцеллюлярную карциному. В 85% случаев острой HCV-инфекции наступает хронизация, лишь у 15%) инфицированных HCV возможно спонтанное выздоровление [Su A.I. et al., 2002; Berkes J. et al., 2005; Santos C. et al., 2010]. Лечение хронического вирусного гепатита С является одной из наиболее актуальных проблем современной медицины. Однако, несмотря на то, что постоянно разрабатываются новые и совершенствуются хорошо известные схемы применения основных противовирусных препаратов (интерфероны, аналоги ігуклеозидов и др.), эффективность данной терапии составляет не более 75 % [Конусова В.Г. и соавт., 2003; McHutchison J.G. et al., 2009].
Высокая антигенная изменчивость вируса гепатита С - одно из основных препятствий к созданию эффективных вакцин на основе живых культур или полноразмерных рекомбинантных белков, что связано, в первую очередь, с изменчивостью аминокислотной последовательности вирусных протеинов [Richardson М.М. et al., 2005; Железникова Г.В. и соавт., 2007]. Естественное течение хронической HCV-инфекции подвержено значительным межиндивидуальным вариациям. Известно, что у части больных имеет место медленный темп прогрессирования фиброза. В то же время существует группа пациентов, у которых формирование цирроза печени происходит быстро (через 10-15 лет после инфицирования) [Friedman S.L. et al., 2003; Зайцев И.А. и соавт., 2009].
В последние годы особое внимание уделяется изучению генетических факторов, способных модифицировать скорость фиброгенеза при хронической HCV-инфекции [Абдуллаев СМ. и соавт., 2006; Morgan T.R. et al., 2008; Thomas D.L. et al., 2009]. Среди этих факторов особая роль принадлежит полиморфизму генов-регуляторов метаболизма - АРОЕ (аполипопротеин Е), HFE (белок наследственного гемохроматоза), SOD2 (супероксиддисмутаза-2) и гену 1L6 (интерлейкин 6) [Richardson М.М. et al., 2005].
Известно, что HCV циркулирует в плазме в комплексе с вырабатываемыми печенью липопротеинами очень низкой плотности (ЛПОИП) в мембранных везикулах, в которых идет репликация вируса. Помимо всех основных компонентов репликативного комплекса, везикулы содержат белки, необходимые для сборки ЛПНП, включая аполипопротеин Е [Huang Н. et al., 2007].
З
Прогрессивное развитие фиброза с исходом в цирроз печени наблюдается у 20-30% больных с хронической HCV-инфекцией. Помимо внешних факторов, модифицирующих естественное течение хронического гепатита С (например, злоупотребление алкоголем) определенную роль в ускорении фиброгенеза играет полиморфизм гена HFE [Maher J.J. et al., 2001; Hellier S. et al., 2003; Richardson M.M. et al., 2005]. Известно, что гетерозиготы по гену HFE характеризуются умеренным повышением уровня железа в организме [Абдуллаев СМ. и соавт., 2006].
Активация процессов свободнорадикального окисления является патогенетическим звеном развития многих вирусных заболеваний печени, при этом избыточное образование активных форм кислорода проявляется на самых ранних стадиях процесса [Нагоев Б.С. и соавт, 2003; Loguercio С. et al., 2003; Elchuri S. et al., 2005]. Среди антиоксидантов, нормализующих уровень АФК и продуктов ПОЛ, особое место принадлежит супероксиддисмутазе 2 типа, которая катализирует реакцию дисмутации - взаимодействия двух супероксидных радикалов друг с другом, превращая токсичный кислород в менее токсичную перекись водорода [Чурилова И.В. и соавт., 2002].
Излишняя продукция IL-6 ведет к увеличению экспрессии рецептора ЛПОНП [Hashizume М. et al., 2010], тем самым повышая проникновение вируса гепатита С в комплексе с ЛПОНП внутрь клетки. Кроме того, IL-6 участвует в обострении хронических, так и в переходе острых воспалительных процессов в хронические [Thornton A. et al., 1991; Decker К. et al., 1993].
Исходя из недостаточности фундаментальных знаний о механизмах генетической предрасположенности организма человека к воздействию вируса гепатита С в настоящее время не разработана система индивидуального прогнозирования характера течения, вероятности развития осложнений и эффективности лечения хронического вирусного гепатита С.
Цель исследования - установить роль полиморфизма генов HFE, АРОЕ, SOD2 и IL6 в патогенезе хронического вирусного гепатита С у представителей европеоидной популяции, проживающих на территории Томской области.
Задачи исследования:
-
Проанализировать характер распределения аллельных вариантов генов HFE, АРОЕ, SOD2 и IL6 у больных хроническим вирусным гепатитом С и здоровых доноров, принадлежащих к европеоидной популяции Томской области.
-
Оценить взаимосвязь полиморфизма генов HFE, АРОЕ, SOD2 и IL6 с активностью воспалительного процесса в печени при хроническом вирусном гепатите С.
3. Установить характер ассоциации аллельных вариантов генов HFE, АРОЕ, SOD2 и IL6 с тяжестью фиброза печени у больных хроническим вирусным гепатитом С.
Научная новизна. Впервые проведено сравнительное клинико-лабораторное и морфологическое обследование больных хроническим вирусным гепатитом С, имеющих различные темп прогрессирования фиброза и степень активности воспалительного процесса в печени, с определением у них частоты генотипов и аллелей полиморфных маркеров комплекса генов (НЕЕ, АРОЕ, SOD2 и IL6), белковые продукты которых принимают участие в различных этапах патогенеза хронической HCV-инфекции. На большой группе здоровых доноров изучена распространенность генотипов и аллелей полиморфизма вышеуказанных генов в российской популяции.
Показана ассоциация хронической HCV-инфекции и носительством генотипов ЕЗ/ЕЗ гена АРОЕ, Val/Val гена SOD2 и D/D гена HFE. Определены «профибротические» (SOD2 Val/Val; HFE 63H/D и 63D/D) и «протективные» (SOD2 Ala/Ala и Ala/Val; HFE 63Н/Н) генотипы, ассоциированные, соответственно, с быстрым и медленным темпами прогрессирования фиброза печени. Кроме того, установлена связь наличия аллеля G полиморфного варианта G174C промотерного региона гена IL6 с активностью воспалительного процесса в печени при HCV-инфекции.
Теоретическая и практическая значимость. Результаты проведенного исследования, позволившие выделить генетические факторы, влияющие па особенности течения HCV-инфекции, степень фиброза и активность воспаления печени, имеют значение для оценки прогноза хронического вирусного гепатита С. Установлены гены, носительство полиморфных вариантов которых, влияет на особенности клинико-морфологической картины хронической HCV-инфекции. Проведенное исследование позволит индивидуализировать тактику ведения больных ХВГС, учитывая данные клинического и генетического обследования.
Положения исследования могут служить основанием для разработки стратегии изучения молекулярных и клеточных механизмов формирования длительной персистенции HCV в организме. Полученные фундаментальные знания представляют основу для разработки новых подходов к патогенетически обоснованной терапии и своевременной профилактики развития хронической HCV-инфекции, а также осложнений, возникающих при длительной вирусной персистенции.
Основные положения и выводы диссертационной работы используются в учебном процессе кафедры фундаментальных основ клинической медицины (по дисциплине «Клиническая лабораторная диагностика» в разделе
«Диагностика инфекционных заболеваний», по дисциплине «Молекулярные основы патологии» в разделе «Молекулярно-генетические основы предрасположенности организма к инфекционным заболеваниям») ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава.
Основные положения, выносимые на защиту.
-
У HCV-инфицированных пациентов европеоидной популяции, проживающих на территории Томской области, частота встречаемости аллеля ЕЗ и генотипа ЕЗ/ЕЗ гена АРОЕ выше по сравнению с таковыми у здоровых доноров. При этом у пациентов с хроническим вирусным гепатитом С не выявлено взаимосвязи аллельного полиморфизма гена АРОЕ со степенью фиброза и активностью воспаления печени.
-
Частота встречаемости аллеля Val гена SOD2 и гомозигот с генотипом Val/Val достоверно выше у больных HCV-инфекцией по сравнению с аналогичными показателями у здоровых доноров. Степень фиброза печеночной ткани у больных хроническим гепатитом С сопряжена с увеличением частоты встречаемости аллеля Val и генотипа Val/Val гена SOD2. При этом не было выявлено взаимосвязи между носительством полиморфизма гена SOD2 и степенью воспалительного процесса в печени.
-
При исследовании полиморфизма H63D гена HFE установлено, что частоты встречаемости аллеля D и генотипа D/D достоверно выше у больных хроническим вирусным гепатитом С, существенны различия частот встречаемости полиморфизма H63D гена HFE у больных ХГВС с различной выраженностью фиброза печени, наряду с отсутствием различий частот встречаемости полиморфных вариантов гена HFE у больных с различной степенью активности воспалительного процесса в печени.
-
Анализ полиморфизма C282Y гена HFE у здоровых людей и больных гепатитом С не выявил достоверных различий в частотах распределения генотипов и аллелей. Кроме того, не было обнаружено различий частот встречаемости данных полиморфных аллелей и генотипов гена HFE у больных гепатитом С в зависимости от степени фиброза и активности воспаления печени.
-
В результате проведенного анализа полиморфизма C174G в промотерной области гена IL6 не выявлено статистически достоверных различий в исследованных группах (здоровые и больные HCV-инфекцией). При оценке значения полиморфизма C174G гена IL6 в развитии фиброза также были получены не достоверные различия частот встречаемости вариантных аллелей и генотипов гена у больных HCV-инфекцией с различной степенью фиброза печени. При изучении распределения аллелей и генотипов полиморфизма C174G гена IL6 в зависимости от степени активности воспаления выявлено, что
аллель G и генотип G/G ассоциированы с выраженной степенью воспалительного процесса печени.
Апробация работы. Результаты исследования были доложены и обсуждены на IV Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов» (Новосибирск, 2009), IV международной научной конференции молодых ученых-медиков (Курск, 2010), II Всероссийской научно-практической конференции с международным участием "Вопросы патогенеза типовых патологических процессов" (Новосибирск, 2010), XVI межгородской конференции молодых ученных «Актуальные проблемы патофизиологии» (Санкт-Петербург, 2010).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано б печатных работ, в том числе 2 - в журналах, рекомендованных ВАК для публикации материалов диссертаций на соискание ученой степени кандидата медицинских наук.
Объем и структура диссертации. Текст диссертации изложен на 119 страницах и включает введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты собственных исследований, обсуждение результатов, выводы, практические рекомендации и список литературы, состоящий из 77 отечественных и 154 иностранных работ. Работа проиллюстрирована 1 рисунком и 17 таблицами.
Личный вклад автора. Анализ литературных данных по теме диссертации, планирование исследования, выделение ДНК, подбор праймеров, амплификация исследуемых генов, рестрикция амплификатов со специфическими рестриктазами, детекция результатов, статистический анализ результатов, написание диссертации выполнены лично автором.
Роль полиморфизма генов иммунной системы в патогенезе HCV-инфекции
Высказывается предположение о генетически детерминированных нарушениях иммунной системы, приводящих к недостаточности иммунного ответа и нарушению элиминации HCV. Установлено, что гены цитокинов и их рецепторов в популяции человека характеризуются аллельным полиморфизмом и наличием изоформ, что определяет их способность модулировать направление иммунного ответа и лежит в основе предрасположенности к саморазрешающейся инфекции или развитию хронического инфекционного процесса [Бархаш А.В. и соавт., 2005; Richardson М.М. et al., 2005; Фрейдин М.Б. и соавт., 2006; Stephen L. at al. 2006; Chen X.Y. et al., 2007; Hennig B.J. et al, 2007; Persico M. et al., 2007; Thurairajah P.H. et al., 2008; Ge D. et al., 2009].
В настоящее время изучена ассоциация полиморфизма примерно 20 генов-кандидатов с HCV-инфекцией (табл. 1), особенностями течения этого заболевания и его осложнениями. Среди них особую роль играют гены, ответственные за функционирование иммунной системы.
В формировании специфического иммунного ответа, развивающегося при действии HCV-инфекции, активно участвует TNF-a. TNF-a, являясь одним из основных цитокинов, обладающих провоспалительной функцией, запускает "цитокиновый каскад" в очаге воспаления, увеличивая продукцию IL-1, IL-2, IL-6, IL-10 и IFN-y, которые в свою очередь оказывают влияние на экспрессию TNF-a и его рецептора [Kim К. et аі., 2000; Зубова С.Г., 2001]. Таким образом, TNF-a опосредует не только реализацию неспецифического иммунного ответа, но и выступает в качестве индуктора дифференцировки ThO в ТЫ, модулируя тем самым направление специфического иммунного ответа в сторону преобладания клеточного звена резистентности [Luster M.I. et аі, 1994; Ihle J.N., 1995; Возианов А.Ф. и соавт., 1998; Chen Y. et аі., 2009]. Известно, что хроническая инфекция, индуцированная HCV, может сопровождаться изменением продукции TNF-a. Это, вероятно, обусловлено свойствами самих вирусов и реализацией их онкогенного потенциала [Ягода А.В. и соавт., 2000; Ивашкин В.Т. и соавт., 2001; 2003; Маммаев С.Н. и соавт., 2002; Царегородцева Т.М. и соавт., 2003].
Установлено, что полиморфные варианты промотора гена TNFA обеспечивают различную предрасположенность к персистенции вирусов [Hohler Т. et аі., 1998; Fernandes Н. et al., 2002)]. Известно, что точечная замена G— А в позиции -308 промотора влияет на экспрессию гена TNFA и, следовательно, на уровень его белкового продукта. Имеются данные, что носительство аллеля А сопровождается повышением секреции TNF-a почти в 2 раза [Wilson A.G. et аі., 1997; Hohler Т. et аі., 1998].
Исследование полиморфизма промоторного региона гена TNFA в участке G-308A у здоровых лиц европеоидного происхождения, проживающих на территории Западной Сибири, и больных хроническим вирусным гепатитом С показало, что распределение генотипов TNFA в контрольной группе соответствовало таковому у европеоидов других стран, где генотип G/G занимает доминантное положение [Fernandes Н. et al., 2002; Rosen H. et al., 2002; Авдошина B.B. и соавт., 2005].
Изучена связь полиморфного варианта G(-308)A гена TNFA с такими значимыми для течения хронического вирусного гепатита количественными признаками, как уровень IL-4, IL-10, IL-12, TNF-a, макроглобулина, фибронектина, активность коллагеназы, ингибитора протеиназ, эластазы и фракций оксипролина - свободной и белковосвязанной. Показано, что аллель А полиморфного маркера G(-308)A гена TNFA связан с более низкой продукцией TNF-a мононуклеарными клетками, повышенным синтезом IL-4 и IL-12. Выявлено, что частота аллеля А полиморфного маркера G(-308)A гена TNFA у больных со слабой степенью фиброза выше, чем у пациентов с умеренным и выраженным фиброзом и циррозом печени [Гончарова И.А. и соавт., 2008]. В исследованиях MX. Yu et аі. (2003) показано также, что меньшая степень фиброзирования печени у больных вирусным гепатитом С ассоциирована с носительством аллеля А полиморфного варианта G(-308)A гена TNFA.
IL-1 является индуцибильным белком, синтез которого начинается в-ответ на внедрение микроорганизмов или повреждение тканей. Данный цитокин необходим для развития воспаления и осуществления всего комплекса защитных реакций (острофазного ответа) [Фрейдлин И.С. и соавт., 1998; Васильева Г.И. и соавт., 2001]. Одним из факторов, влияющих на течение хронической HCV-инфекции, является полиморфизм генов, кодирующих белки, семейства IL-1. Наличие различных полиморфных вариантов гена IL1 определяет различный уровень экспрессии цитокина [Громова А.Ю. и соавт., 2004].
У носителей аллеля 1Ыр (+3953) продуцируется в 2-4 раза большее количество IL-ip по сравнению с гомозиготами по нормальному аллелю. По данным российских исследователей, носительство аллелей IL1/3 (+3953) достоверно влияет на эффективность иммуномодулирующей терапии рекомбинантным IL-ip ф-лейкином) при хроническом вирусном гепатите С. Максимальный терапевтический эффект отмечался у гомозигот по низкопродуцирующему варианту гена IL1/3. Наименьшая эффективность терапии отмечена у носителей гомозиготного высокопродуцирующего варианта гена IL1/3 [Громова А.Ю. и соавт., 2004].
Анализ ассоциации полиморфизма -511Т/С гена IL1 с развитием хронического вирусного гепатита С выявил, что генотип Т/Т гена 1Ы является существенным фактором риска развития гепатоцеллюлярной карциномы при HCV-инфекции [Tanaka Y. et al., 2003]. В исследованиях B.L. Park et al. (2003) также было отмечено влияние полиморфизма гена IL1 на развитие патологии печени при вирусном гепатите С. Относительное количество больных с Т/Т генотипом гена IL1 было достоверно больше, чем с Т/С и С/С генотипами. Оценка влияния генетических факторов на развитие бил парного цирроза печени показала, что больные с билиарным циррозом печени имели более высокую частоту генотипа Т/Т гена IL1 и более низкую встречаемость генотипа С/С гена IL1 [Donaldson P. et al, 2001].
IL-2, являясь основным аутокринным ростовым фактором -Т-лимфоцитов, обеспечивает их клональную экспансию при ответе на антиген [Хаитов P.M., 2001; Корочкина О.В: и соавт., 2003; СимбирцевА.С, 2005]. В соответствии с общими закономерностями иммунопатогенеза персистентных вирусных инфекций важным условием эффективности механизмов защиты макроорганизма от инфекции является интенсивность иммунного ответа, определяемая функциональной активностью Т-лимфоцитов [Соринсон С.Н., 1998; Freeman A.J. et al., 2001].
Анализ распределения частот аллельных вариантов, полиморфизма Т-330G гена IL2 среди пациентов, с длительной персистенцией HCV выявил доминирование гетерозиготного варианта T/G над гомозиготным Т/Т. При этом у HCV-инфицированных лиц частота генотипа Т/Т была достоверно ниже, а варианта T/G, напротив, выше, чем у здоровых индивидов. Это обусловливает повышенную степень риска дальнейшего прогрессирования и неблагоприятного исхода хронического вирусного гепатита С у носителей гетерозиготого T/G генотипа [Наследникова И.О. и соавт., 2007].
Общеизвестно, что две основные группы лимфокинов, продуцируемых соответственно ТЫ- и ТЬ2-лимфоцитами, оказывают положительное взаимное влияние. При этом, обладая выраженными контрвоспалительными свойствами, IL-4 и IL-10 стимулируют преимущественно гуморальное звено иммунитета, способствуя дифференцировке по ТЬ2-пути иммунного ответа [Хаитов P.M., 2001]. IL-4, наряду с другими цитокинами (IL-11 и IL-13), участвует в процессах фиброгенеза, выступая в качестве супрессора протеолитическои коллагеназы, которая в свою очередь влияет на образование коллагена при воспалительных процессах в печени в условиях HCV-инфекции [Ishii Т. et al., 2000].
Склонность к хроническому затяжному течению вирусных инфекций может быть связана с аллельным вариантом С-590Т гена IL4. Рядом авторов была показана ассоциация генотипа Т/Т промоторного региона С-590Т гена IL4 с гиперпродукцией цитокина при инфекции, определяющая быстрое прогрессирование заболевания [Гончарова И.А. и соавт., 2008]. Анализ ассоциированности генотипа клеток, продуцирующих IL-4, и содержания IL-4 в супернатантах культур мононуклеарных лейкоцитов крови у пациентов с длительной персистенцией HCV показал, что генотип Т/Т чаще выявляется среди индивидов с высоким уровнем продукции цитокина [Рязанцева Н.В. и соавт., 2007].
Характеристика обследованных больных
Работа основана на комплексном клинико-лабораторном обследовании 98 пациентов с диагнозом хронический вирусный гепатит С представителей европеоидной популяции, в возрасте от 18 до 56 лет (из них 56 мужчин и 42 женщины). Также в исследовании участвовали 171 здоровый донор, сопоставимые по возрасту и расе (из них 98 мужчин и 73 женщины).
Пациенты находились на диспансерном учете или стационарном лечении в отделении гастроэнтерологии ОГУЗ «Областная клиническая больница» г. Томска (главный врач - М.Н. Закжов, врач гастроэнтеролог -Е.Г. Груздева) и Клинической больницы № 81 ФГУЗ Федерального медико-биологического агентства г. Северска (главный врач - Заслуженный врач РФ, канд. мед. наук, А.И. Маслюк, врач-инфекционист - И.П. Моисееко).
Группа здоровых доноров была набрана в донорском отделении ФГУП НПО «Микроген» МЗ РФ, филиал в г. Томск НПО «Вирион» (зав. отделением - О.Н. Веснина).
Все больные составляли группу риска по инфицированию вирусами гепатита С (в анамнезе — донорство, гемотрансфузии, стоматологические и прочие инвазивные медицинские процедуры, в том числе оперативные вмешательства, а также сексуальные контакты с больными хроническим вирусным гепатитом С, работа с препаратами крови, контакт с инфицированными у медицинских работников). Для всех пациентов установлен приблизительный срок инфицирования, составлявший на момент обследования от 2 до 16 лет. У 80% пациентов длительность заболевания составляла от 8 до 12 лет. Никому из пациентов до обследования противовирусное лечение не проводилось.
Критериями исключения пациентов из исследования являлись острые заболевания любой этиологии, обострения хронического патологического процесса (заболевания желудочно-кишечного тракта, эндокринной, мочеполовой, сердечно-сосудистой системы, ревматические болезни и др.); цирроз печени; гепатоцеллюлярная карцинома; сочетанная патология печени (алкогольная болезнь печени, цирроз любой этиологии, синдром Жильбера, токсическое и аутоиммунное поражение печени и др.); манифестное течение хронических вирусных заболеваний другой этиологии; инъекционная наркомания и злоупотребление алкоголем на момент обследования и в анамнезе.
Диагноз хронического вирусного гепатита устанавливался на основании комплекса данных клинико-лабораторного и инструментального обследования. Анамнестически у всех пациентов были определены срок и источник инфицирования, оценивались жалобы, характер течения заболевания и объективные признаки. Проводился широкий спектр обследований, включая общий и биохимический анализ крови, анализ показателей иммунного статуса. В клинике обследуемые проходили ультрасонографическое исследование органов брюшной полости для исключения сопутствующей патологии, а также сцинтиграфическое исследование печени, выявлявшее умеренное диффузнонеравномерное накопление радиофармпрепарата в паренхиме органа, характерное для воспалительного процесса.
С учетом клинических данных были выделены основные синдромы: астеновегетативный (слабость, повышенная утомляемость, потливость, головная боль, нарушение сна), диспептический (тошнота, изжога, горечь во рту, непереносимость жирной и острой пищи, неустойчивый стул, метеоризм, снижение аппетита), болевой синдром (дискомфорт или болевые ощущения слабой и умеренной интенсивности в правом и левом подреберье, околопупочной области), синдром желтухи (желтушность слизистых, кожи, изменение цвета мочи, кала, кожный зуд), гепатоспленомегалия. Для достоверного обнаружения увеличения размеров печени и селезенки учитывалась совокупность данных объективного обследования, ультрасонографии и сцинтиграфического исследования.
Этиологическая верификация диагноза проводилась определением в крови у пациентов РНК HCV (Hepatitis С virus) с помощью полимеразной цепной реакции, а также серологических маркеров HCV (анти-HCV IgM, анти-HCV IgG, IgG к структурным белкам HCV, IgG к неструктурным белкам NS-3, NS-4, NS-5).
С целью морфологической верификации диагноза и определения степени активности воспалительного процесса с использованием гистологического индекса активности A. Knodell (1981) и стадии фиброза по U. Desmet (1995) всем пациентам проводилась пункционная биопсия печени по Menghini (1958). По данным морфологического анализа полученного биопсийного материала, выделяли слабую активность (4-8 баллов), умеренную активность (9-12 баллов) и высокую активность воспалительного процесса (более 13 баллов).
С учетом биохимических показателей крови у пациентов выявляли синдром цитолиза, который характеризовался увеличением активности аланин-аминотрансфераза (АлАТ) и аспартат-аминотрансфераза (АсАТ) в сыворотке крови, мезенхимально-воспалительный синдром (увеличение СОЭ, тимоловой пробы, повышение уровня у-глобулинов) и синдром холестаза (гипербилирубинемия, повышение активности щелочной фосфатазы, гамма-глутамилтранспептидазы).
Материалом исследования являлись биоптаты печени, полученные при пункционной биопсии (фиксировали нейтральным 10% формалином), а также венозная кровь обследованных лиц, взятая утром до приёма пищи. Кровь стабилизировали ЭДТА.
При морфологическом исследовании биоптатов печени у 53 пациентов была выявлена слабая активность воспалительного процесса, у 27 -умеренная, активность и у 18 - высокая; у 31 больного морфологически определялась I стадия фиброза паренхимы печени, у II человек - 2 стадия, у 40 человек - III стадия процесса.
По данным лабораторного исследования, ведущую роль играл синдром цитолиза - увеличение активности АлАТ в сыворотке крови (66 пациентов -67% ), а также АсАТ (50 пациентов - 51%), при этом коэффициент де Ритиса был больше единицы у 24 пациентов. На второй план выходил мезенхимально-воспалительный синдром - 33,3%. Синдром холестаза, выявляемый лабораторно, соответствовал клиническим проявлениям синдрома желтухи у 10 пациентов (10,2%).
Анализ взаимосвязи между активностью воспаления в печени и носительством вариантных аллелей гена HFE у больных хронической HCV-инфекцией
При оценке частоты встречаемости полиморфных генотипов и аллелей H63D гена НЕЕ в зависимости от активности воспаления печени у больных HCV-инфекцией оказалось, что генотипы Н/Н и D/D встречались чаще у пациентов с высокой степенью активности воспалительного процесса (Н/Н - 72,2%, D/D - 16,7%), однако частота встречаемости генотипа H/D (11,1%) была ниже, чем у пациентов со слабой активностью воспаления печени (Н/Н - 60,4%, D/D - 13,2% и H/D - 26,4%) и умеренной активностью воспалительного процесса (Н/Н - 48,1%, D/D - 11,1% и H/D - 40,8%). Вместе с тем, распределение частоты встречаемости аллелей и генотипов полиморфизма H63D гена HFE показал отсутствие достоверности сравниваемых показателей у больных HCV-инфекцией с различной степенью активности воспалительного процесса в печени (табл. 11).
Примечание:
р - уровень статистической значимости различий параметров между подгруппами больных HCV-инфекцией с различной степень активности воспаления печени;
у2 - стандартный критерий Пирсона для сравнения частот генотипов и аллелей генов.
Анализ полиморфизма C282Y гена HFE не выявил достоверных различий (р 0,05) в частоте распределения генотипов и аллелей у больных хронической HCV-инфекцией в зависимости от степени воспалительного процесса в печени. Частота встречаемости генотипа С/С и аллеля С у пациентов с ГИА воспаления более 13 баллов (94,4%) оказалась выше таковой у больных с ГИА воспаления 4-8 (генотип С/С (88,7%) и аллель С (94,3%)) и 9-12 (генотип СС (74,1%) и аллель С (85,2%)) балла. Напротив, генотипы C/Y, Y/Y и аллель Y у пациентов с умеренной степенью выраженности воспаления печени встречались чаще - 22,2; 3,7 и 14,8%, чем в двух других группах (табл. 12).
Примечание:
р - уровень статистической значимости различий параметров между подгруппами больных HCV-инфекцией с различной степень активности воспаления печени;
%2 — стандартный критерий Пирсона для сравнения частот генотипов и аллелей генов.
Анализ взаимосвязи между прогрессированием фиброза печени и носительством вариантных аллелей гена IL6 у больных хронической HCV-инфекцией
При оценке значения полиморфизма G174C в промоторной области гена IL6 в развитии фиброза были получены статистически не значимые различия частоты встречаемости вариантных аллелей и генотипов гена у больных HCV-инфекцией в зависимости от степени фиброза печени (р 0,05). Так, частота встречаемости генотипа G/G у пациентов со II стадией фиброза составляла 51,9%, у пациентов с I стадией фиброза - 41,9% и с III стадией фиброза - 50,0%. У пациентов со слабовыраженным перипортальным фиброзом гетерозиготный генотип G/C (48,4%) оказался преобладающим по сравнению с пациентами со II (37,0%) и III (37,5%) стадиями фиброза. Гомозиготы по аллелю С незначительно чаще встречались среди больных хронической HCV-инфекцией с III стадией фиброза (12,5%), чем у пациентов с I (9,7%) и II (11,1%) стадиями фиброза.
Частота встречаемости аллеля G у больных со слабовыраженным перипортальным фиброзом, умеренным фиброзом с порто-портальными септами и с выраженным фиброзом составляла 66,1; 70,4 и 68,8%, соответственно. Аллель С у пациентов с хроническим вирусным гепатитом С встречался со следующей частотой: у больных с I стадией - 33,9%, у больных со II стадией - 29,6%, у пациентов с III стадией - 31,2% (табл. 17).
Примечание:
р - уровень статистической значимости различий параметров между подгруппами больных HCV-инфекцией с различной стадией фиброза;
%2 - стандартный критерий Пирсона для сравнения частот генотипов и аллелей генов
Анализ полиморфизма G174C в промоторной области гена IL6 у здоровых людей и больных хронической HCV-инфекцией не выявил достоверных различий в частоте распределения генотипов и аллелей. Не было обнаружено взаимосвязи степени фиброза печени и наличия полиморфного варианта в промоторной области гена IL6.
Выявлена зависимость носительства генотипа G/G полиморфного варианта G174C промоторного региона гена IL6 и более выраженной активности воспалительного процесса в печени при хронической HCV-инфекции.
