Введение к работе
Актуальность проблемы
Исследование механизмов церебральных патологий продолжает оставаться актуальной задачей, без решения которой невозможно патогенетическое обоснование лечебных мероприятий. К важнейшим системам, нарушения которых играют существенную роль в патогенезе практически всех церебральных патологий, относятся система оксида азота (N0) и протеолитические системы. Несмотря на различия в функциях, обе системы принимают участие как в нормальной пластичности мозга, обеспечивая динамическое равновесие сигнальных и модифицирующих белки стимулов, так и в механизмах патологических изменений в ЦНС при нейродегенеративных заболеваниях и других патологиях мозга.
Функционирование нитрергической системы в мозге при физиологических условиях обеспечивают две Са /кальмодулин-зависимые изоформы NO-синтазы, которые присутствуют в эндотелиальных клетках (эЖ)С, III тип NOC) и нейронах (hNOC, і тип NOC). NO, генерируемый эЖ)С, необходим для контроля мозгового кровотока, тогда как N0 синтезируемый hNOC функционирует также как нейротрансмиттер, модулирует нейроэндокринные функции, память и поведение (Szabo, 1996; Guix et al., 2005). При различных патологических условиях, включая нейродегенеративные заболевания и ишемию мозга, большие количества N0 синтезируются индуцибельной NOC (hNOC, II тип NOC), экспрессия которой повышается в ответ на локальное усиление биосинтеза провоспалительных цитокинов и связана с повреждающим действием N0. Экспрессия hNOC выявлена в инфильтрующих мозг фагоцитах, эндотелии сосудов и глиальных клетках - астроцитах, олигодендроцитах и микроглии (Bachschmid et al., 2005; Moncada and Bolanos, 2006).
Среди основных групп протеаз, регулирующих физиологические функции в головном мозге, выделяют группу цистеиновых протеаз, к которой относятся три семейства - каспазы, калпаина и папаина (Chwieralski et al., 2006). Протеазы этой группы присутствуют во всех типах клеток ЦНС, локализуются в различных компартментах клетки и принимают участие в расщеплении разнообразных субстратов при физиологических стимулах и в процессе повреждения и гибели клеток. К важнейшим цистеиновым протеазам из этих семейств относятся каспаза-3, калпаин и катепсин В.
Согласно одной из классификаций, каспазы, расщепляющие пептидную связь у остатка аспартата в белках, подразделяют на активаторные, провоспалительные и эффекторные (Liu et al., 1996; Orth et al., 1996; Muzio et al., 1997; Thornberry et al., 1997). Каспаза-3 относится к эффекторным каспазам и ее считают фактором терминальной стадии апоптотической гибели нервных и глиальных клеток (Nunez, 1998, Yuan, Yankner, 2000, Timmer, Salvesen, 2007). Каспаза-3 синтезируется в виде неактивного профермента (32 kDa), в результате протеолитического расщепления которого образуется активная протеаза (12 kDa и 17 kDa).
4 Наряду с апоптотическими функциями, каспаза-3 может принимать участие и в
физиологических событиях, например, в регуляции клеточного цикла, пролиферации,
дифференцировке, а также пластических перестройках клеток мозга (Cohen, 1997; Concha and
Abdel-Meguid, 2002; Гуляева, 2003).
Калпаин - нейтральная цистеиновая протеаза, которая активируется кальцием. В
головном мозге экспрессируется две изоформы калпаина ц-калпаин и m-калпаин, каждая из
которых состоит из каталитической субъединицы (80 kDa) и регуляторной субъединицы (28
9+
Ша) (Bevers and Neumar, 2008). Повышение внутриклеточной концентрации свободного Са выше пороговой величины, специфичной для каждой изоформы (~1 цМ для ц-калпаина и ~1
9+
тМ для т-калпаина), приводит к связыванию Са , конформационным изменениям, аутолизу обеих субъединиц и активации калпаина (Hosfield et al., 1999). В результате кратковременной активации калпаины принимают участие в физиологических функциях, осуществляя частичный
9+
протеолиз субстратов, таких как структурные белки, Са -регулируемые и сигнальные белки (Goll et al., 2003). Однако повышенная активация калпаина наблюдается на ранних этапах экзайтотоксического повреждения нейронов (Siman et al., 1989; Faddis et al., 1997) и задействована в реализации апоптотической гибели клеток (Nath et al., 1996; Squier et al.,1999). В процессе апоптоза и гипоксии-ишемии мозга каспаза-3 может расщеплять эндогенный ингибитор калпаина калпастатин (Blomgren et al., 1999; Wang, 2000). Показано, что калпаин расщепляет профермент и активирует каспазу-3 после воздействия майтотоксина и кислородно-глюкозной депривации (КГД) кортикальных культур (McGinnis, 1999; Malagelada, 2005).
Катепсины - кислые эндопептидазы семейства папаиновых протеаз (Turk et al., 1997). Катепсины локализуются преимущественно в лизосомах, где они принимают участие в деградации белков до аминокислот при кислых значениях рН (Kirschke et al., 1980). Катепсины В и L являются основными лизосомальными цистеиновыми протеазами в ЦНС и экспрессируются как в нейронах, так и в глии (Yamashima, 2000). Различные патологические ситуации, в том числе ишемия мозга, приводят к высвобождению катепсинов в цитоплазму клетки, а избыточная активность этих протеаз вызывает повреждение и гибель клеток (Boya et al., 2003). Катепсин В принимает участие в различных видах клеточной смерти, в частности, влияя на активность других цистеиновых протеиназ, в том числе провоспалительных и эффекторных каспаз (Kingham and Pocock, 2001; Benchoua et al., 2004). Калпаин-катепсиновая гипотеза гибели клетки основывается на том факте, что активированный эксайтотоксичным стимулом калпаин повреждает лизосомы и обеспечивает выход в цитозоль клетки лизосомальных протеаз, включая катепсин В, с последующим расщеплением клеточных белков и гибелью клетки по некротическому пути (Yamashima, 1998; Yamashima, 2003).
Взаимодействие нитрергической и протеолитических систем во многом определяется плейотропными эффектами NO и реактивными формами азота (РФА), которые индуцируют как
5 некротическую, так и апоптотическую гибель клеток в зависимости от интенсивности
токсического воздействия (Bonfoco et al., 1995). NO и пероксинитрит могут индуцировать
каспазо-зависимую и/или калпаин-опосредованную клеточную гибель с участием различных
механизмов (Zhang et al., 2004; Takadera et al., 2004; Moncada and Balanos, 2006; Kawano et al.,
2006; Kosuge et al., 2008). Так NO индуцирует каспазо-опосредованную гибель клеток через
высвобождение из митохондрий цитохрома С и активацию каспазы-9, повышение экспрессии
р53, активацию митоген-активируемых протеинкиназ и изменение экспрессии белков,
регулирующих апоптоз, в том числе из семейства Bcl-2 (Choi et al., 2002; Moncada and Balanos,
2006). NO индуцирует также каспазо-независимую гибель посредством активации калпаина,
стимуляции высвобождения возбуждающих аминокислот и активных форм кислорода (АФК),
повышения внутриклеточной концентрации ионов кальция и нарушения функционирования
митохондрий (Prast and Philippu, 2001; Choi et al., 2002; Moncada and Balanos, 2006). Действие
ингибиторов изоформ NOC подтверждает активирующий эффект NO и его производных на
калпаин и каспазу-3 (Dingman et al., 2006; Sun et al., 2009).
С другой стороны, присутствие цистеина в активном центре протеаз делает их уязвимыми для NO, поскольку тиолы чувствительны к окислительно-восстановительным модификациям и могут подвергаться S-нитрозилированию. В исследованиях in vivo и in vitro продемонстрирована способность NO нитрозилировать тиолы в активном центре каспаз и ингибировать их протеолитическую активность (Li et al., 1997; Kim et al., 1997, 2000; Rossig et al., 1999; Torek et al., 2002). Также NO ингибирует активность катепсина В, папаина и калпаина через S-нитрозилирование остатков цистеина в активном центре протеаз (Stamler et al., 1992; Venturini et al., 1998; Koh and Tidball, 2000). Считают, что присутствие в клетке Fe-S комплексов является критическим фактором для опосредованного NO S-нитрозилирования in vivo (Kim et al., 1998, 2000). Таким образом, NO может выступать в качестве общей регуляторной молекулы для цистеиновых протеаз.
Воздействие протеаз на нитрергическую систему проявляется в протеолитическом расщеплении изоформ NOC. Известно, что ковалентно модифицированная hNOC подвергается убиквитинилированию и протеосомальной деградации (Bender et al., 2000; Noguchi et al., 2000). Однако и избыточная активация калпаина приводит к расщеплению всех трех изоформ NOC -hNOC, эЖ)С и hNOC (Osawa et al., 2003; Копе et al., 2003; Stalker et al., 2005).
Дисрегуляция продукции и/или метаболизма NO и РФА, которая происходит при нитрозативном стрессе, может повлечь за собой модификацию структуры и функций белков, нарушение внутриклеточного сигналлинга, повреждение и гибель клеток. NO реагирует с супероксидным анионом с образованием сильного окислителя пероксинитрита, который участвует в нитровании остатков тирозина в белках (Gow et al., 1996). hNOC и hNOC играют доминирующую роль в образовании нитротирозина в мозге на разных стадиях ишемии и
реперфузии (Eliasson et al., 1999; Hirabayashi et al., 2000). Присутствие нитрованных белков и пептидов может активировать иммунную систему и продукцию иммуноглобулинов, специфически распознающих нитротирозин (Ischiropoulos, 2009). Наряду с нитрозативным стресом происходит интенсификация окислительного стресса, который является общим знаменателем для многих церебральных патологий, в том числе ишемии мозга и нейродегенеративных заболеваний (Sayre et al., 2008).
Наличие стимулов, которые ведут к усиленной продукции NO, может быть причиной повреждений нейронов. Примером этого является глутаматная токсичность (Lipton et al., 1993). Показано, что Р-амилоидный пептид (Ар) действует синергично с глутаматом, вызывая повреждение нейронов по NO-зависимому пути (Aksenov et al.; 1995; Le et al., 1995; Noda et al., 1999; Yang et al.,1998) и индуцирует окислительный стресс (Miranda et al., 2000; Varadarajan et al., 2000). Однако изменения NOC при болезни Альцгеймера (БА) неоднозначны, а имеющиеся на этот счет данные очень противоречивы (Dorheim et al., 1994; Thorns et al., 1998; Tohgi et al., 1998; Tao et al., 1999; Yew et al., 1999; Gargiulo et al., 2000).
Эксайтотоксичность глутамата играет важную роль и в патогенезе эпилепсии. Ранние исследования свидетельствуют о том, что продукция NO повышается в результате активации hNOC глутаматом после введения пентилентетразола (PTZ) (Endoh et al., 1994; Garthwaite and Boulton, 1995) и инъекции ингибиторов биосинтеза NO снижают чувствительность к индуцированным PTZ судорогам (Kaneko et al., 2002; Itoh et al., 2004). Тем не менее, NO проявляет и антиконвульсантный эффект при судорогах, индуцированных каинатом (Przegalinski et al., 1994), а-гуанидиноглутаровой кислоты (Yokoi et al., 1994) и NMD A (Buisson et al., 1993). На различных моделях судорожной активности было выявлено повышение экспрессии и активности каспазы-3 (Gillardon et al., 1997; Faherty et al., 1999; Ferrer et al., 2000; Henshall et al., 2000), а ингибитор каспазы-3 z-DEVD-fmk снижал индуцированную судорогами гибель нейронов (Henshall et al., 2000; Kondratyev and Gale, 2000). Остается малоизученной проблема взаимодействия нитрергической системы и каспазы-3 в механизмах церебрального повреждения после судорог, индуцированных PTZ.
Механизмы развития стрессорной реакции и ишемического повреждения мозга имеют много общих звеньев. Активация гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы, которая задействована в реакции на стресс, является одним из первых физиологических ответов на церебральную ишемию, которая приводит к длительному повышению в крови концентрации глюкокортикоидов (Getz et al., 1981; Olsson, 1990; Fassbender et al., 1994; Johansson et al., 1997). Нейротоксические эффекты стресса связаны также с повышением внеклеточного уровня возбуждающих аминокислот, в первую очередь глутамата, модуляцией активности и экспрессией изоформ NOC (Moghaddam, 1993; Olivenza et al., 2000). В научной литературе
7 практически отсутствуют данные о роли цистеиновых протеаз, таких как калпаин, катепсин В
и каспаза-3, в нейродегенерации, вызванной хроническим стрессом.
Гибернация является уникальной физиологической адаптацией к изменяющимся условиям окружающей среды. Несмотря на то, что мозговое кровообращение кардинально изменяется на стадиях гибернационного цикла, проявляя схожесть с ишемией/реоксигенацией, повреждения мозга не происходит (Lust et al, 1989; Frerichs et al, 1994; Ma et al, 2005). В мозге гибернирующих животных выявлены сезонные изменения эндогенных регуляторов гибернации, таких как серотонин, катехоламины, нейропептиды и гормоны (Popova et al., 1993; Nurnberger, 1995; Gui et al., 1996), однако исследования роли нитрергической системы в таком природном механизме адаптации практически отсутствуют. Существенное снижение температуры тела, кровообращения в мозге и нейрональной активности во время спячки сопровождается изменениями в микроструктуре нейронов (Popov et al., 1992; von der Ohe et al., 2006). Причем вхождение в спячку сопровождается 50-65% потерей синапсов, не связанной с деградацией синаптических белков, а, как предполагают авторы исследования, связанной с их диссоциацией из синапса в аксон, тело нейрона или дендрит во время вхождения в спячку, их пребыванием там во время спячки и быстрым реструктурированием синапсов во время выхода из спячки (von der Ohe et al., 2007). Однако нейроны, подверженные апоптотической гибели, проявляют ретракцию дендритов похожую, как и у нейронов, гибернирующих животных. В подобные структурные и функциональные изменения как правило вовлечены протеолитические ферменты, а роль каспазы-3 участвующей как в апоптозе, так и в реализации нейрональной пластичности, остается практически не изученной при гибернации.
Таким образом, сравнительное исследование нитрергической и протеолитической систем с использованием моделей церебральных патологий способствует комплексному пониманию механизмов этих патологий на примере взаимодействия ключевых систем, обеспечивающих нейрональную пластичность и ответственных за повреждение и гибель клеток.
Цель работы и основные задачи исследования
Основной целью данной работы явилось исследование состояния нитрергической системы и системы цистеиновых протеаз при экспериментальных и клинических церебральных патологиях. Для сравнения была использована модель гибернации как модель естественного (сезонного) изменения нейропластичности. Были поставлены следующие задачи:
Исследовать показатели нитрергической системы, иммунный ответ и модуляцию активности цистеиновых протеаз в спинномозговой жидкости (СМЖ) больных в острый период инсульта.
Исследовать показатели нитрергической системы, иммунный ответ и активность цистеиновых протеаз в мозге и СМЖ на модели фокальной ишемии мозга у крыс.
3. Исследовать продукцию метаболитов N0 и интенсивность гибели клеток в
нейроглиальных культурах и переживающих срезах мозга крыс на модели кислородно-глюкозной депривации (ишемия/реоксигенация).
Исследовать влияние окислительного стресса на активность NOC на модели фокальной или глобальной ишемии мозга, после введения нейротоксина AF64A, после введения Р-амилоидного пептида (25-35), а также при непосредственном действии окислителей in vitro.
Исследовать соотношение активности NOC и активности каспазы-3 при физиологических состояниях (гибернационный цикл) и патологических воздействиях (PTZ-индуцированные судороги).
Исследовать состояние нитрергическои и протеолитическои систем на различных моделях стресса.
Научная новизна
В работе впервые проведено систематическое исследование биохимических показателей, характеризующих состояние нитрергическои и протеолитическои систем мозга при моделировании различных патологических процессов, а также с использованием клинического материала.
У больных впервые выявлено появление активности NOC в СМЖ в острый период после ишемического и геморрагического типов инсульта, а также увеличение иммунной реакции на нитрованные белки в этот период.
Впервые показана способность СМЖ контрольной группы пациентов модулировать активность цистеиновых протеаз - калпаина, каспазы-3 и катепсина В, тогда как для СМЖ больных после инсульта выявлены существенные изменения в степени активации или ингибирования протеаз.
На моделях постреанимационной патологии и болезни Альцгеймера (введение холинотоксина AF64A) впервые продемонстрировано, что усиление окислительного стресса сопровождается снижением активности NOC, а в экспериментах in vitro впервые установлено, что окислители вызывают дозозависимое ингибирование активности NOC в гомогенатах коры больших полушарий.
Установлено, что разные типы стресса оказывают разнонаправленное влияние на активность NOC. Более интенсивный стресс, хронический эмоционально-болевой стресс, способствует снижению активности NOC в коре больших полушарий и мозжечке крыс, тогда как умеренный вариант, такой как ранняя социальная изоляция, приводит к активации NOC в отделах мозга цыплят и в коре мозга и гиппокампе крыс.
9 Впервые обнаружена активация катепсина В и ингибирование активности калпаина и
каспазы-3 в коре мозга и гиппокампе крыс в результате хронического эмоционально-болевого
стресса.
Впервые удалось выявить секрецию катепсина В нейроглиальными и глиальными культурами мозжечка крысы при метаболическом стрессе, индуцированном заменой культуральной среды на солевой раствор.
Впервые установлено, что при кислых значениях рН катепсин В проявляет способность расщеплять субстрат каспазы-3.
При различных функциональных состояниях мозга в гибернационном цикле сусликов впервые обнаружена активация NOC и каспазы-3 на разных стадиях цикла, а именно на стадии пробуждения и на стадии спячки соответственно. Теоретическая и практическая значимость
Полученные в настоящей работе результаты расширяют представление о возможной связи между генерацией оксида азота и свободнорадикальными механизмами развития постреанимационной патологии и холинергической нейродегенерации, вызванной введением холинотоксина AF64A или РА(25-35).
Ингибирование активности NOC активными формами кислорода и/или продуктами
свободнорадикального окисления обусловливает непреходящую актуальность применения
антиоксидантной терапии для предотвращения повреждающего действия
свободнорадикального окисления и создания дефицита N0 в мозге.
Появление иммуноглобулинов в поврежденных ишемией участках мозга, а также наличие иммунной реакции на продукты нитрозативного стресса, индуцированного инсультом, расширяют представление о системах организма, задействованных в механизмах этой патологии, а также ставят вопрос о способах терапевтического воздействия, которые включают в том числе и коррекцию иммуного ответа.
Выявленные в настоящем исследовании перекрестные эффекты ингибиторов цистеиновых протеаз, играющих ключевую роль в развитии церебральных патологий, характеризуют применение ингибиторов в клинической области достаточно проблематичным и предопределяют, наряду с получением более специфических ингибиторов, масштабную проверку их селективности. Положения выносимые на защиту
1. Изменения состояния нитрергической и протеолитической систем при церебральных патологиях и их моделировании на животных отражают участие этих систем в патогенезе (в т.ч. нейродегенерации) и адаптивном ответе мозга. Регион-специфичная и постадийная модуляция продукции N0, активности NOC и цистеиновых протеаз в мозге происходит при нейродегенерации, вызванной ишемией, судорожной активностью, введением холинотоксина
10 AF64A, Р-амилоидного пептида, а также при стрессорных воздействия различного типа и
интенсивности, сезонной нейропластичности - гибернации.
2. Степень деструктивных последствий в острый период инсульта определяется типом
инсульта, участием и взаимодействием нитрергической, протеолитической и иммунной систем.
Развитие нитрозативного стресса в мозге сопровождается индукцией иммунного ответа,
появлением аутоантител к нитрованным белкам и изменением соотношения
активаторов/ингибиторов цистеиновых протеаз в ликворе.
3. Ацидоз (в частности, при ишемии) приводит к расширению субстратной
специфичности катепсина В мозга (появлению способности расщеплять субстраты каспазы-3), а
метаболический стресс стимулирует секрецию катепсина В из нейронов и глии.
Апробация работы
Основные результаты диссертации доложены на 1-м региональном конгрессе FAONS (Патайя, 1996), 1-м Российском конгрессе по патофизиологии (Москва, 1996), XXXIII Международном конгрессе физиологических обществ (Санкт-Петербург, 1997), 12-м съезде Европейского нейрохимического общества (Санкт-Петербург, 1998), конференции «Свободнорадикальные процессы: экологические, фармакологические и клинические аспекты» (Санкт-Петербург, 1999), XXX Всероссийском Совещании по проблемам высшей нервной деятельности (Санкт-Петербург, 2000), 15, 17 Съездах Европейского нейрохимического общества «Достижения в изучении молекулярных механизмов неврологических заболеваний» (Варшава, 2003; Саламанка, 2007), ХІХ-ХХІ Съездах Физиологического общества им. И.П. Павлова при РАН (Екатеринбург, 2004; Москва, 2007; Калуга, 2010), I Съезде РНО «Нейрохимия: фундаментальные и прикладные аспекты» (Москва, 2005), 20 Съезде Международного нейрохимического общества (Инсбрук, 2005), 6 и 7 Европейских Форумах по нейронаукам (Женева, 2008; Амстердам, 2010) и апробированы на межлабораторной конференции ИВНДиНФ РАН. Объем и структура диссертации
Диссертация содержит следующие основные разделы: введение, обзор данных литератры, главы результатов собственных исследований и их обсуждение, заключение, выводы и библиографический указатель, включающий работы на русском (6) и иностранных (698) языках. Диссертация изложена на 261 страницах машинописного текста и содержит 3 таблицы и 37 рисунков.
