Введение к работе
Актуальность проблемы
Химио- и радиорезистентность злокачественных новообразований на проводимую терапию остается одной из наиболее актуальных проблем современной клинической и экспериментальной онкологии. Особое место в этой проблеме занимает не только изначально существующая резистентность опухолевых клеток, но также их способность приобретать устойчивость к противоопухолевым агентам в процессе лечения (В. А. Зинченко и соавт., 2005). Во многом, это обусловлено тем фактом, что опухолевые клетки способны «переживать» повреждения ДНК (т.е. генотоксический стресс), возникающие в результате воздействия химиопрепаратов и/или лучевой терапии (H.L. Tang et al., 2012). Это достигается в результате запуска в опухолевых клетках различных механизмов репарации поврежденных участков ДНК, в частности, за счет активации процессов гомологичной и негомологичной рекомбинации ДНК (A.J. Hartlerode et al., 2009; S.P. Jackson 2009; B. Pardo et al., 2009). Результатом этого является повышение выживаемости опухолевых клеток, что клинически проявляется неуклонным ростом опухолевой массы и клиническим прогрессированием заболевания, несмотря на проводимую химио- и радиотерапию. Осложняет положение и генетическая нестабильность опухолевых клеток, которые, имея высокий уровень спонтанных мутаций, легко подвергаются мутагенному воздействию химиопрепаратов и продуктов их метаболизма (C. Lengauer et al., 1998). Это в значительной мере усиливает гетерогенность опухолевой популяции, способствует генерации еще большего числа резистентных к химиотерапии опухолевых клеток, усиливает их способность к метастазированию и возникновению рецидивов на фоне продолжающейся химиотерапии (G.I. Solyanik et al., 2000).
В сложившейся ситуации продолжение проведения химио- и радиотерапии не только не способствует улучшению состояния больных злокачественными новообразованиями, но и приводит к развитию побочных эффектов, обусловленных выраженными цитотоксическими свойствами большинства современных химиопрепаратов.
В настоящее время широкое распространение получил «персонализированный подход» терапии многих заболеваний, в том числе и злокачественных новообразований, который базируется на особенностях возникновения и патогенеза заболевания отдельно взятого организма или небольшой группы. Это позволяет подобрать наиболее эффективную терапию пациенту с конкретным новообразованием, основываясь на генетическом анализе опухоли и уровне экспрессии «особых» белков. Одним из перспективных направлений в обеспечении повышения эффективности нехирургических методов лечения онкологических больных является разработка методов оценки и повышения чувствительности опухолевых клеток к проводимой химиотерапии, которые базируются на использовании дефектов в системе репарации повреждений ДНК для достижения наиболее результативного противоопухолевого эффекта.
Установлено, что дефекты в системе гомологичной рекомбинации ДНК с одной стороны являются предрасполагающим фактором в возникновении злокачественных новообразований. С другой стороны, онкологические больные, имеющие таковые дефекты, являются наиболее восприимчивыми к воздействию определенных групп цитотоксических препаратов по причине существующих дефектов в системе репарации повреждений ДНК в опухолевых клетках, возникающих в результате проведения химиотерапии. Данный феномен нашел отражение в концепции «синтетической летальности», согласно которой наличие мутации в одном из двух «летальных» генов никак не отражается на жизнедеятельности клеток, однако мутации в обоих «летальных» генах приводят к гибели этих клеток (W.G. Jr. Kaelin, 2005). В соответствии с данной концепцией, химиопрепараты, разработанные по данному принципу, должны вызывать гибель исключительно раковых клеток, имеющие мутации в таковых «летальных генах».
Наиболее перспективным примером использования данной концепции в терапии злокачественных новообразований является монотерапия препаратами ингибиторами PARP (поли(АДФ-рибоза)-полимеразы) пациентов с мутациями генов BRCA-1 и BRCA-2. Данная группа имеет высокую чувствительность к ингибиторам PARP за счет подавления процессов гомологичной рекомбинации повреждений ДНК (H.E. Bryant et al., 2005; S. Burma et al., 2001).
Дальнейшие исследования показали, что дефекты в системе гомологичной рекомбинации встречаются гораздо чаще и обнаруживаются у больных злокачественными новообразованиями (Q. Wei et al., 2000).
Особое внимание следует уделить белкам-онкосупрессорам, которые участвуют в процессах гомологичной рекомбинации. Так, белок PML является одним из многофункциональных белков ядра, принимающим участие в транскрипции генов, противовирусном ответе, онкогенезе, клеточном старении, регуляции апоптоза и репарации ДНК (R. Bernardi et al., 2007).
Исследования, проведенные ранее, демонстрируют, что PML взаимодействует со многими факторам вовлеченными в репарацию двунитевых разрывов по механизму гомологичной рекомбинации, в том числе и RAD51 (S. Boichuk et al., 2011). Таким образом, изучение взаимосвязи вышеперечисленных белков и их роли в репарации ДНК, а также формировании химиочувствительности опухолевых клеток, является актуальным и перспективным направлением в фундаментальной онкологии.
Цель исследования
Изучить роль белков PARP и PML в механизмах репарации повреждений ДНК в условиях генотоксического стресса, вызываемого химиопрепаратами.
Задачи исследования:
-
Произвести нокдаун белков PML и PARP методом РНК-интерференции и оценить жизнеспособность клеток на фоне «выключения» экспрессии вышеназванных белков.
-
Исследовать взаимосвязь между экспрессией белка PML и активностью поли(АДФ-рибоза)-полимераз (PARP) в физиологических условиях, а также в условиях генотоксического стресса, вызываемого химиопрепаратами.
-
Охарактеризовать роль белков PML и PARP в репарации повреждений ДНК, а также жизнеспособность нормальных и опухолевых клеток в условиях генотоксического стресса.
-
Изучить способность белка PML регулировать процессы клеточного старения в ответ на генотоксический стресс, индуцированный химиопрепаратами.
Научная новизна исследования:
В рамках проведенной диссертационной работы впервые получены данные о повышении активности поли(АДФ-рибоза)-полимераз (PARP) в условиях генотоксического стресса и нокдауна белка PML. Полученные данные о нарушениях процессов репарации некоторых типов повреждений ДНК, а именно, ее двунитевых разрывов, в условиях сочетанного нокдауна белков PARP и PML, также получены впервые. Представленные в настоящей работе данные раскрывают новые молекулярные механизмы репарации двунитевых разрывов ДНК в опухолевых клетках и открывают перспективы для повышения чувствительности опухолевых клеток к воздействию генотоксических факторов, а именно, химиопрепаратов. Полученные данные дополняют современные представления о молекулярных механизмах феномена “синтетической летальности” и подтверждают координирующую роль белка PML в репарации двунитевых разрывов ДНК по механизму гомологичной рекомбинации. В настоящее работе впервые была проведена комплексная оценка жизнеспособности нормальных и опухолевых клеток на фоне единичного и комбинированного нокдауна вышеназванных белков, как в физиологических условиях, так и на фоне генотоксического стресса, индуцированного химиопрепаратами. Получены новые данные, свидетельствующие о координирующей роли белка PML в механизмах старения опухолевых клеток на фоне генотоксического стресса, вызываемого химиопрепаратами. Было также показано, что PML-опосредованное развитие данного процесса является исключительно специфичным для опухолевых клеток.
Теоретическая и практическая значимость
Результаты проведенного исследования позволяют углубить современные представления о роли белков PML и PARP в механизмах репарации повреждений ДНК. В работе показано, что белок PML является одним из ключевых для реализации механизма репарации двунитевых разрывов ДНК.
Экспериментальные данные свидетельствуют, что активность PARP в клетках с нокдауном белка PML повышается в условиях повреждения ДНК, вызванного генотоксическими агентами. Полученные результаты имеют большое научно-практическое значение как с точки зрения понимания молекулярных механизмов репарации повреждений ДНК, вызываемых химиопрепаратами, так и с точки зрения перспектив разработки новых стратегий терапии злокачественных новообразований (в частности, для использования химиопрепаратов – ингибиторов PARP).
Методика проведения сочетанного нокдауна белков PML и PARP-1 в дальнейшем может быть использована для изучения молекулярных механизмов «синтетической летальности» и сенсибилизации опухолевых клеток к химиопрепаратам.
Материалы диссертации могут быть использованы патофизиологами, биохимиками: а) в учебном процессе для преподавания раздела «Патогенез опухолевого роста», «Химия белков и нуклеиновых кислот»; б) в научной работе – для дальнейшего изучения механизмов репарации повреждений ДНК.
Методы исследования
В работе использовался ряд современных методов патофизиологии, биохимии и молекулярной биологии: культивирование клеточных линий, иммуноблоттинг, иммунофлуоресцентный метод, фотоколориметрический метод, методы световой и иммунофлюоресцентной микроскопии.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту
-
Белки PML и PARP-1 вовлечены в процессы репарации повреждений ДНК, а их «выключение» повышает чувствительность клеток к генотоксическим факторам, вызывающим двунитевые разрывы ДНК.
-
Белок PML регулирует процессы клеточного старения при генотоксическом стрессе, вызываемом химиопрепаратами.
Апробация работы
Материалы диссертации доложены и обсуждены на: научно-практических конференциях молодых ученых Казанского государственного медицинского университета (Казань, 2012 г.), Всероссийской конференции «Здоровье в XXI веке» (Казань, 2012 г.), Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов-2013» (Москва, 2013 г.). Всероссийской конференции «Петровские чтения – 2014» (Санкт-Петербург, 2014 г.).
Личный вклад соискателя
При непосредственном участии автора была выбрана тема, составлена программа, определены этапы диссертационной работы, проведен анализ научной литературы по изучаемой проблеме. Автором выполнены экспериментальные исследования на всех этапах диссертационной работы. Автором проведена статистическая обработка, группировка, анализ результатов, интерпретированы полученные данные. Формулирование выводов, рекомендаций, положений, выносимых на защиту, происходило при непосредственном участии автора работы.
Структура и объем диссертации
Диссертационная работа состоит из введения, 4 глав (обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты собственных исследований, обсуждение полученных результатов), выводов, практических рекомендаций, списка литературы, содержащего 264 источника, из которых 263 зарубежных авторов. Работа изложена на 124 страницах машинописного текста, иллюстрирована 2 таблицами и 23 рисунками.
