Введение к работе
Актуальность темы. С середины XX века сформировалась концепция, что все органы и ткани млекопитающих и человека способны к физиологической и репаративной регенерации [Полежаев Л.В., 1968; Саркисов Д.С., 1970]. Поддержание общей численности (физиологический гомеостаз) клеток в здоровом органе является универсальным механизмом. Показано, что каждый орган имеет свой автоматический ритм обновлений (около 7 дней для полного обновления кишечного эпителия, несколько месяцев - эндотелия артерий, 4-8 месяцев - миофибрилл в мышечном волокне, 4-6 месяцев - гепатоцитов в ацинусе, несколько лет - гиппокампа головного мозга). Однако полноценная регенерация поврежденных взрослых тканей при разной патологии часто невозможна. Остаётся неизвестным, почему при средних и крупных повреждениях дефинитивных тканей не мобилизуются и не принимают участие в репарации собственные запасы региональных стволовых клеток (РСК), а наблюдается патологическая репарация (фиброз) в ответ на повреждение.
Атеросклеротическая фиброзная бляшка - характерный пример патологической репарации, запускаемой активированной соединительной тканью сосуда [Versari D. et al, 2007; Shantsila E. et al, 2007]. Другой пример патологической репарации - это острый или хронический цирроз печени, при котором стромальные клетки синусоидов инициируют фиброз в виде активно пролиферирующей рубцовой ткани из матрикса и миофибробластов. Это ведет к формированию портальной гипертензии и печеночной недостаточности [Schuppan D., 2008; Atzori L. et al, 2009]. Различные повреждения миокарда ведут к активации интерстициальных фибробластов, формированию избытка фиброзной ткани, кардиосклерозу, что множественными путями снижает функциональные характеристики миокарда [Weber К. et al., 1989]. Нервная ткань в ответ на повреждение также формирует глиальный рубец. Однако патогистологическое исследование тканей не дает ответа на вопрос о путях и механизмах правильной клеточной репарации.
Изучение репарации повреждений тканей и органов в норме и при патологии требует разработки новых клеточных моделей in vitro.
Сравнительно недавно эксплантаты поврежденной соматической ткани, а также 2D/3D культуры с модельными дефектами стали использовать для изучения вклада локального эпителия и мезенхимы, а также локальных и циркулирующих стволовых клеток в репаративные процессы. Накопленные предварительные данные показали множественные механизмы и пути участия
соматических и стволовых клеток в репарации повреждений. Остается актуальным вопрос, почему эпителио-стромальные резервы тканей и органов взрослых организмов не участвуют в формировании полноценной регенеративной ткани без фиброза.
В последнее время показано, что локальная и системная трансплантация мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) ускоряет процессы репарации в поврежденных органах и тканях. Например, трансплантация ММСК, выделенных из костного мозга, в зону глубокого кожного повреждения блокировало избыточный фиброз и формирование рубца в очаге повреждения [Smith A.N. et al, 2009; Falanga V., 2009]. Введение ММСК в системный кровоток блокировало формирование мелких и средних хронических повреждений эндотелия и стимулировало реэндотелизацию крупных повреждений [Devanesan A.I. et al., 2009]. Трансплантация ММСК оказалась эффективной при лечении хронической и подострой печеночной недостаточности и сахарного диабета I и II типа [Онищенко Н.А. с соав., 2009]. Однако до сих пор остаются не изученными механизмы репарационных эффектов ММСК в органах при разной патологии.
Показано, что ММСК направленно находят мелкие и средние повреждения in vivo [Anjos-Afonco F. et al, 2004], что указывает на возможность их участия в клеточной репарации [Kopen J.C. et al., 1999; Ortiz L.A. et al., 2003]. В зоне повреждения разных соматических тканей ММСК пролиферировали и дифференцировались в разных направлениях под влиянием локальных сигналов микроокружения [Devine S.M. et al., 2003]. Однако остается неизученным, могут ли ММСК влиять на равновесие и границы между эпителием и стромой органа, снимать блок реэпителизации, запускать процессы репаративной регенерации и каков вероятный механизм этого процесса. Первые результаты исследований в этом направлении показали, что циркулирующие в кровотоке ММСК с высокой эффективностью опознавали мелкие эпителиальные повреждения, адгезировались в данной зоне, приобретая эпителиальный статус, и участвовали в репарации [Prockop D.J., 2009; Syn W.K. et al., 2009].
Разрабатываемая в нашей лаборатории концепция пластичности ММСК дала основание предположить, что эти клетки in vitro и in vivo формируют модули с клетками, находящимися в двух устойчивых эпигенетических состояниях [Репин B.C. и др. 2006; Сабурина И.Н. и др. 2009]. Согласно этой гипотезе, пластичные эпителио-мезенхимальные сфероиды (ЭМ-сфероиды) служат донорами эпителия/стромы в зонах повреждения, когда процесс реэпителизации ограничен.
Исследование образования эпителио-мезенхимальных сфероидов in vitro открывает новую модель для изучения эпителио-мезенхимальнои пластичности клеток и дает возможность с новых позиций изучать клеточные механизмы 3D репарации поврежденных органов и тканей, что представляется актуальным, научно и практически значимым.
Цель исследования. Изучить эпителио-мезенхимальную пластичность ММСК в 2D/3D культуре диссоциированных клеток и культуре эксплантатов фетальной и взрослой ткани и их вклад в репаративные процессы при повреждении эпителио-стромальных тканей в условиях эксперимента.
Задачи исследования.
-
Изучить формирование репаративных сфероидов в культуре миниэксплантатов фетальных тканей (головного мозга, миофибрилл, слизистой оболочки тонкой кишки, сетчатки) и органов взрослого организма (миофибрилл, тонкой кишки, сетчатки).
-
Получить и изучить сфероиды из первичных диссоциированных культур здоровых органов и тканей (стромальных клеток жировой ткани, пупочного канатика, сетчатки, миобластов). Изучить индуктивную роль поврежденных миниэксплантатов в 3D культуре.
-
Разработать воспроизводимую модель 3D культивирования ММСК; исследовать полученные сфероиды ММСК на жизнеспособность и уровень экспрессии мезенхимальных и эпителиальных маркеров.
-
Исследовать и сопоставить эпителио-мезенхимальную пластичность клонов ММСК в 2D и 3D культуре.
-
На моделях животных с экспериментальной патологией исследовать поведение ММСК, соматических клеток при системном и локальном введении и проверить возможность формирования репарационных сфероидов в зонах повреждений.
6. Обобщить полученные результаты и обосновать новые представления о
роли сфероидов в репарации взрослых тканей в норме и при
патологических процессах.
Научная новизна. Впервые отработана оригинальная воспроизводимая методика получения ММСК человека и животных в стабильном эпителио-мезенхимальном статусе в 2D и 3D культуре. Прослежена динамика образования сфероидов и проведена характеристика фенотипа и поведения in vitro. Данная технология позволяет наращивать мезенхимальные стромальные клетки человека в виде лабораторных репаративных модулей с регулируемым соотношением эпителий/строма. Прогениторные клетки в сфероидах становятся непосредственными предшественниками эпителия и стромы в
зоне повреждений ткани. За счет эпителио-мезенхимальной пластичности сфероиды могут стать донором эпителия, одновременно блокируя фиброз.
Также впервые была разработана и изучена методика получения ЭМ-сфероидов из ферментативно диссоциированных соматических клеток разных органов и тканей (первичные культуры РСК пупочного канатика, подкожной жировой ткани, скелетных мышц).
Подтверждена способность поврежденных нормальных фетальных и взрослых тканей и органов формировать репаративные агрегаты (сфероиды) в культуре изолированных мини-эксплантатов.
Впервые было продемонстрировано, что трансплантация ММСК и миобластов человека в скелетную мышцу mdx-линии мышей приводила к ограниченному новообразованию дистрофин+ мышечных волокон в зоне введения (преимущественно в раневом канале). Ограниченную миграцию миобластов и ММСК наблюдали в течение только первых 6 часов после введения.
При трансплантации НСПК и ММСК человека крысам с ишемическим повреждением головного мозга также наблюдали ограниченную (в течение первых 6 часов) миграцию ММСК на незначительное расстояние с образованием новых капилляров вокруг зоны введения. НСПК при трансплантации сохраняли способность к миграции до 10 дней с последующей дифференцировкой введенных клеток в нейроны и глию.
Внутриартериальная трансплантация ММСК человека приводила лишь к частичной репарации островковой ткани поджелудочной железы с улучшением показателей эндокринного статуса и восстановлению структуры почечных гломерул.
Предложена гипотеза, что наблюдаемая эффективность трансплантаций ММСК при повреждении как эпителиальных, так и соединительных тканей объясняется их эпителио-мезенхимальной пластичностью, проявляющейся в 3D культуре.
Теоретическая и практическая значимость работы. Впервые описаны лабораторные условия и протокол получения сфероидов из ММСК с автоматической обратимой конверсией стромальных клеток в эпителий. До сих пор способность к спонтанной обратимой эпителио-мезенхимальной конверсии клеток была описана в трех тканях зародыша: примитивной полоске, узелке и нервном гребне.
Вторым важным источником репаративных сфероидов являются мини-эксплантаты поврежденных фетальных тканей и органов. Третьим источником репаративных сфероидов могут служить диссоциированные
клетки из взрослых тканей и органов. Добавленные мини-эксплантаты поврежденной ткани индуцировали образование репаративных сфероидов со смешанным эпителио-мезенхимальным фенотипом. Клетки в сфероидах формировали интенсивные межклеточные контакты и ограниченно синтезировали фрагменты базальной мембраны. Сфероиды являются первичной регенерационной тканью. Полученные по данной методике сфероиды могут быть использованы как модель многофункциональных модулей для изучения сигнальных и клеточных механизмов физиологической регенерации и репарации.
Полученные данные имеют также существенное значение для трансплантологии и клинической медицины, подсказывая пути создания более оптимальных «репарационных модулей» на базе первичных сфероидов млекопитающих и человека.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту.
-
Изолированные ММСК костного мозга, фетальных и взрослых эксплантатов, а также первичных диссоциированных культур взрослых органов и тканей способны формировать сфероиды в 3D культуре с ограниченной способностью к синтезу экстрацеллюлярного матрикса.
-
В формирующихся сфероидах активно идет обратимая мезенхимо-эпителиальная конверсия незрелых клеток, сопровождающаяся экспрессией ранних генов эмбриогенеза.
-
Эффективность клеточных трансплантаций ММСК при различных повреждениях объясняется эпителио-мезенхимальной пластичностью 3D модулей.
-
В патологически измененных тканях формирования репаративных сфероидов не наблюдается.
Апробация работы проведена на межлабораторной конференции УРАМН НИИ общей патологии и патофизиологии РАМН. Основные положения диссертации были многократно доложены на международных научных конгрессах и конференциях, в том числе на конференции «Клеточные и молекулярные аспекты регенерации и реконструкции тканей» (Москва, 1998), Международном междисциплинарный семинаре «Новые технологии в медицине и экологии, интегративная медицина» (Словакия, Татры, 2003), II Московском Международном Конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2003), Международной научной конференции «Фундаментальные основы инженерных наук» (Москва, 2006), Британско-Российском Конгрессе по проблемам изучения стволовых клеток (Москва, 2007), III и V
Международном междисциплинарном Конгрессе «Нейронаука для медицины и психологии» (Судак, Украина, 2007, 2009), Международном научном симпозиуме «Стволовые клетки, перспективы применения» (Австралия, Сидней, 2007), 7-ой Всероссийской научно-практической конференции «Федоровские чтения - 2008» (Москва, 2008), Международном симпозиуме «Аутологичные стволовые и прогениторные клетки: экспериментальные и клинические достижения» (Москва, 2008), VII Международной конференции «Молекулярная генетика соматических клеток» (Москва, 2009), Всероссийской конференции с элементами научной школы для молодежи «Клеточные исследования и технологии в современной биомедицине» (Тула, 2009), IV Всероссийском симпозиуме с международным участием «Актуальные вопросы тканевой и клеточной трансплантологии» (Санкт-Петербург, 2010), Международном симпозиуме «Стволовые клетки в биологии и медицине» (Португалия, Лиссабон, 2010).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 30 статей (в т.ч. 19 статей в рецензируемых журналах), 19 тезисов докладов, 1 монография (в соавторстве), получено 8 Российских патентов и 2 Международных патента.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований, их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы и изложена на 261 странице машинописного текста. Список литературы включает 396 источников (55 - отечественных и 341 -зарубежных авторов). Диссертация иллюстрирована 52 рисунками и 9 таблицами.
