Введение к работе
Актуальность проблемы
Нервная и иммунная системы постоянно взаимодействуют, что обеспечивается возможностью притока информации от иммунной системы к нервной через гуморальные и нервные пути, а так же восприимчивостью клеток иммунной системы к нейротрансмиттерам и гормонам нейроэндокринной системы, поскольку рецепторы к этим веществам представлены на мембранах иммуноцитов. С другой стороны, сигналы поступающие от иммунной системы, модулируют функции центральной нервной системы. Дисбаланс во взаимодействии нервной и иммунной систем может приводить к развитию различных форм патологии, проявляющихся соматическими, психическими или психосоматическими расстройствами. Одним из наиболее тяжелых и распространенных заболеваний, связанных с развитием аутоиммунного процесса в ЦНС, является рассеянный склероз (РС), этиология и патология которого изучены далеко не исчерпывающе.
Накопленные более чем за столетнюю историю изучения рассеянного склероза (РС) данные дают возможность выдвинуть предположение о существенной роли аутоиммунных Т-лимфоцитов в инициации воспаления в ЦНС. Анализ гистологических препаратов, полученных при аутопсии и биопсии у пациентов с диагнозом РС, позволяет постулировать, что практически во всех случаях при РС в период обострения очаги поражения инфильтрированы энцефалитогенными Т-клетками, которые локализуются вокруг сосудов головного мозга, что указывает на возможную роль этих клеток в нарушении разделительной функции гемато-энцефалического барьера (Booss, Esiri et al. 1983; Babbe, Roers et al. 2000).
Одними из факторов риска развития РС являются генетические особенности человека или животных, которые затрагивают гены, связанные с основным комплексом гистосовместимости II типа (MHC II), то есть с комплексом, который является ключевым механизмом активации эффекторных Т-клеток (Oksenberg, Barcellos et al. 2004; Lincoln, Montpetit et al. 2005). С другой стороны обнаружено, что лимфоциты больных РС несут специфическую последовательность цепи Т-клеточного рецептора (Oksenberg, Panzara et al. 1993; Madsen, Andersson et al. 1999). Генетические особенности в генах, кодирующих MHC II комплекс, так же играют решающую роль в контроле восприимчивости различных линий крыс к индукции экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (ЭАЭ) - модели рассеянного склероза (Madsen, Andersson et al. 1999). Обнаруженная зависимость между конкретной последовательностью генов, кодирующих компоненты MHC II, TCR и риском развития РС подтверждает предположение о важной роли Т-клеток в патогенезе РС и ЭАЭ.
Впервые, прямые доказательства роли аутоиммунных процессов в патогенезе заболевания были получены в 80-х годах прошлого столетия благодаря созданию экспериментальной модели РС – адоптивного переносного экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (апЭАЭ) (Ben-Nun, Wekerle et al. 1981). В модели апЭАЭ, патология, схожая с таковой при РС, вызывается введением здоровому животному активированных энцефалитогенных Т-клеток (ЭГ Т-клетки), сенсибилизированных к антигенам ЦНС, в частности к основному белку миелина. Патогенез апЭАЭ характеризуется развитием воспаления в ЦНС и обратимым нарушением проводящей функции аксонов, хотя и протекает без выраженной демиелинизации в отличии от рассеянного склероза у людей (Linington, Bradl et al. 1988). Обратимое нарушение проводящей функции аксонов, а не полная ее потеря, объясняет монофазный характер течения заболевания, вызванного введением ЭГ Т-клеток, сенсибилизированных к основному белку миелина (MBP) у крыс линии Lewis, которое заканчивается полным восстановлением утраченных функций. Подобная ситуация напоминает симптоматику, характерную для ремитирующей формы РС, при которой периоды обострения заболевания сменяются полным восстановлением в начальный период развития РС. Хотя патогенез апЭАЭ не включает всей совокупности процессов, происходящих при развитии РС, например протекает без выраженной потери миелина, адекватность этой модели для изучения роли Т-клеточной составляющей в инициации и развитии патогенеза РС общепризнанна (Gold, Linington et al. 2006).
Течение апЭАЭ у крыс линии Lewis может быть разделено на 3 фазы: преклиническая фаза, клиническая фаза и восстановление. Преклиническая фаза наиболее важна для понимания механизмов инициации заболевания, опосредованного введением ЭГ Т-лимфоцитов. Несмотря на то, что, апЭАЭ вызывается введением активированных Т-клеток, сенсибилизированных к MBP и экспрессирующих необходимые молекулы для прямой экспансии в ЦНС, большинство Т-клеток достигает ЦНС только через 2-3 суток после введения. Применение методов генной терапии для доставки генов в энцефалитогенные Т-клетки предоставило возможность изучения роли ЭГ Т-клеток в патогенезе апЭАЭ (Flugel, Willem et al. 1999). По предположению A. Flugel, на преклиническом этапе апЭАЭ формируется «миграционный фенотип» энцефалитогенных Т-клеток, который необходим для их проникновения через ГЭБ и инициации воспаления в ЦНС (Flugel, Berkowicz et al. 2001). Несмотря на большое количество работ, посвященных изучению патогенеза апЭАЭ, остается не до конца ясным, какие клеточные и экстраклеточные компоненты тканей, с которыми взаимодействуют энцефалитогенные клетки в ходе миграции на преклиническом этапе, вовлечены в формирование «миграционного фенотипа» и какие изменения, происходящие с энцефалитогенными клетками, его определяют. По-видимому, Т- лимфоциты, сенсибилизированные к MBP, играют роль провокатора воспаления в ЦНС, хотя непонятно какую роль они играют в патогенезе развития других этапов ЭАЭ. Для того, что бы ответить на эти и другие вопросы, мы использовали систему индуцированного клеточного самоубийства и скрининг функционального состояния энцефалитогенных Т-клеток на различных этапах развития ЭАЭ, а так же попытались вычленить компоненты тканей, вовлеченные в формирование «миграционного фенотипа» у энцефалитогенных клеток.
Цель и задачи исследования
Целью настоящей работы является определение роли энцефалитогенных Т-клеток в развитии различных стадий ЭАЭ и выявление факторов, обеспечивающих ЭГ Т-клеткам «миграционный фенотип», позволяющий им преодолевать гематоэнцефалический барьер и провоцировать развитие аутоиммунного воспаления в ЦНС. Для достижения данной цели поставлены следующие задачи:
-
Используя методы проточной цитометрии, количественной ПЦР и флуоресцентной микроскопии выявить органы, в которые мигрируют ЭГ Т-клеток на преклиническом этапе апЭАЭ. Провести сравнительный анализ распределения ЭГ Т-клеток, экспрессирующих зеленый флуоресцентный белок, in vivo на разных стадиях развития апЭАЭ, вызванного в/в или в/б введением ЭГ Т-клеток.
-
На основании данных молекулярного скрининга и количественной ПЦР выделить гены - потенциальные кандидаты, вовлеченные в процесс формирования функциональных изменений ЭГ Т-клеток на преклиническом этапе развитии ЭАЭ.
-
Исследовать влияние отдельных компонентов экстраклеточного матрикса на миграционную активность ЭГ Т-клеток. Разработать 3-х мерную модель для анализа подвижности ЭГ Т-клеток in vitro, используя метод флуоресцентной микроскопии.
-
Разработать систему, позволяющую селективно удалять ЭГ Т-клетки in vitro и in vivo, а именно создать трасгенную линию первичных MBP (основной белок миелина) специфичных Т-клеток, экспрессирующих суицидный (тимидин киназа вируса простого герпеса - HSV-TK) и маркерный (зеленый флуоресцентный белок - GFP) гены, а также линии клеток экспрессирующие GFP, RFP или белок - переносчик норэпинефрина (hNAT).
-
Изучить роль ЭГ Т-клеток в развитии различных стадий апЭАЭ, неинвазивно удаляя эти клетки методом, основанным на использовании токсических свойств синтетических аналогов тимидина (ганцикловир- GCV) на клетки экспрессирующие HSV-TK. Проследить взаимосвязь между количеством ЭГ Т-клеток в организме, интенсивностью провоцируемого ими воспаления в ЦНС и тяжестью клинических проявлений.
-
Используя свойство ЭГ Т-клеток, продуцирующих HSV-TK, специфически аккумулировать радиоактивные аналоги GCV, попытаться установить локализацию ЭГ Т-клеток в организме на различных стадиях развития ЭАЭ с помощью гамма-сканирования.
Особенностью данной работы является использование модели рассеянного склероза, позволяющей изучить функциональные перестройки ЭГ Т-клеток на ранних стадиях развития ЭАЭ непосредственно в организме и их роль в инициации патологических процессов.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Экспрессия транскрипционного фактора - Круппел-лайк фактор 2 (KLF2) и активирующего миграцию рецептора к гиалуронану (RHAMM) активируется в ЭГ Т-клетках в селезенке через 72 часа после введения непосредственно перед резким увеличением числа ЭГ Т-клеток в ЦНС и частично определяет повышение их миграционной активности.
-
Высокомолекулярный гиалуронан - один из компонентов экстраклеточного матрикса, стимулирует двигательную активность и ингибирует пролиферацию ЭГ Т-клеток, не влияя на их способность к активации в ответ на действие специфического антигена. Эти изменения сопряжены с увеличением уровня экспрессии KLF2.
-
Энцефалитогенные Т-клетки, сенсибилизированные к основному белку миелина, играют ключевую роль в инициации развития аутоиммунного воспаления в ЦНС, неинвазивное удаление их на клинической стадии развития заболевания не изменяет динамику его течения.
-
Клеточное самоубийство экспрессирующих HSV-TK ЭГ Т-лимфоцитов, спровоцированное введением GCV, вызывает гибель клеток через активацию р53 зависимого пути апоптоза, но протекает без активации каспазы-3.
-
Удаление чувствительной к GCV популяции энцефалитогенных клеток (TMBP-GFPTK) на преклинической стадии апЭАЭ ведет к увеличению инфильтрации ЦНС клетками оставшейся, не чувствительной к GCV, популяции энцефалитогенных Т-клеток (TMBP-RFP) при их совместном введении.
-
Накопление радиоактивно меченных аналогов GCV TMBP-GFPTK+ лимфоцитами, используемое для неинвазивного определения их локализации in vivo, ведет к потере пролиферативной и функциональной активности этих клеток.
Научная новизна работы.
В ходе работы была изучена роль ЭГ Т-клеток в развитии патологических процессов в ЦНС на ранних стадиях развития ЭАЭ, определены клеточные и экстраклеточные компоненты, влияющие на формирование миграционного фенотипа ЭГ Т-клеток и пути реализации развития этих изменений. Использование линий трансгенных ЭГ Т-клеток позволило изучить их роль и функциональные перестройки в процессе развития ЭАЭ in vivo, что открывает возможность для поиска путей регуляции функций энцефалитогенных клеток. Впервые описаны пути апоптоза экспрессирующих HSV1-TK Т-лимфоцитов, вызванного ганцикловиром и обнаружен токсический эффект аккумуляции радиоактивных аналогов ганцикловира на эти клетки, что необходимо принимать во внимание при проведении клинических и лабораторных исследований.
Практическая значимость работы.
Изучение перестроек, происходящих в иммунной системе в преклинический период развития РС, имеет не только теоретический интерес, но перспективно и для клинического применения. Знание механизмов формирования миграционного фенотипа энцефалитогенных клеток, обусловливающих развитие процесса воспаления в ЦНС, предоставляет возможность поиска путей их регуляции или компенсации. Выяснение роли клеточного окружения, влияющего на процесс созревания ЭГ Т-клеток, даст возможность не только влиять на их поведение, но и предотвращать созревание ЭГ Т-клеток in vivo.
Реализация результатов исследования.
Результаты работы могут быть использованы в научной практике, связанной с изучением молекулярных механизмов развития патогенеза рассеянного склероза и его экспериментальных моделей и могут войти в курс преподавания по физиологии, патофизиологии, нейрофизиологии, иммунологии и неврологии. Полученные данные рационально использовать в фармакологии при разработке иммунокорригирующих препаратов.
Апробация работы.
Материалы исследования изложены в 10 публикациях и представлены на Российских и Международных конференциях и симпозиумах.
Структура и объем работы:
Диссертация изложена на 156 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов работы, результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, из них отечественных - 12 и 234 - зарубежных авторов. Работа проиллюстрирована 36 рисунками.
