Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Роль гипергомоцистеинемии в патологии (Обзор литературы) 11
1.1 Гомоцистеин, его метаболизм и роль в патологии человека 11
1.2 Роль модифицированных гомоцистеином белков в развитии атеросклероза 18
1.3 Нагрузочный метиониновый тест для выявления гипергомоцистеинемии 29
Глава 2 Материалы и методы исследования 36
2.1 Получение комплекса альбумина с гомоцистеином 36
2.2 Изучение аутоантител к комплексу крысиного альбумина с гомоцистеином и уровня гомоцистеина 36
2.3 Определение циркулирующих иммунных комплексов 41
2.4 Изучение морфологических изменений тканей миокарда и показателей периферической крови 41
2.5 Изучение экспрессии тканевого фактора на фоне гипергомоцистеинемии 42
2.6 Описание исследованных групп пациентов 43
2.7 Определение аутоантител, уровня гомоцистеина и циркулирующих иммунных комплексов 45
2.8 Проведение метионинового нагрузочного теста 46
2.9 Статистическая обработка результатов 47
Глава 3 Некоторые сведения о патогенном действии гомоцистеина и его элиминации (Результаты собственных исследований) 48
3.1 Результаты экспериментального исследования
3.1.1 Получение модифицированного белка 48
3.1.2 Титр аутоантител и уровень гомоцистеина у интактных крыс 50
3.1.3 Титр аутоантител и уровень гомоцистеина у крыс с иммунодефицитом 52
3.1.4 Изменения иммунного статуса у крыс на фоне введения гомоцистеина 58
3.1.5 Уровень циркулирующих иммунных комплексов у экспериментальных крыс 61
3.1.6 Изменения в морфологии миокарда и периферической крови у животных на фоне гипергомоцистеинемии 63
3.1.7 Экспрессия тканевого фактора у экспериментальных животных 70
3.2 Результаты исследования больных сердечно-сосудистой патологией 72
3.2.1 Уровень гомоцистеина и аутоантител к модифицированному альбумину и тромбину 72
3.2.2 Циркулирующие иммунные комплексы у больных сердечно-сосудистой патологией 74
3.2.3 Результаты проведения корреляционного анализа между исследованными показателями 76
3.2.4 Метиониновыи нагрузочный тест с определением уровня гомоцистеина в ротовой жидкости 78
Глава 4 Обсуждение полученных результатов 81
4.1 Обсуждение результатов экспериментального исследования 81
4.1.1 Уровень гомоцистеина и титр аутоантител к модифицированному альбумину 81
4.1.2 Показатели иммунитета, форменные элементы крови и морфологические изменения миокарда у экспериментальных животных 84
4.2 Обсуждение результатов исследования больных сердечно сосудистой патологией 89
4.2.1 Уровень гомоцистеина и аутоантител к модифицированному альбумину и тромбину 89
4.2.2 Циркулирующие иммунные комплексы 91
4.2.3 Метиониновый нагрузочный тест 92
Выводы 95
Список сокращений 97
Список литературы
- Роль модифицированных гомоцистеином белков в развитии атеросклероза
- Изучение морфологических изменений тканей миокарда и показателей периферической крови
- Уровень циркулирующих иммунных комплексов у экспериментальных крыс
- Уровень гомоцистеина и аутоантител к модифицированному альбумину и тромбину
Введение к работе
Актуальность проблемы
Согласно современным представлениям, одним из независимых факторов риска атеросклероза и тромбоза коронарных, церебральных и других сосудов является повышение уровня в плазме крови гомоцистеина, который инициирует повреждение эндотелиальных клеток и тем самым запускает процесс образования атеросклеротической бляшки, активирует систему гемокоагуляции, тромбоцитарный гемостаз (Цыбиков Н.Н., 2007; Смирнова О.А., 2008; Шмелева В.М., 2010).
Метаболизм гомоцистеина протекает преимущественно в печени и почках двумя основными путями: реметилирование с образованием метионина (при участии ферментов: метионинсинтетазы и метилентетрагидрофолатредуктазы) и транссульфирование с превращением в цистеин (фермент – цистатионин--синтетаза). В основе гипергомоцистеинемии лежит наследственная или приобретенная недостаточная активность ферментов, осуществляющих его метаболизм.
В последнее время появились сведения о том, что действие гомоцистеина не ограничивается повреждением эндотелия с запуском атеротромбоза. Описана способность этого аминотиола связываться с особой группой глутаматных рецепторов (NMDA-рецепторов), имеющихся на мембранах нейронов, кардиомиоцитов, лейкоцитов, эритроцитов, мегакариоцитов и других клеток (Арзуманян Е.С., 2008; Машкина А.П., 2010; Болдырев А.А., 2012; Gill S., 2007), при этом развиваются окислительный стресс, повреждение и гибель клетки.
В настоящее время актуален вопрос об эффективном и своевременном выявлении гипергомоцистеинемии, которую делят на явную и скрытую (Selbum J., 1992). Приблизительно у 50% обследуемых лиц с нормальным уровнем гомоцистеина натощак существуют скрытые нарушения его метаболизма. Для диагностики скрытой гипергомоцистеинемии используют нагрузочный метиониновый тест (Гуржий А.А., 2008). Данная проба предполагает многократный забор венозной крови в течение суток: до, через 4, 6, 24 часа после перорального приема метионина. В связи с этим представляются актуальными исследования для создания неинвазивной технологии проведения метионинового теста с исследованием уровня гомоцистеина в ротовой жидкости.
В циркуляции гомоцистеин присутствует в свободной форме, в виде дисульфидов, но большая его часть образует связь с белками, особенно, с альбумином (Блашко Э.Л., 2007). Суммарное количество этих форм составляет общий гомоцистеин. Конъюгаты с белками плазмы крови образует и гомоцистеин-тиолактон. Комплексы альбумина с гомоцистеином и альбумина с гомоцистеин-тиолактоном обладают аутоантигенными свойствами и вызывают образование аутоантител (Jakubowski H., 2005; Undas A. 2007). Сформированные иммунные комплексы могут явиться как фактором повреждения эндотелия, так и дополнительным механизмом элиминации гомоцистеина. Данный вопрос в доступной нам литературе до настоящего времени освещен не достаточно.
Целью исследования явилось изучение иммунных механизмов элиминации гомоцистеина при гипергомоцистеинемических состояниях.
В связи со сказанным решались следующие задачи:
-
Получить конъюгат сывороточного альбумина человека и крысы с гомоцистеином и гомоцистеин-тиолактоном (модифицированный альбумин).
-
Определить уровень гомоцистеина и аутоантител к альбумину, модифицированному гомоцистеином и гомоцистеин-тиолактоном у интактных крыс и животных с экспериментальным иммунодефицитом.
-
Изучить морфологические изменения миокарда и количественные показатели гемограммы у крыс на фоне гипергомоцистеинемии. Оценить экспрессию тканевого фактора у животных при высокой концентрации гомоцистеина.
-
Определить содержание гомоцистеина и аутоантител к модифицированному альбумину в сыворотке крови и смешанной слюне у здоровых лиц и больных сердечно-сосудистой патологией.
-
Изучить уровень циркулирующих иммунных комплексов у экспериментальных животных и человека.
-
Исследовать динамику концентрации гомоцистеина в сыворотке крови и ротовой жидкости при проведении метионинового нагрузочного теста.
Научная новизна
Получен комплекс сывороточного альбумина крысы и человека с гомоцистеином и гомоцистеин-тиолактоном в условиях in vitro.
Впервые установлено, что у животных при введении в организм экзогенного гомоцистеина и гомоцистеин-тиолактона уровень общего гомоцистеина плазмы крови остается на исходном уровне на фоне резкого повышения титра аутоантител к модифицированному альбумину. При моделировании гуморального иммунодефицита у крыс выявлено резкое увеличение как исходного уровня общего гомоцистеина в плазме крови, так и после введения в организм экзогенного гомоцистеина и гомоцистеин-тиолактона.
Впервые выполнен анализ уровня гомоцистеина в ротовой жидкости пациентов при проведении метионинового нагрузочного теста, что позволяет избежать многократного инвазивного вмешательства, связанного с забором крови.
Теоретическая ценность работы
Описанный механизм элиминации гомоцистеина при повышении его уровня в организме путем развития гуморального иммунного ответа с образованием аутоантител к белкам, модифицированным гомоцистеином и гомоцистеин-тиолактоном, расширяет представления о регуляторной роли иммунной системы.
Внедрение результатов работы
Теоретические положения, раскрываемые в диссертации, внедрены в учебный процесс кафедр патологической физиологии, нормальной физиологии ГБОУ ВПО «Читинская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения РФ.
Положения, выносимые на защиту
-
Иммунная система способна регулировать уровень общего гомоцистеина в плазме крови в пределах физиологических значений путем образования аутоантител против комплекса гомоцистеина с сывороточным альбумином.
-
При физиологических значениях уровня гомоцистеина и гипергомоцистеинемии происходит сенсибилизация к модифицированным гомоцистеином белкам, образованные антитела класса S-IgA поступают в секреты, в том числе, в ротовую жидкость, что обеспечивает быструю элиминацию гомоцистеина и может быть зарегистрировано при проведении нагрузочного метионинового теста.
-
Гомоцистеин оказывает токсическое действие на клетки и структуры организма, несущие на поверхности NMDA-рецепторы, через активацию последних и усиление экспрессии тканевого фактора в эндотелиоцитах, но не в фибробластах и нейтрофилах.
Апробация работы
Основные результаты работы были представлены на I Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых «Сибирский медико-биологический конгресс» г. Барнаул, 2011 г.; III Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Вопросы патогенеза типовых патологических процессов» г. Новосибирск, 2011 г.; IV Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Вопросы патогенеза типовых патологических процессов» г. Новосибирск, 2012 г.; Научно-практической конференции «I Съезд терапевтов Забайкальского края» г. Чита, 2013 г.; V Международной научно-практической конференции «Экология. Здоровье. Спорт» г. Чита, 2013 г.; Всероссийской научно-практической конференции с международным участием, посвященной 60-летию ЧГМА «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины» г. Чита, 2013 г.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ, в том числе 3 статьи в ведущих рецензируемых научных журналах, определенных ВАК Министерства образования и науки РФ.
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 117 страницах машинописного текста, включает введение, 4 главы: «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты собственных исследований», «Обсуждение полученных результатов», выводы, список литературы. Диссертация содержит 18 таблиц и 9 рисунков. Список литературы включает 50 отечественных и 114 зарубежных источников.
Роль модифицированных гомоцистеином белков в развитии атеросклероза
Приобретенные причины заключаются в недостатке в пище соответствующих витаминов, нарушении их всасывания (синдром мальабсорбции) [28, 95, 112, 135]. Кроме того, гипергомоцистеинемия может развиться вследствие нарушения процессов метаболического превращения гомоцистеина. Утилизация гомоцистеина осуществляется в значительной степени почками, в которых протекают описанные выше пути метаболизма, поэтому умеренная гипергомоцистеинемия обнаруживается у больных с почечной недостаточностью [113]. Выделение гомоцистеина с мочой крайне незначительно из-за связывания его в плазме крови с белками и реабсорбции.
Повышению уровня гомоцистеина способствуют: возраст, мужской пол, курение, потребление алкоголя и кофе, низкая физическая активность, стресс, вегетарианство, а прием витаминов, сбалансированное питание, беременность способствуют снижению его концентрации [22, 50, 82,130].
Возрастание уровня гомоцистеина вызывает прием ряда лекарственных препаратов. Метотрексат является антагонистом фолиевой кислоты, противосудорожные препараты уменьшают депо фолиевой кислоты в печени, закись азота - инактивирует витамин Ви, тем самым нарушая реметилирование гомоцистеина [83], уровень гомоцистеина может увеличивать прием гормональных контрацептивов, теофиллина и др. [50].
Повышение концентрации гомоцистеина наблюдается при ряде заболеваний. Прежде всего это, как уже сказано, почечная недостаточность и заболевания ЖКТ, нарушающие всасывание необходимых витаминов, кроме того, сахарный диабет, псориаз, патология щитовидной железы [50].
Частота встречаемости гипергомоцистеинемии достаточно большая. По данным лаборатории свертывания крови РосНИИГТ у больных с артериальными тромбозами гопергомоцистеинемия выявлена в 56% случаев, при венозных тромбозах - в 46% случаев [49]. Повышенный уровень гомоцистеина является независимым фактором риска, сочетание которого с курением, гиперхолестеринемией, артериальной гипертензией резко увеличивает вероятность развития тромбоза. Так, показано, что у пациентов с гипертонической болезнью и нормальным уровнем гомоцистеина риск развития артериального тромбоза увеличен в 3,8 раза, а у больных гипертонической болезнью с повышенным уровнем этой аминокислоты - в 10,8 раза [61, 66].
В циркуляции гомоцистеин находится в различных формах: связанный с белком (альбумином) - 70-85%, в окисленной до дисульфида форме - 15-30% и только 1-2% представлено в свободной форме [3, 4, 29, 67, 131]. Суммарное определение всех форм позволяет оценить уровень общего гомоцистеина в плазме крови. Для этой цели в клинической практике наиболее широко используются методы ВЭЖХ и ИФА [23,139].
Для здорового взрослого человека нормальной концентрацией общего гомоцистеина в плазме крови большинство авторов считают 5-15 мкмоль/л [24, 50], при этом у мужчин обычно выше, чем у женщин репродуктивного возраста: у женщин 5-12 мкмоль/л, у мужчин 5-15 мкмоль/л [52]. У беременных женщин уровень гомоцистеина существенно ниже, чем у небеременных того же возраста. У детей концентрация гомоцистеина составляет примерно 5 мкмоль/л. В течение жизни уровень этой аминокислоты увеличивается у обоих полов. Рассчитан оптимальный интервал уровня гомоцистеина для разных возрастных категорий. У лиц до 30 лет он составляет 4,6-8,1 мкмоль/л; в возрасте от 30 до 59 лет - 4,5-7,9 мкмоль/л для женщин и 6,3-11,2 мкмоль/л для мужчин. Для лиц старше 60 лет - 5,8-11,9 мкмоль/л [149]. При этом в изученной нами литературе не дается объяснение повышения с возрастом концентрации гомоцистеина.
Гипергомоцистеинемию условно делят на легкую (или умеренную) - 15-30 мкмоль/л; среднюю - 30-100 мкмоль/л и тяжелую - более 100 мкмоль/л [50]. Однако, у лиц старше 50 лет при наличии факторов риска концентрацию гомоцистеина 10-12 мкмоль/л рекомендуется рассматривать как умеренную гипергомоцистеинемию [46, 79]. Установлено, что не менее чем 10% людей в общей популяции имеют умеренное повышение уровня гомоцистеина, 1% - среднюю гипергомоцистеинемию и 0,02% - тяжелую. Умеренная гипергомоцистеинемия развивается чаще всего при дефиците витаминов группы В и фолатов в продуктах питания, при наличии рассмотренных выше вредных привычек, почечной недостаточности. Гипергомоцистеинемия средней степени развивается, как правило, при наличии мутации С677Т в гене фермента МТГФР. Тяжелая гипергомоцистеинемия возникает обычно у лиц с гомозиготной мутацией гена ЦРС.
В настоящее время приняты показания к исследованию в крови больных уровня гомоцистеина с целью выявления степени тромбогенного риска и прогнозирования возможных осложнений сердечно-сосудистых заболеваний, а также для контроля за эффективностью проводимой гомоцистеинкоррегирующей терапии [29].
Существует множество работ, посвященных исследованию патогенного действия гомоцистеина. Предположительных механизмов повреждающего эффекта гипергомоцистеинемии описано в настоящее время также довольно много. Прежде всего, стоит выделить окислительное повреждение эндотелия в результате аутоокисления молекулы гомоцистеина с образованием свободных радикалов [129] и снижения активности глютатионпероксидазы [79]. Изучен эффект снижения под действием гомоцистеина выработки оксида азота - вазодилататора и антиагреганта, что приводит к сужению сосудов и развитию дисфункции эндотелия [72, 73, 79, 137]. К патогенным эффектам высокого уровня гомоцистеина относят также стимуляцию пролиферации гладкомышечных клеток сосудов, активацию коагуляционного гемостаза, усиление агрегации тромбоцитов [92, 134]. При гипергомоцистеинемии происходит повышение уровня тромбин-активируемого фибринолитического ингибитора (TAFI), что приводит к нарушению процесса фибринолиза [51, 134].
Таким образом, механизмы развития эндотелиальной дисфункции, атеросклероза и тромбоза в настоящее время изучены достаточно широко. Наряду с этим известно повреждающее действие высокой концентрации гомоцистеина на ряд клеток организма, в частности на кардиомиоциты [77, 104], лейкоциты [31], клетки клубочков и канальцев почек [15, 96, 143], нейроны [48, 163] и др., данное направление исследований является сравнительно новым. В 2003 году на основании проспективных исследований были опубликованы данные, согласно которым повышение концентрации гомоцистеина в плазме крови выше среднеполовых значений связано с более высокой частотой развития застойной сердечной недостаточности [142], существуют экспериментальные данные о развитии гипертрофии миокарда на фоне гипергомоцистеинемии [108].
При изучении влияния длительной гипергомоцистеинемии на функциональную активность миокардиоцитов учеными Бостонского университета показано развитие реактивного интерстициального фиброза тканей миокарда, что привело к снижению систолических показателей [76]. В то же время, ученные из Германии в своих экспериментах не обнаружили патологическое ремоделирование миокарда у крыс с экспериментальной гипергомоцистеинемией [94]. Исходя из этого, кардиотоксический эффект гипергомоцистеинемии требует более детального изучения.
Изучение морфологических изменений тканей миокарда и показателей периферической крови
Отмытый осадок фиксированных эритроцитов в объеме 0,5 мл добавляли к 2,5 мл раствора модифицированного альбумина в 0,15 М фосфатном буфере с рН 7,4. Смесь инкубировали 1 час при комнатной температуре. После трехкратной отмывки эритроциты, конъюгированные модифицированным альбумином, использовали для проведения РПГА. РПГА проводили в двух вариантах: с определением всех классов Ig и с определением цистеин-устойчивых антител (класса IgG) согласно методическим рекомендациям по постановке реакции пассивной гемагглютинации с цистеиновой пробой с целью диагностики сальмонеллезов (Центральный НИИ эпидемиологии Министерства здравоохранения СССР). Основанием для подобного дифференцированного определения иммуноглобулинов является то, что при обработке сыворотки некоторыми редуцирующими веществами, в частности цистеином, IgG-антитела относительно устойчивы, тогда как IgM и IgA-антитела не специфически инактивируются, выпадая в осадок, что связано с большей молекулярной массой их по сравнению с IgG. Это позволяет определить удельное содержание IgG в сыворотке.
Цистеин в соотношении 15 мг на 1 мл растворяли 0,1 М раствором NaOH и при значении рН 7,0-7,2 доводили до нужного объема 0,85% раствором NaCl. Одну часть сыворотки экспериментальных крыс, разведенную 1:5 физиологическим раствором, смешивали с равным объемом раствора цистеина, помещали в пробирку и заливали слоем стерильного вазелинового масла, вторую часть сыворотки (без цистеина) также заливали слоем вазелинового масла. Пробирки с сыворотками, обработанными и необработанными цистеином, выдерживали в термостате при 37С в течение 18 часов.
Далее обе части сыворотки титровали в нескольких парных рядах соответственно числу эритроцитарных диагностикумов, начиная с разведения 1:30, в планшетах для иммунологических реакций однократного применения. Для разведения использовали забуференный 0,85% раствор NaCl (фосфатный буфер с рН 7,0-7,2). Эритроциты, конъюгированные глутаровым альдегидом с альбумином, модифицированным гомоцистеином и гомоцистеин-тиолактоном, в 2,5% разведении вносили в каждую лунку разведения сыворотки в равном объеме (0,1 мл). Каждый эритроцитарный диагностикум вносили в два ряда разведений сыворотки (обработанной и необработанной цистеином). В одну из лунок, содержащую растворитель без испытуемой сыворотки, вносили равный объем диагностикума для контроля спонтанной агглютинации. Контролем служили разведения исследуемых сывороток с несенсибилизированными эритроцитами, а также с эритроцитами, сенсибилизированными немодифицированным альбумином. Через 2 часа учитывали результаты по обычной для РПГА методике. Положительной считали реакцию в случае образования ровного слоя агглютинированных эритроцитов по всей поверхности лунки («зонтик»), отрицательной -компактный осадок эритроцитов в центре лунки («пуговка»). Количественную оценку проводили через отрицательный десятичный логарифм от титра разведения сыворотки, при котором регистрировалась положительная реакция.
Уровень гомоцистеина у экспериментальных животных определяли также высокоэффективной жидкостной хроматографией по методу Дутова А.А. и соавторов (2010 г.). Результат пересчитывали в мкмоль/л. 2.3 Определение циркулирующих иммунных комплексов
Циркулирующие иммунные комплексы (ЦИК) у вышеописанных групп лабораторных животных определяли методом преципитации с раствором полиэтиленгликоля (ПЭГ) в концентрации 3,5%; 7% и 10%. Показано, что линейный незаряженный полимер ПЭГ-6000 избирательно осаждает иммунные комплексы в зависимости от их молекулярной массы, сводя к минимуму преципитацию свободных сывороточных белков. При концентрации 3,5% ПЭГ-6000 осаждает крупные комплексы. 7% ПЭГ-6000 осаждает ЦИК со средней молекулярной массой, 10% ПЭГ-6000 -низкомолекулярные комплексы, которые избегают захвата фагоцитами и могут образовывать депозиты под эндотелием сосудов, приводя к значительному повреждению тканей.
Раствор полиэтиленгликоля готовили на 0,1 М боратном буфере рН 8,4. 20 мкл исследуемой сыворотки смешивали с 0,5 мл боратного буфера указанной концентрации; 0,4 мл этой смеси приливали к 0,4 мл 7%, 14% и 20% раствора полиэтиленгликоля (конечная концентрация 3,5%, 7% и 10%).
Данный эксперимент поставлен на сорока белых лабораторных крысах - самцах средней массой 150 г, одного возраста. Животные были разделены на четыре группы (п=10). Крысам первой и второй группы внутрибрюшинно вводили физиологический раствор, а животным третьей и четвертой группы - гомоцистеин в дозе 0,001 мг на 1 мл ОЦК. Крысы первой и третьей группы были выведены из эксперимента на 7 сутки, а второй и четвертой - на 14 сутки.
Уровень гомоцистеина определяли методом высоко эффективной жидкостной хроматографии, описанным выше. Для гистологического исследования ткани сердца фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина. Серийные парафиновые срезы толщиной 4-5 мкм изготавливали по стандартной методике. С целью обзорной окраски гистологические срезы окрашивали гематоксилин-эозином; для выявления компонентов соединительной ткани окрашивали пикрофуксином по Ван Гизону.
Исследование и мофометрический анализ тканей проводили с помощью микроскопа «Opticam PR05» с использованием цифровой фотокамеры «Olympus СХ-41» и программы анализа изображений «Optika Vision Pro»ver. 2.7. Количественные изменения в периферической крови оценивали с помощью автоматического гематологического анализатора PENTRA 120 Retic согласно прилагаемой инструкции. Статистическую обработку результатов проводили с использованием элементов непараметрической статистики, с помощью пакета программ Statistica 6.0 производства StatSoft.
Уровень циркулирующих иммунных комплексов у экспериментальных крыс
У иммунодефектных крыс на фоне поступления экзогенного гомоцистеина наблюдались следующие изменения в иммунограмме (табл. 9). Как и у интактных крыс спустя 9 суток введения аминотиола происходило возрастание общего процентного числа лимфоцитов по сравнению со значением до нагрузки гомоцистеином; со стороны общего количества Т-лимфоцитов значимых изменений не наблюдалось, но имело место снижение числа цитотоксических лимфоцитов (CD3CD8) также на 9 сутки. Показатели гуморального иммунитета претерпевали более значительные изменения: относительное количество В-лимфоцитов падало в 4 раза, а абсолютное - в 10 раз. Причем абсолютное число В-лимфоцитов снижалось уже на 6 сутки эксперимента.
Также у крыс с иммунодефицитом по сравнению с интактными животными наблюдалось уменьшение всех исследованных показателей иммунограммы, кроме общего относительного количества лимфоцитов и относительного числа В-лимфоцитов до введения гомоцистеина (табл. 9), что, безусловно, объясняется введением этой группы животных цитостатика (как указано в главе «Материалы и методы). Спустя 6 и 9 суток введения гомоцистеина и эти показатели становились значимо ниже, чем у интактных крыс.
Таким образом, выявлено, что у интактных крыс введение экзогенного гомоцистеина не вызывало каких-либо заметных изменений в показателях иммунограммы, зато у животных с уже имеющимся иммунодефицитным состоянием гомоцистеин оказвал негативное влияние как на клеточный, так и на гуморальный иммунитет.
Уровень циркулирующих иммунных комплексов средней (осажденных 7% ПЭГ) и низкой (осажденных 10% ПЭГ) молекулярной массы в сыворотке крови животных отображен в табл. 10. До введения экзогенных тиолов отсутствовали различия у интактных и иммунодефектных крыс в содержании ЦИК. У крыс с иммунодефицитом спустя 6 часов после введения гомоцистеина содержание ЦИК средней молекулярной массы выше на 28%, а низкомолекулярных ЦИК в 3 раза выше, чем у интактных. После нагрузки гомоцистеин-тиолактоном различия еще более выраженные: уровень среднемолекулярных ЦИК возрос более чем в 2 раза, а низкомолекулярных - в 8 раз по сравнению с соответствующим показателем у интактных крыс.
Спустя 9 суток нагрузки метаболитами изменения концентрации иммунных комплексов отмечались только у животных, которым вводили гомоцистеин, причем эти изменения заключались, наоборот, в более низком уровне ЦИК у иммунодефектных животных, чем у интактных: ЦИК средней молекулярной массы почти в 3 раза, а низкомолекулярных почти в 5 раз. У крыс, получавших гомоцистеин-тиолактон содержание ЦИК в сыворотке крови спустя 9 суток как у интактных животных. Таблица 10 Уровень ЦИК у экспериментальных крыс (ед. оп. пл. OD450) (Me (25-й; 75-й)) Средней молекулярной массы Группа До нагрузки Через 6 ч после введения После 9 дней введения гомоцистеина гомоцистеин-тиолактона гомоцистеина гомоцистеин-тиолактона Интактные крысы 0,560 (0,250; 0,789) 0,695 (0,503; 0,751) 0,347 (0,252; 0,581) 0,862 (0,692; 0,866) 0,799 (0,004; 0,941) Крысы с ИДС 0,305 (0,036; 0,977) 0,86 (0,733; 1,228) 0,742 (0,712; 1,118) 0,349 (0,266; 0,478) 0,365 (0,151;0,588) Низкой молекулярной массы Группа До нагрузки Через 6 ч после введения После 9 дней введения гомоцистеина гомоцистеин-тиолактона гомоцистеина гомоцистеин-тиолактона Интактные крысы 0,338 (0,178; 0,629) 0,184 (0,05; 0,328) 0,093 (0,025; 0,347) 0,792 (0,581; 1,041) 0,535 (0,005; 0,781) Крысы сидс 0,142 (0,007; 0,775) 0,627 (0,303; 1,133) 0,765 (0,647; 0,978) 0,168 (0,128;0,24) 0,154 (0,028;0,275) Примечание: р 0,05 в сравнении с показателями в контрольной группе. Возрастание количества ЦИК после введения экзогенных гомоцистеина и гомоцистеин-тиолактона указывает на связывание последних аутоантителами, описанными в разделах 3.1.2 и 3.1.3, и включение в состав иммунных комплексов. Тот факт, что у интактных животных увеличения уровня ЦИК не происходило, объясняется, по-видимому, более быстрой элиминацией иммунных комплексов из кровотока путем фагоцитоза, что нарушено у животных, получавших цитостатик.
В последние годы стало известно, что патогенное действие гомоцистеина заключается не только в индуцировании дисфункции эндотелия, атеросклероза и тромбоза, повышенный уровень этой аминокислоты оказывает повреждающее воздействие на ряд клеток.
Как указано в главе «Материалы и методы», во второй серии экспериментов животных разделили на четыре группы: крысам первой и второй групп вводили внутрибрюшинно физиологический раствор, а третьей и четвертой группам - гомоцистеин в дозе 0,001 мг на 1 мл ОЦК. С целью сопоставить динамику изменений, крысы первой и третьей групп выведены из эксперимента на седьмые сутки, а животные второй и четвертой групп - на четырнадцатые сутки.
Уровень гомоцистеина и аутоантител к модифицированному альбумину и тромбину
Известно, что большая часть гомоцистеина в плазме крови связана с альбумином (от 70% до 80%) [3]. В нашей работе, на первом этапе, получен комплекс сывороточного альбумина с гомоцистеином в условиях in vitro. При технологии, описанной в главе «Материалы и методы», отличающейся от физиологических условий, прежде всего, температурным режимом и, следовательно, скоростью реакций, приблизительно 40% гомоцистеина образовало химическую связь с альбумином.
Следует заметить, что сам гомоцистеин связывается с белком путем образования дисульфидной связи с SH-группой аминокислотного остатка цистеина. В связанном с альбумином состоянии в кровотоке находится и его метаболит гомоцистеин-тиолактон. Сайтами связывания в молекуле белка для этого соединения служит свободная аминогруппа остатков лизина. Общепринято, что альбумин, комплексируясь с гомоцистеином, выполняет транспортную функцию. Показано, что альбумин является основным белком, транспортирующим гомоцистеин [133, 152]. При выполнении транспортной функции конформация и свойства альбуминовых центров изменяются [17]. В литературе имеется много данных, свидетельствующих о том, что альбумин в комплексе с гомоцистеин-тиолактоном (или гомоцистеинилированный альбумин) подвергается модификации и приобретает аутоантигенные свойства [115, 126], и поэтому инициирует гуморальный иммунный ответ. В нашей работе исследована динамика аутоантител к альбумину, модифицированному как гомоцистеин-тиолактоном, так и самим гомоцистеином.
Исследованные аутоантитела в литературе рассматриваются, прежде _всего, как- факторповреждения 41—инициации—атеросклеротического- -процесса на фоне гипергомоцистеинемии [59]. Согласно известным данным, иммунные комплексы, фиксируясь на мембране эндотелиоцитов, активируют систему комплемента с последующим образованием спектра повреждающих медиаторов, вызывают выделение из клеток, имеющих Fc-рецепторы, лизосомальные ферменты и активные формы кислорода. Описанные эффекторные механизмы, завершающие аутоиммунный ответ на циркулирующий в кровотоке антиген, приводят к очаговому повреждению эндотелия с последующим формированием атеросклеротической бляшки.
Однако любой иммунный ответ первоначально имеет защитное значение, и в нашем экспериментальном исследовании продемонстрировано, что образующиеся к модифицированному альбумину аутоантитела, являются одним из механизмов элиминации гомоцистеина и его производного гомоцистеин-тиолактона. Можно полагать, что при достаточно хорошем клиренсе из кровотока циркулирующих иммунных комплексов (например, путем фагоцитоза), аутоантитела несут защитную функцию, контролируя тем самым уровень гомоцистеина в пределах физиологических значений. Но в случае ослабления механизмов элиминации из циркуляции иммунных комплексов, они преципитируют на эндотелии и оказывают повреждающий эффект.
Наличие аутоантител к альбумину, модифицированному гомоцистеином у интактных крыс до введения им экзогенного тиола (табл. 1), говорит о том, что этот комплекс вызывает иммунизацию при физиологических концентрациях гомоцистеина. Сформировавшийся гуморальный иммунный ответ сопровождается сохранением в организме В-клеток памяти, которые при последующих встречах с антигеном обеспечивают вторичный иммунный ответ. Этим можно объяснить возрастание титра аутоантител у интактных крыс через 6 часов после поступления организм экзогенного—гомоцистеина -и гомоцистеин тиолактона. Уровень гомоцистеина (табл. 3) у интактных крыс после его введения не отличался от исходного на фоне роста титра аутоантител, что свидетельствует об их регуляторной функции, направленной на поддержание концентрации гомоцистеина в пределах физиологических значений.
У крыс, которым вызвали иммунодефицит, содержание гомоцистеина в сыворотке крови изначально (до введения экзогенных аминотиолов) значимо выше, чем у интактных (табл. 7). Этот факт также позволяет предполагать наличие регуляторной роли аутоиммунного ответа на модифицированные гомоцистеином белки. Содержание аутоантител к альбумину, модифицированному как гомоцистеином (табл. 5), так и гомоцистеин-тиолактоном (табл. 6) сопоставимо с интактными животными как до, так и после введения экзогенных гомоцистеина и его тиолактона. Таким образом, иммунная система не отвечает развертыванием иммунного ответа с образованием аутоантител на поступивший извне антиген. Соответственно не происходит такого ответа и в течение 9 дней эксперимента.
На фоне описанных изменений мы наблюдали резкий подъем в плазме крови уровня гомоцистеина, в сравнении с исходным, после его инъекции экспериментальным животным (табл. 7). На фоне введения гомоцистеин-тиолактона уровень эндогенного гомоцистеина также, по нашим данным, повышался почти в 2 раза, что можно объяснить образованием гомоцистеина из тиолактона под действием гомоцистеин-тиолактоназы. По прошествии девяти суток введения тиолов уровень эндогенного гомоцистеина по прежнему оставался почти в 2 раза выше у иммунодефектных крыс по сравнению с интактными. — После девятидневного введения тиолов—уровень гомоцистеина в сыворотке крови не отличался от его содержания до нагрузки. Возврат уровня гомоцистеина к (исходному) донагрузочному уровню у иммунодефектных крыс через 9 суток, вероятно, связан с включением других, более отсроченных, механизмов его элиминации (реметилирование в метионин ферментом метионинсинтетазой при участии фермента МТГФР и превращение в цистеин под действием ЦРС).
Все вышеизложенные факты подчеркивают роль иммунной системы в поддержании уровня гомоцистеина в пределах физиологических цифр, путем элиминации модифицированного альбумина.
Данные, полученные при исследовании ЦИК в эксперименте, можно объяснить снижением степени элиминации иммунных комплексов из кровотока путем фагоцитоза в результате снижения числа фагоцитирующих клеток на фоне применения цитостатика, а также развитием дисфункции эндотелия на фоне повышения уровня гомоцистеина.
