Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Физико - математический формализм для исследования термодинамики специфических и слабых взаимодействий в бинарных и тройных растворах биомолекул. с. 13
Глава 2. Термодинамические характеристики бинарных водных растворов аминокислот, пептидов и макроциклических лигаидов. с.25
2.1. Водные растворы аминокислот и пептидов. с.26
2.2. Влияние структуры краун-эфиров, криптандов и циклодекстринов на их гидратацию и ассоциацию. с.49
Глава 3. Термодинамика и механизм взаимодействия аминокислот и пептидов с макроциклическими лигандами и супрамолекулярные комплексы на их основе. с.68
3.1. Взаимодействие 18-краун-6 эфира с аминокислотами в водных и неводных растворах. ЯМР-спектроскопия растворов. с.68
3.2. Взаимодействие краун-эфиров с пептидами. с.79
3.3. Объемные характеристики взаимодействия аминокислот и пептидов с краун-эфирами в воде. с.92
3.4. Взаимодействие аминокислот с криптандом [222]. с.98
3.5. Слабвіе и специфические взаимодействия неполярных и ароматических аминокислот с цикло декстринами. ЯМР-спектроскопиия растворов. с. 103
3.6. Аддитивность групповых вкладов при взаимодействии пептидов с циклодекстринами. с, 118
3.7. Структура и термокинетика разложения супрамолекулярных комплексов краун/пептид/НгО. с. 123
Глава 4. Термодинамические характеристики взаимодействия некоторых карбоновых кислот с циклодекстринами. сЛ 37
4.1 Взаимодействие лимонной кислоты с сахаридами и циклодекст ринами. с.137
4.2. Термодинамика взаимодействия аскорбиновой кислоты с сахаридами. с. 145
4.3. Избирательное взаимодействие аскорбиновой кислоты с
циклодекстринами. ЯМР-спектроскопия растворов лимонной и аскорбиновой кислот с циклодекстринами. с. 149
Глава 5. Термодинамика взаимодействия оснований нуклеиновых кислот с аминокислотами и пептидами. сЛ 57
5.1. Гидратация и ассоциация оснований нуклеиновых кислот. с. 157
5.2. Взаимодействие оснований нуклеиновых кислот с аминокислотами. с. 162
5.3. Взаимодействие оснований нуклеиновых кислот с пептидами.с. 174
Глава 6. Термодинамика и молекулярный механизм взаимодействий в водных растворах нуклеиновых оснований и макроциклических лигандов, с. 179
6.1. Взаимодействие нуклеиновых оснований с а-циклодекстрином. с. 179
6.2. Взаимодействие нуклеиновых оснований с (3-циклодекстрином. с, 183
6.3. Структурные особенности взаимодействий нуклеиновых оснований с циклодекстринами и 18-краун-6 из данных ЯМР-спектроскопии. с Л 86
Глава 7. Роль растворителя в процессе «молекулярного узнавания» биомолекул. с. 193
Основные результаты и выводы. с.201
Список литературы. с.205
Приложение. с.235
- Физико - математический формализм для исследования термодинамики специфических и слабых взаимодействий в бинарных и тройных растворах биомолекул.
- Водные растворы аминокислот и пептидов.
- Взаимодействие 18-краун-6 эфира с аминокислотами в водных и неводных растворах. ЯМР-спектроскопия растворов.
- Взаимодействие лимонной кислоты с сахаридами и циклодекст ринами.
- Гидратация и ассоциация оснований нуклеиновых кислот.
Введение к работе
. Актуальность работы.
Проблемы изучения межмолекулярных взаимодействий и комплексообразования в системах содержащих сольватированные биомолекулы и макроциклические лиганды актуальны для фундаментальной химии и представляют значительный практический интерес.
Все известные направления использования синтетических макроциклических соединений - краун-эфиров и природных циклодекстринов основаны на их уникальной способности к избирательному комплексообразованию с катионами и нейтральными молекулами. Выбор молекул "гостей" макромолекулами-хозяевами обусловливается принципом комплементарности и составляет основу протекания многих биохимических процессов, таких как ферментативный катализ, мембранный транспорт, взаимодействия антиген-антитело и т.п. Принцип «молекулярного узнавания» является определяющим при использовании краун-соединений и их производных для разделения биомолекул (например, аминов и аминокислот) и для создания новых комплексных соединений обладающих уникальными свойствами.
Несмотря на важность таких объектов, они изучены в основном структурными методами в кристаллическом состоянии, и механизм взаимодействий до сих пор не ясен. В литературе имеется лишь ограниченное количество работ, посвященных анализу термодинамических аспектов «молекулярного узнавания» в растворах, роли растворителя и сольватации реагентов, по-видимому, из-за отсутствия соответствующих экспериментальных методик определения термодинамических характеристик сложных комплексных взаимодействий, включающих как слабые силы, так и силы, приводящие к образованию супрамолекулярных комплексов.
Поэтому комплексное физико-химическое исследование природы, энергетики и механизма межчастичного взаимодействия широкого ряда биомолекул с макроциклическими лигандами, обладающими различной структурой полостей и характером связывания молекул гостей, является актуальным как с точки зрения развития химии супрамолекулярных соединений, так и приоритетных направлений биохимии, биотехнологии, фармакологии.
Цель работы. Целью настоящей работы является установление общих
закономерностей в термодинамике реакций молекулярного
комплексообразования в водных растворах модельных биологических и макроциклических соединений с различной химической природой полости.
Для ее выполнения необходимо решение следующих задач: - провести экспериментальное термодинамическое исследование энергетики межмолекулярных взаимодействий в водных растворах содержащих ряд аминокислот, пептидов, пищевых кислот, нуклеиновых оснований и макроциклических лигандов (краун-эфиры, криптанды, цикл о декстрины);
провести обобщение термодинамических характеристик реакций комплексообразования с позиций сольватационного подхода;
адаптировать физико-математический формализм для расчета термодинамических характеристик (энтальпийной (АН), энтропийной (AS) составляющих, энергии Гиббса (AG) и энтальпийных коэффициентов hw ) при изучении «слабых» и «сильных» взаимодействий в тройных растворах, содержащих модельные биологические и макроциклические соединения;
определить способность рассматриваемых макроциклических соединений к избирательному связыванию («молекулярному узнаванию») модельных биомолекул в кристаллическом состоянии и в воде и выявить роль «слабых» нековалентных и специфических сил при взаимодействии;
на основе данных ЯМР-спектроскопии выявить особенности молекулярного механизма взаимодействия изучаемых молекул.
Научная новизна работы.
Впервые проведено термодинамическое и структурное исследование
комплексообразования пептидов с краун-эфирами в водном растворе и
супрамолекулярные соединения пептид/краун/вода выделены в виде
кристаллогидратов. Показана возможность образования молекулярных
комплексов в водных растворах аминокислот, пищевых кислот, нуклеиновых
оснований с циклодекстринами основанных на избирательности
взаимодействия изученных соединений (принципах «молекулярного узнавания»). Предложены термодинамические критерии, позволяющие классифицировать взаимодействие как слабое или приводящее к молекулярному комплексообразованию.
Показано, что комплексообразование ряда биомолекул с двумя классами макроциклических лигандов: краун-эфирами и циклодекстринами имеет различный молекулярный механизм. Впервые исследована высокая избирательная способность циклодекстринов к комплексообразованию с нуклеиновыми основаниями и пищевыми кислотами, обусловленная возможностью взаимодействия как внутри полости, так и на поверхности цикл о декстрина.
Впервые для изучения таких систем предложен термодинамический метод, основанный на физико-математическом формализме вириальных разложений избыточных энтальпий растворов и расчетах термодинамических функций образования, позволяющий комплексно изучать как слабые, так и сильные специфические взаимодействия, приводящие к образованию молекулярных комплексов в растворах биологических и макроциклических соединений с ограниченной растворимостью.
На основе комплексного анализа полученных экспериментальных данных выявлено влияние природы, строения и сольватации молекул реагирующих веществ на межмолекулярные взаимодействия в растворах содержащих различные функциональные биомолекулы и макроциклические соединения. Выявленные закономерности позволяют прогнозировать термодинамические характеристики взаимодействия исследованных классов молекул.
Практическая значимость.
Полученные результаты и выявленные закономерности позволяют моделировать синтез новых супрамолекулярных соединений обладающих слоистой структурой полярных и неполярных областей в кристаллическом состоянии и закладывают научную основу для создания нового класса супрамолекулярных материалов.
Полученный в работе большой объем экспериментальных данных по термодинамике взаимодействия в тройных растворах, содержащих аминокислоты, пептиды, нуклеиновые основания, пищевые кислоты, краун-эфиры и цикл о декстрины, пополняет банк данных по термодинамике и является научной основой для разработки технологий селективного разделения биомолекул, синтеза высокоэффективных лекарственных и пищевых веществ пролонгированного действия.
Выявленные закономерности и механизмы взаимодействия биомолекул с краун-эфирами и циклодекстринами в водных растворах позволяют глубже понять особенности протекания таких биохимических процессов, как мембранный транспорт, ферментативный катализ и т.д. Обнаруженная способность циклодекстринов к молекулярному узнаванию нуклеиновых оснований в водных растворах может найти практическое использование при разработке процессов инкапсулирования и в решении проблем, связанных с повышением растворимости этих соединений в водной среде. В случае изученных взаимодействий циклодекстрина с пищевыми кислотами эффект комплексообразования можно использовать для понижения их кислотности и регулирования органолептических характеристик их растворов. Апробация работы.
Результаты исследований были представлены и обсуждались на II Международном симпозиуме «Макроциклические лиганды для разработки новых материалов» (Буэнос-Айрес, Аргентина, 1994), VI Международной конференции по калориметрии и термическому анализу (Закопане, Польша, 1994), I Международной конференции по биокоординационной химии (Иваново, 1994) VI Международной конференции «Проблемы сольватации и комплексообразования в растворах» (Иваново, 1995), Международной конференции по термодинамике, экспериментальной калориметрии и термическому анализу (Закопане, Польша, 1997), VII Международной конференции «Проблемы сольватации и комплексообразования в растворах» (Иваново, 1998), 1-ой Международной конференции по супрамолекулярной науке и технологии (Закопане, Польша, 1998), XXII Всероссийском Чугаевском совещании по химии комплексных соединений (Иваново, 1999), VIII Международной конференции «Проблемы сольватации и комплексообразования в растворах» (Иваново, 2001), XX Международной Чугаевской конференции по координационной химии (Ростов-на-Дону, 2001), 2-ом Международном Симпозиуме «Молекулярный дизайн и синтез супрамолекулярных архитектур (Казань, 2002).
Диссертация выполнена в соответствии с планами научно-исследовательских работ ИХР РАН по научным темам: «Физическая химия
супрамолекулярных комплексов биомолекул с макроциклическими соединениями» 1991-2001 гг. (№гос.рег. 01.9.30 005102) и «Физико-химическое исследование супрамолекулярных комплексов, представляющих интерес для пищевой технологии» 2001-2004 гг. (№госрег 01.2.00 1 03068) при финансовой поддержке: Международного научного фонда (Фонд Сороса) - гранты RLQOOO, RLQ300; гранта Конкурса-экспертизы 1997 г. научных проектов молодых ученых РАН по фундаментальным и прикладным исследованиям. Часть экспериментальных данных была получена в Институте физической химии ПАН (г.Варшава).
Основное содержание диссертации опубликовано в 1 коллективной монографии, 47 статьях и 17 тезисах докладов.
Физико - математический формализм для исследования термодинамики специфических и слабых взаимодействий в бинарных и тройных растворах биомолекул.
Высокая селективность процессов, происходящих в биологических системах и их каталитический эффект определяются комплементарностью взаимодействующих молекул и природой образующихся специфических связей. Однако, кроме достаточно сильного комплексообразования, большую роль в биохимических реакциях играют слабые взаимодействия и влияние растворителя (сольватация). Выбор термодинамического подхода, описанного ниже, в качестве метода исследования был предопределен желанием взаимосвязано изучить указанные процессы и преследовал следующие цели:
описать эитальпийиые характеристики взаимодействия указанных биомолекул между собой в воде и на их основе выявить роль «слабых» и специфических сил во взаимодействии;
рассчитать термодинамические характеристики комплексообразования в случаях, где оно имеет место и на их основе с использованием структурных данных предложить молекулярный механизм, согласно которому происходит связывание;
выявить влияние природы, структуры и сольватного состояния изученных соединений на характер их взаимодействия друг с другом.
Термодинамический подход к исследованию слабых взаимодействий в тройных системах биомолекул базируется на вириальных разложениях избыточных термодинамических функций раствора и впервые применен в теории МакМиллана - Манера [8]. Этот формализм основан на использовании коэффициентов парных и тройных взаимодействий для описания слабых гетеротактических взаимодействий в водных растворах [9-12]. Его суть сводится к тому, что экспериментальные данные представляются полиномами по степеням концентрации, коэффициенты которых передают вклады от парных, тройных и т.д. взаимодействий молекул между собой в данную термодинамическую характеристику.
Систематизация уравнений данного метода и анализ смысла находимых из них величин подробно приведены в обзоре [7].
Важными результатами теории МакМиллана-Майера являются доказательства формальной аналогии разложений для разбавленного раствора и неидеального газа, установление связи коэффициентов разложений с корреляционными функциями предельно разбавленного раствора. Данный подход получил широкое развитие и в частности для изучения растворов биологически важных соединений.
Водные растворы аминокислот и пептидов.
Интерес к макроциклическим соединениям возник с тех пор, когда было обнаружено, что они подобны по своей структуре и свойствам природным биологически активным молекулам, таким как антибиотики, энзимы, рецепторы лекарственных препаратов и способны к селективному комплексообра-зованию с ионами металлов и с различными низкомолекулярными соединениями [2,4,28]. Благодаря этому свойству они нашли широкое применение в качестве моделей ферментов при изучении рецептор - субстратного («хозяин» - «гость») комплексообразоваиия. Макроцикл ические лигандьт играют значительную роль в таких биологических процессах, как иммунный ответ и транспорт через мембраны. Поэтому важность изучения их способности к узнаванию модельных биомолекул очевидна.
Для исследований реакций комплексообразоваиия нами выбраны ли-ганды, имеющие диаметрально противоположные гидратационные свойства своих полостей. Краун-эфиры - это типичные макроциклические лиганды обладающие полярной гидрофильной полостью, тогда как изученные цикло-декстрины имеют неполярную гидрофобную полость (рис.2.1). В качестве молекул «гостей» изучен ряд небольших биомолекул.
Учитывая, что основными составными частями большинства биомолекул являются аминокислоты и небольшие петиды в данной главе на основе термодинамических характеристик растворов изучены их молекулярная гидратация и энергетика межмолекулярных взаимодействий растворенных молекул «гостя» друг с другом. Поскольку изучаемые процессы молекулярного комплекс оо бразования протекают в водных растворах здесь также представлены результаты исследований водных растворов макроциклических лигаидов.
Взаимодействие 18-краун-6 эфира с аминокислотами в водных и неводных растворах. ЯМР-спектроскопия растворов.
Константы устойчивости комплексов рассматриваемых аминокислот с краун-эфиром в воде [159,160] значительно ниже (табл. 3.1), чем в спиртовой среде [21], что связано с более сильной сольватацией участников реакции в воде. Константы равновесия реакций комплексообразования увеличиваются в порядке L-аланин глицин L-фенилаланин L-пролин « L-валин L-лейцин. Как известно значения Кс зависят от конкуренции между комплексообразованием и сольватацией молекул «хозяина» и «гостя». Чем сильнее сольватированы участники реакции, тем процесс образования комплекса менее эффективен. Кроме того, может возникнуть дополнительное стерическое препятствие для взаимодействия с макроциклическим кольцом в случае, когда метильная группа присутствует в боковой цепи аминокислоты. Несмотря на это, более сильно специфически гидратиро ванный глицин имеет большую константу устойчивости по сравнению с менее гидратированным аланином. В этом случае, по-видимому, решающее влияние на комплексообразование оказывают стерические структурные факторы. Однако, константа устойчивости комплекса 18-краун-6 с L-валином, имеющим большую неполярную группу, в два раза больше константы устойчивости комплекса 18-крауы-6 с глицином, что можно объяснить дополнительным гидрофобным взаимодействием. Подтверждая это заключение, L-лейцин образует еще более устойчивый комплекс. Стабилизация комплексов, образованных аминокислотами с большими неполярными группами, обусловлена стремлением комплексной частицы к уменьшению общей гидрофобной площади, доступной для молекул воды. Значения термодинамических характеристик можно объяснить, принимая во внимание гидратацию молекул «хозяина», «гостя» и комплекса. В ряде случаев обнаружено, что энтальпия комплексообразования АСН линейно зависит от энтальпии гидратации аминокислоты Д]іусігН (АК) (рис.3.2). Анализ зависимости ДСН = ЛАіУсігНС(АК)) показывает, что при увеличении энтальпии гидратации аминокислоты комплексообразование становится энтальпийно неблагоприятным, но более энтропийно стабилизированным.
Взаимодействие лимонной кислоты с сахаридами и циклодекст ринами
Практическое использование лимонной кислоты (рис.4.1) разнообразно. Она входит в состав лекарственных и косметических препаратов, применяется как ароматизирующее вещество и консервант пищевых продуктов [219-221], Кроме того, лимонная кислота обладает биологической активностью, участвуя в процессах метаболизма (цикл Кребса) и являясь катализатором реакций изомеризации Сахаров [222]. Однако ее способность к взаимодействию с другими биомолекулами рассмотрена в литературе очень ограниченно. В ходе проведенного нами исследования изучено взаимодействие лимонной кислоты с моно- и олигосахаридами, которые обладают разнообразной биологической активностью, а циклодекстрины, в частности, являются моделями ферментов и инкапсулирующими материалами. Основная задача исследования состояла в количественном описании взаимодействий сахаридов с лимонной кислотой с позиций сольватационного подхода и в выявлении влияния природы и строения молекул рассматриваемых соединений на характер их межчастичного взаимодействия.
Гидратация и ассоциация оснований нуклеиновых кислот.
Аминокислоты, пептиды и нуклеиновые основания (НО) участвуют практически во всех процессах, происходящих в живом организме. Целый ряд лекарственных препаратов, в частности антибиотиков и противораковых средств, содержит пиримидиновые нуклеиновые основания и ароматические кольца аминокислот. Известно, что действие многих лекарств основано на явлении прослаивания ароматических колец АК между плоскостями НО в спиральной структуре ДНК - интеркаляции. Кроме того, изучение взаимодействий аминокислот и пептидов с нуклеиновыми основаниями в водных растворах представляется перспективным в качестве модельного для исследования таких фундаментальных биохимических реакций, как взаимодействие «пептид - нуклеиновая кислота».
5.1. Гидратация и ассоциация оснований нуклеиновых кислот.
Известно, что НО (рис.5.1) в водных растворах находятся в гидратированном состоянии и ассоциируют друг с другом. Так как расположение полярных групп в НО различно, то можно предполагать различия в их гидратации, которые влияют на взаимодействия между основаниями в воде. Это подтверждается исследованиями рисунка воды вокруг четырех оснований: гуанина, аденина, цитозина и тимина по данным кристаллографического анализа [248]. Обнаружены конформационно -зависимые различия как в геометрии, так и в степени гидратации оснований. Ассоциация НО в воде достаточно полно изучена и не вызывает сомнений. Например, самоассоциация Ade исследована в работе [249].
