Содержание к диссертации
Введение
1. Анализ литературных данных о структуре и свойствах двуспиральных нуклеиновых кислот в растворе
1.1. Представление о различных конформациях дву-спиральных полинуклеотидов по данным рент-генострунтурного анализа 10
1.2. Изучение конформаций двуспиральных, нуклеиновых кислот в растворе методом кругового дихроизма 19
1.3. Взаимодействие ионов металлов с нуклеиновыми кислотами в растворе 33
2. Обзор литературных данных о калориметрическом исследовании некоторых биохимических процессов
2.1. Измерительная техника в калориметрии, растворов биополимеров 37
2.2. Калориметрический метод изучения в растворе процессов компленсообразования нуклеиновых кислот с ионами металлов и с биологически активными соединениями 43
3. Характеристики;исследованных веществ методика измерений
3.1. Характеристики исследованных в работе препаратов нуклеиновых кислот, солей и растворителей 59
3.2. Приготовление и характеристики растворов 60
3.3. Аппаратура и методика налориметричесних измерений 62
З.4. Аппаратура и методика оптических и потенциометричесних измерений 72
4. Конформционный в - а переход в водных растворах неэлектролитов
4.1. Расчет коэффициентов активности воды в смесях вода-этанол-изопропанол, вода- этанол-дионсан 75
4.1.1. Система вода-этанол-изопропанол. 75
4.1.2. Система вода-этанол-диоксан 83
4.2. В - А переход ДНК в тройных системах вода-этанол- дионсан, вода-этанол-изопропанол 84
4.3. Определение энтальпии В - А перехода ДНК в водно-этанольном растворах 91
4.3.1. Калориметрическое определение энтальпий реакций хлорида гуанидиния с ДНК в В- и А- конформациях в растворе 91
4.3.2. Энтальпия В - А перехода ДНК в смесях этанол-вода 98
5. Термодинамические характерйстжи комплексных соединений солей серебра с нуклеиновыми кислотами в в- .и а- конформациях в растворе
5.1. Калориметрическое определение энтальпии образования комплексов ионов серебра с В-формой ДНК в растворе 114
5.2. Термодинамические характеристики комплексов дву цепочечной РНК (А-форма) с ионами серебра в растворе 118
5.2.1. Результаты изучения спектров КД Комплексов дн.РНК -Ag+ 118
5.2.2. Определение констант устойчивости комплексов дн.РНК -Ag+ 124
5.2.3. Энтальпии образования, комплексов дн.РНК с ионами серебра в растворе 128
5.3. Термодинамичесние характеристики номпленсов ионов серебра с синївтичесними полину влеотидами в растворе 133
Оосновные итоги и выводы 147
- Изучение конформаций двуспиральных, нуклеиновых кислот в растворе методом кругового дихроизма
- Взаимодействие ионов металлов с нуклеиновыми кислотами в растворе
- Калориметрический метод изучения в растворе процессов компленсообразования нуклеиновых кислот с ионами металлов и с биологически активными соединениями
- Аппаратура и методика налориметричесних измерений
Введение к работе
Экспериментальные исследования структурных особенностей, свойств и специфических взаимодействий нуклеиновых кислот (НК) в растворе, проведенные за последние десять лег при помощи как традиционных, так и новейших физико-химических методов, позволили получить весьма важные результаты. Эти результаты вместе с данными теоретических и расчетных методов позволяют в настоящее время связать определенные физико-химические свойства этих макромолекул с их функцией хранения и передачи информации.
Актуальность проблемы. Важными достижениями, касающимися структуры НК, явилось доказательство полиморфизма двухцепочеч-ной спирали, а танке доказательство способности структуры двуспиральных полинуклеотидов непрерывно менять свою геометрию в ответ на изменения условий среды. Различные стурктурные формы НК объединены в настоящее время по геометрическим критериям в несколько яинформационных семейств (A, B,z ). Конформацион-ные переходы в пределах каждого семейства ненооперативны и заключаются в плавним изменении параметров двойной спирали, а межсемейственные переходы являются кооперативными и обусловлены скачкообразным изменением конформации углеводофосфатного остова.
Различные конформации НК реализуются в процессе жизнедеятельности Клетки при образовании комплексов макромолекулы с разными лигандами и в первую очередь с регулягорными белками и ферментами, а также различными низкомолекулярными соединениями. Подобные специфические взаимодействия с одной стороны не могут не зависеть от конкретной конформации макромолекулы, а с другой стороны такие взаимодействия дожны приводить к изменению конформации.
Дальнейшие исследования различных двуспиральных конформа-ций и переходов между ними, а танже изучение комплексов НК с малыми молекулями и с ионами металлов в растворе являются важными и перспективными как с физико-химической, так и с биологической точни зрения.
Настоящая работа выполнена в соответствии с Координационными планами АН СССР по проблеме 2.19.3.1 - "Термодинамика взаимодействия низкомолекулярных веществ с биополимерами в растворе", и по проблеме 2.28.2.1 - "Структура и физико-химические свойства нуклеиновых кислот и белков в связи с их функциями; принципы взаимодействия нуклеиновых кислот и белков"; с планом основных направлений научно-исследовательских работ МХТИ им. Д.И.Менделеева по теме "Комплексное исследование физико-химических, теплофизичесних и других фундаментальных свойств веществ и материалов", а также находится в рамках основного научного направления кафедры Общей и неорганической химии МХТИ им. Д.И.Менделеева.
Целью работы является детальное изучение В-А конформацион-ного перехода дезоксирибонуклеиновой Кислоты (ДНК) в тройных системах вода-этанол-изопропанол и вода-этанол-диоксан методом оптического кругового дихроизма (КД); определение термодинамических характеристик В-А перехода ДНК в системе вода-этанол; определение термодинамических характеристик процесса образования комплексов ионов серебра с нуклеиновыми кислотами различной конформации.
Научная новизна. Основной экспериментальный материал диссертации получен впервые. Получены спектры КД ДНК в области В-А перехода в системах вода-этанол-изопропанол, вода-этанол- -диоксан. Проведен расчет активности воды в изученных системах,
Который показал, что В-А переход ДНК происходит в области величин активности воды 0,76 - 0,83, Построены диаграммы состояния: состав раствора - активность воды и состав раствора - кон-формация ДНК,
В работе калориметричесним методом определены энтальпии реакции компленсообразования хлористого гуанидиния с ДНК в водно-этанольных растворах. Проведена оценка величины энтальпии конформационного А-В перехода ДНК и установлено, что А- и В- формы ДНК энергетически близки.
Калориметрическим и оптическим методами определены термодинамические характеристики процессов образования комплексных соединений серебра с ДНК (В-форма), с двуцепочечной рибонуклеиновой кислотой (дн. РНК) (А-форма) и с синтетичесними полинуне-гидами (с полиадениловой кислотой (поли-А), с полиуридиловой кислотой (поли-У), и с комплексом(поли-А * поли-У) в растворе. Установлено, что основной вклад в изменение энергии Гиббса комплексообразования для всех изученных систем вносит энталь-пийный член, а также, что комплексы с В- и А- конформациями различаются по термодинамическим характеристикам.
Практическая ценность. Результаты экспериментального изучения межсемейственного В-А перехода ДНК, проведенного в настоящей работе, могут быть использованы в дальнейших исследованиях, направленных на выяснение природы и механизмов молекулярных биологических процессов с участием НК различной конфор-мации. Эти результаты могут служить также основой для понимания того, как ДНК упакована в хромосомах и в вирусных частицах; какие изменения структуры ДНК возможны и происходят с ней при взаимодействии с белками, а также с низкомолекулярными соединениями, в процессе метаболизма клетки (репликации, рекомбина- ции или трансврипции).
Полученные в работе термодинамичесвие харавтерисгиви вомплевсообразования ионов серебра с НК (ДНК, дн.РНК, синтетические полинувлеогиды) в растворе способствуют пониманию природы и механизма влияния ионов серебра на митотичесвий цивл влет-ви, а тавже их бавтерицидного и мутагенного действия.
Результаты работы могут служить основой метода установления вторичной струвтуры НК в составе нувлеопротеидных вомплев-сов, учитывая селективность связывания ионов серебра с различными основаниями двуспиральных полинувлеотидов.
Термодинамичесвие характеристики изученных вомплевсов могут помочь танже выяснению механизмов -химиотерапевтичесяого-действия противоопухолевых препаратов, в состав воторых входят ионы тяжелых металлов*
Апробация работы. Результаты настоящей работы были доложены на ІУ Всесоюзном совещании по вонформационным превращениям биополимеров в растворе (1975 г., Тбилиси), на совещании "Изменение струвтуры и свойств воды и водных систем под влиянием физических факторов" (1977г., Ленинград), на Международной вонференции по биовалориметрии (сентябрь 1981 г., Тбилиси), на ХУП научно-техничесвой вонференции молодых ученых МХТИ им. Д.И. Менделеева (1981 г.), где работе присуждена премия; а тавже регулярно обсуждались на заседаниях вафедры общей и неорганической химии МХТИ им. Д.И. Менделеева; семинарах Лаборатории физиви биополимеров Института моленулярной биологии АН СССР и на семинарах лабораторий математичесвого моделирования ВНИИ-Генетива.
Публивации. По материалам диссертации опубликовано 7 научных работ.
Объем работы. Диссертация состоит из введения, 5-ти глав, выводов и списка цитированной литературы.
В первой главе рассматриваются современные представления о структуре и свойствах комплементарных нуклеиновых кислот различной конформации в растворе.
Вторая глава посвящена обзору данных о применении калориметрии к исследованию макромолекул, а также проанализированы литературные данные по калориметрическому изучению в растворе процессов комплексообразования НК с ионами металлов и с низкомолекулярными биологически активными соединениями.
В последующих главах излагаются методика измерений; результаты изучения кинформационных переходов ДНК в смешанных растворителях; результаты определения энтальпии конформацион-ного В-А перехода ДНК в водно-этанольных растворах; результаты определения термодинамических характеристик комплексов ионов серебра с ДНК, дн.РНК и с синтетическими полинуклеотидами в растворе.
Изучение конформаций двуспиральных, нуклеиновых кислот в растворе методом кругового дихроизма
Метод кругового дихроизма (КД) в настоящее время широко используется для изучения структуры различных классов соединений. Сущность метода КД заключается в том, что любое оптически активное вещество по разному поглощает левый и правый цирку- лярно-поляризованный свет. Разность коэффициентов поглощения левого и правого цирнулярно-поляризованного овета ДЕ = Ц.- Ьр и является мерой кругового дихроизма, т.н. в полосе поглощения изменяется не только скорость, но и амплитуда световой волны. КД тесно связан с явлением аномальной дисперсии оптического вращения (ДОВ); фактически оба эти метода представляют собой два способа изучения явления взаимодействия поляризованного света с оптически активными молекулами. Количественно эта связь выражается соотношениями Кронинга-Крамерса [42] , ното-рые позволяют преобразовывать спектры КД и ДОВ один в другой. Однако измерение спектров КД имеет существенное преимущество перед измерением ДОВ и связано с тем, что КД отличен от нуля тольно в полосе поглощения, в то время как вращение поляризации имеет заметную величину и вдали от полосы поглощения. Кривая КД для простого оптического перехода имеет нолоно-лообразную форму, аналогичную форме кривой поглощения с экстремумом в максимуме полосы поглощения (неконсервативный тип спентра КД). В случае расщепления полосы КД на две полосы равной интенсивности и противоположного знана мансимуму полосы поглощения соответствует нулевой дихроизм и алгебраическая сумма вращательных сил полос, которая характеризует "степень" поворота плоскости поляризации, равна нулю (консервативный тип спентра КД). Для многих оптически активных соединений теория КД [42 , 4з] позволяет объяснить происхождение разностей ЧА Сіп и усыновить связь этих величин со строением вещества . КД НК слагается из собственно дихроизма нунлеотидов, обусловленного ассиметричностью сахара, и компонента, связанного с взаимодействием спирально расположенных оснований (модель Джонсона и Тиноко [43J (рассматривает только этот вклад),а также компонента, индуцируемого в основаниях электростатическим полем ассимешрично расположенных зарядов фосфатных групп [4-4-] . Измерения спектров КД НК в водных растворах впервые были проведены Брамсом и Моммертсом [ji-5, 4-6J . В этих, как и в более поздних работах других авторов м-7, 4-0J спектры КД комплементарных РНК содержали положительную полосу в области 260-270 нм и отрицательную полосу меньшей интенсивности - в области 230-24-0 нм (рис. 1.3). Такой неконсервативный характер неизменно присущ спектрам КД двуспиральных РНК разного происхождения и комплементарных полирибонунлеотидов [_8, 22 J . Спектр КД двойной спирали ДНК имеет нулевой дихроизм вблизи 260 нм и две полосы малой интенсивности и противоположного знака в 280 и 24-5 нм (В-тип спектра КД) (рис. 1.3).
Наблюдаемая значительная разница спектров КД ДНК и РНК демонстрирует чувствительность метода к конформационным особенностям НК. Причем метод КД оказался чувствительным также и к содержанию гуанина (Г) и цитозина (Ц) в двуспиральных полинуклеотидах, что позволило использовать этот метод для количественного определения ГЦ-состава НК )4-8, 4-9] . Однико вариация амплитуды спектров в этих случаях невелика и не отражается на их характере. В 1964- году Брамс и Моммертс H-5J получили неконсервативный спектр КД ДНК в смеси 80% об.этилового спирта и 20%об.воды, который оказался идентичным спектру КД РНК. Авторы предположили, что в этих условиях ДНК принимает А-конформацию, подобную РНК и А-форме ДНК в волокнах при низкой относительной влажности. В дальнейшем были получены спектры КД ДНК с сильно заниженной или почти отсутствующей положительной полосой в водных растворах электролитов с высокой ионной силой(порядка г NlClLt ) и Б водно-эигенгликолевых смесях [53, 54j . Связать наблюдаемые в растворе типы спектров КД с геометрией двойной спирали НК стало возможным благодаря работам [50 - 52] , в которых авторы изучали КД пденок ДНК в условиях близких к условиям рентгеноструктурных работ на волокнах ДНК. Оказалось, что при высоной относительной влажности ( 92%) наблюдаемый спектр КД можно приписать В-форме ДНК. При понижении относительной влажности до 75%, когда ДНК переходит в А-конформацию по данным рентгеноструктурных работ, наблюдался спектр аналогичный спектру КД РНК. Li- ДНК в пленке при 75% относительной влажности дала спектр подобный спектру КД ДНК в 4- - 6 М растворе NctC » ї«е» С-форму ДНК. При этом КД этих же пленок при 92% (и выше) относительной влажности практически совпал со спектрами ДНК в растворах невысокой ионной силы (В-форма) J52J .
Результат этих работ представлен на рисунке 1.3. Использование метода КД позволяет обнаружить и охарактеризовать конформации, принадлежащие разным семействам (А, В, ). Кроме того, метод КД оказался чувствительным также и к непрерывному изменению конформации двойной спирали НК в пределах каждого семейства. Этот экспериментальный факт был получен при изучении влияния концентрации противоионов на спектры КД ДНК в водном растворе _4-7, 51, I6J . Увеличение концентрации соли приводит к уменьшению положительной полосы в спектрах КД ДНК (рис. ІЛ). При этом, как видно из рисунка, в сильно концентрированном солевом растворе ( 6М LlCt или CsCt ) спектр КД становится практически идентичным реперному спектру С-подобной В-семейства формыУГИзменения спектров монотонны и при высоких концентрациях противоионов позволяют предположить существование в растворе более закрученных конформации (Т-форма; параметры см. в табл. І.І) чем С-форма. Зависимость относительного изменения амплитуды спектров КД под влиянием солей щелочных металлов, приведенная на рисун- не 1.5 [47J , показывает, что различные 1:1 электролиты в количественном отношении действуют сходным образом. Этот же рисунок демонстрирует, что переход имеет ненооперативный характер и соответствует постепенному изменению структуры в направлении В-С-Т-форм [4-7 . Эти результаты хорошо согласуются с данными работы Брема [55J , в которой независимым методом диффузного рассеивания рентгеновских лучей было также показано, что увеличение концентрации противоионов в растворе приводит к изменению параметров спирали НК. В работе 47J приводится объяснение механизма закручивающего действия ионов металлов на основе электростатического действия ионов солей на ДНК. При низкой концентрации противоионов взаимное отталкивание фосфатов противоположных цепей стремится расширить малый желоб ДНК, тем самым заставляя спираль раскручиваться. Повышение концентрации катионов нейтрализует фосфаты, так что стабилизируются формы со все более узким желобом и спираль закручивается в направлении выгодной С-подобной Конформации. Вывод об электростатической природе действия ионов металлов подтверждается при изучении водно-метанольных растворов ДНК, где из-за меньшей полярности среды по сравненш с водным раствором, закручивающее действие 1:1 электролитов проявляется при существенно меньших концентрациях противоионов. В этих условиях наблюдается специфичность действия 1:1 электролитов - закручивающий эффект возрастает в ряду солей - Al Nd /C R CS (рис. 1.6) [5б] . Авторы работ [1б, 47, 4-9J предложили следующее объяснение наблюдаемой картины: гидра-тированные катионы внедряются в малый желоб двойной спирали ДНК, в котором плотность отрицательных зарядов максимальна и "подгоняют" его под размер своей гидратной оболочки. Ион LX , как наиболее гидратированный ион, стабилизирует формы В-семей-
Взаимодействие ионов металлов с нуклеиновыми кислотами в растворе
Исследование взаимодействия нуклеиновых кислот и [родственных mi соединений с ионами металлов в растворе является одной из основных задач бионеорганической химии. Ионы металлов, необходимые для биологического функционирования НК, играют важную роль в формировании и стабильности стукртуры двуспиральных полинуклеотидов в растворе. Изменение концентрации ионов металлов, а также замена одного металла на другой приводят к искажению процессов репликации, транскрипции и трансляции [_67] . Природа влияния ионов металлов на эти процессы еще мало исследована и поэтому изучение механизма взаимодействий ионов металлов с двуспиральными полинуклеотидами в растворе представляет собой актуальную задачу как для химии НК, так и для молекулярной биологии в целом. За последние два десятилетия изучению комплексов ионов маталлов с биополимерами посвящено значительное число экспериментальных работ, результаты которых обобщены в ряде обзоров и монографий [67 - 71] . Не ставя перед собой задачу подробного изложения результатов этих работ и всей проблемы в целом, отметим лишь некоторые важные общие положения. Потенциальными "центрами связывания" ионов металлов в НК являются фосфатные группы, основания и гидроксильные группы рибозы (дезоксирибозы), то есть двойная спираль НК является лигандом, имеющим несколько координационных центров различной структуры [69] . Из трех типов центров, по-видимому, рибоза (дезоксирибоза) является наиболее слабым донором электронной плотности. Результаты изучения координационных соединений НК, в частности ДНК, различными методами [69 - 70] свидетельствуют, что связывание ионов металлов происходит преимущественно фосфатными группами и основаниями НК.
Причем по изменению относительного сродства н этим координационным центрам молекулы ДНК, ионы металлов располагаются в следующий ряд [_67 : шоны щелочных металлов - (Ме+) Me+-Mg2+-Ca2+-Co2+-M2+-Mn2+-Zn2+-Cd2+-Fe2+-Cu2+-Fe3+-Cu1+-Ag+-Hg Рост сродства к основаниям Падение сродства к фосфатной группе Как видно из приведенного ряда, фосфатная группа более активно связывает ионы щелочных и щелочно-земельных металлов, тогда как основания ДНК образуют более прочные связи с ионами d --элементов. Литературные данные указывают, что возможными центрами координации с/-элементов являются атомы Nm , U(7) аденина; N3) N(?/ гуанина; Щу цитозина; 0(v)»ml) іимина и урацила, - причем отмечается, что положение f Cfj является наиболее активным центром. Компленсоообразование с этими центрами в полинуклеотидах вызывает, по-видимому процессы, сильно изменяющие структуру макромолекул [7і] Причем характер и направление комплексообразования определяется не только природой лигандных групп макромолекулы и индивидуальностью ионов металлов, но и концентрацией ионов водорода в растворе, температурой, природой растворителя и концентрацией поддерживающего по-линукеотид электролита [68J . Следует отметить, что приводимые в литературе соображения относительно координации металлов с двуспиральными полинуклео-тидами в растворе весьма приближены, а в ряде случаев противоречивы. В настоящее время достаточно уверенно установлено, что НК проявляют конформационную обратимость при взаимодействии с ионами металлов, К такому выводу пришли авторы работ, изучавшие комплексные соединения НК с ионами металлов в растворах методами, чувствительными к величине и форме макромолекулы (вязкость, скорость седиментации, рассеивание света и др.), либо методами, чувствительными к наличию и положению хромофорных групп в полимерных цепях (ДОБ, КД, ЯМР, и др.) [67, 71] . Для характеристики процесса комплексообразования НК с ионами d -элементов используется понятие кооперативности связывания. Впервые оно было привлечено для объяснения большой разницы в прочности комплексных соединений ртути (II) с ДНК и соответствующими нуклеозидами - константа устойчивости в случае комплекса с ДНК оказалась на десять порядков больше нон-станты устойчивости с нуклеозидом Г7ІІ . Подчеркнем, что взаимодействие ионов металлов с основаниями НК характеризуются большими константами устойчивости и отличаются как насыщением при малой концентрации добавленного иона металла, так и сильной зависимостью от состава и последовательности оснований в макромолекуле [71, 72j . Вышесказанное свидетельствует о большом влиянии полимерной природы и структуры НК на процесс комплексообразования с ионами металлов.
Важно отметить также, что полифункциональная природа НК определяет возможность образования комплексов с ионами металлов сильно отличающиеся как по составу, так и по структуре. Это и чисто фосфатное связывание, смешанное связывание - и с фосфатом и с основанием, связывание основанием, сшивка двумя основаниями, образование сендвичевых структур, связывание комплементарными парами оснований [70,7lJ. В целом представления в области координационной химии НК находятся в настоящее время в стадии разработки. Очевидно, что для выяснения структуры и механизма связьшания, особую ценность представляют прямые определения термодинамических характеристик образования в растворе номпленсов ионов металлов нан с природными НК, так и с модельными системами - синтетическими гомо-и сополинунлеотидами с повторяющимся одним или двумя мономерным звеном в основной цепи. В термодинамических исследованиях биополимеров в растворе в настоящее время широко используются методы калориметрии для измерения энтальпий процессов в растворах [73 — 75J и для измерения теплоемкости и тепловых эффектов фазовых переходов ?5 - 78] . Поскольку дальнейшее изложение материала касается исключительно применения методов калориметрии в исследованиях реакций с участием НК, представляется необходимым рассмотреть разработанные к настоящему времени калориметрические установки. При этом мы не ставили перед собой задачу дать исчерпывающий обзор всех описанных в литературе калориметров; будут рассмотрены лишь несколько важных и типичных, на наш взгляд, таких установок. Учитывая общие требования, предъявляемые к прецизионным калориметрическим установкам, а также специфику исследований биополимеров в растворах (небольшие количества веществ, а следовательно малые изменения температуры в опыте), в настоящее время, главным требованием при конструировании калориметров для биохимических целей является обеспечение наибольшей чувствительности прибора при малом расходе веществ в эксперименте [79-84] . При этом высокая точность результатов измерений не всегда может быть достигнута из-за малых величин тепловых эффектов реакций с участием биополимеров (часто не превышающих в условиях эксперимента 10 3 Дж) и из-за сравнительно низкой воспроизводимости индивидуальности объекта исследования (как правило труднодоступного) и его чистоты. Необходимо отметить также проблему ("старта") начала биохимической реакции, поскольку величина теплового эффекта смешения компонентов системы зависит Б значительной степени от конструкции смесителя. Для изучения биополимеров применяются в основном смесители работающие по принципу изменения положения компонент в ячейке, а Б проточных калориметрах используются так называемые "поляризованные" смесители (рис, 2.1), При этом тепловой эффект смешения определяется в отдельном эксперименте. Б случае дифференциальных калориметров этот эффект в значительной степени скомпенсирован; остаток его является количественной характеристикой "тепловой неидентичности" ячеек (или проточных теплообменников). Рассмотрим кратко разработанные в настоящее время калориметры, технические характеристики которых представлены в таблице 2.1, более подробно остановившись на некоторых образцах серийного производства.
Калориметрический метод изучения в растворе процессов компленсообразования нуклеиновых кислот с ионами металлов и с биологически активными соединениями
Использование методов калориметрии в исследованиях реакций с участием НК имеет ряд преимуществ по сравнению со многими другими методами, использование которых связано с воздействиєм, приводящим к искажению, возбуждению или деградации компонентов изучаемой системы (например: ЯМР, ЭПР, масс-спектро-снопия и др.). Напротив, в налориметрическом опыте компоненты системы практически не разрушаются, что позволяет проводить многократные последовательные операции на одном образце. Кроме того, при калориметрическом изучении реакций в растворе не требуется оптическая прозрачность растворов, либо присутствие окрашивающих агентов для создания химических производных с подходящими спектрами поглощения, как это требуется для спектрального анализа. Однако следует отметить, что использование методов калориметрии стало возможным лишь в последние десятилетия, когда стали доступными подходящие для этих целей калориметры. Серьезной причиной медленного внедрения калориметрических измерений при исследовании биохимических реакций в растворе, по-видимому, является сложность интерпретации на молекулярном уровне определяемых этим методом термодинамических величин. Например, для реакций комплексообразования НК с низномолекулярными соединениями в растворе, как правило многостадийных, тепловой эффект, представляет собой сумму нескольких величин, среди которых можно выделить следующие: сумму тепловых эффектов образования всех связей в данном комплексе; тепловой эффект нонформацион-ных изменений взаимодействующих соединений (в большинстве случаев относящийся к молекуле биополимера); тепловой эффект сольватации и др. І79, 80, 821 . Для оценни перечисленных вкладов в величину энтальпии исследуемого процесса в настоящее время широко привлекаются данные других физико-химических методов (УФ-спектроскопия, КД, равновесный диализ, флюоресценция и др.). Одним из перспективных путей является также исследование термодинамических характеристик тех же реакций с участием модельных соединений НК [79J . В настоящее время в литературе крайне мало работ по микрокалориметрическому изучению взаимодействия двуспиральных НК с ионами металлов в растворе, В работе J94j было изучено взаимодействие ионов Ctt с ДНК различного ГЦ-состава методами УФ--спектроскопии, КД, калориметрии и техники температурного скачка (кинетические измерения). Полученные результаты по мнению авторов показывают, что при низкой ионной силе раствора (0,01 М N&NOj) возможны два типа взаимодействия, которые были классифицированы как образование соответственно "недена-турированного" и "денатурированного" комплексов.
Причем, при низкой относительной концентрации лиганда и низкой температуре образуется "неденатурированный" комплекс и ион металла связывается с различными участками оснований ДНК. В этом случае, как указывают авторы, возможны номплексообразования ионов Cll как с атомами N(7/ основания и атомами кислорода соответствующих фосфатных групп, так и с атомами М(Г) и 0(6) гуанина. Спектры КД показывают, что при образовании "неденатури-рованного" комплекса макромолекула ДНК претерпевает конформа-ционный В - С переход. Энтальпия образования "неденатурирован-ного" комплекса в растворе найдена авторами равной 0,62 - 0,02 кДж/моль пар оснований. Аналогичная величина для "денатурированного" комплекса, образующегося при увеличении концентрации ионов меди или росте температуры - 24,6 - 0,4 кДж/моль пар оснований. Данное значение совпадает с энтальпией денатурации ДНК в этих условиях. На основании результатов оптических и кинетических измерений авторы делают заключение, что в "денатурированном" комплексе ионы Си связываются с атомами N(3) цитозиновых оснований. Таким образом, в данной работе калориметрические измерения находятся в согласии с известной способностью ионов двухвалентной меди в зависимости от концентрации вызывать раскручивание ДНК в основном за счет связывания с ГЦ богатыми областями макромолекулы [69] При этом ионы меди, взаимодействуя с основаниями, способствуют раскручиванию молекулы ДНК, а при высоких концентрациях - разрушению структуры ДНК [б7, 68] . Метод калориметрии наряду с другими физико-химическими методами был использован в работе [95J при изучении взаимодействия аминатов кобальта [Со(1Лл с ДНК в водном растворе, В работе определены константы устойчивости изученных комплексов, энтальпии их образования в растворе и изменение энтропии в процессе образования. По мнению авторов комплексные ионы нобальта образуют внешнесферные ассоциаты с ДНК. Вероятно, взаимодействие осуществляется кан за счет внедрения ионов кобальта в двойную спираль, так и за счет связывания их с фосфатными группами молекул ДНК. Следует отметить также работу Кракауэра [эб] по определению энтальпии связывания ионов магния с поли-А, поли-У и их комплексами [по ли-А поли-У; [поли-А 2 поли-У)в растворе при рН = 7,0 7,2 и в присутствии N&CL различной концентрации. Измерения проводились в калориметре в е с га a n - I90C с платиновыми теплообменниками; чувствительность установки по мощности I мквт. Установлено, что для всех изученных соединений энтальпия образования комплекса в растворе зависит от степени связывания 0 , представляющей собой число молей ( й связанных с I моль нунлеотидов. Авторами найдено, что для поли-А и поли-У энтальпия образования комплекса зависит также от концентрации ионов натрия.
Экстраполяция зависимости энтальпии образования от @ в область 0=0 дала значения энтальпии образования комплекса [поли-А - Ma _- 12,50 и -6,30 кДж/моль \М$ )ПРИ концентрации NaCd 0,015 М и 0,100 М соответственно; для поли-У -Mg J 13,40 КДж/моль(№р ) и 10,0 яДк/моль(Мо при концентрации tidCt 0,015 М и 0,10 М соответственно; для шоли-А»поли-У - Mj J+ 8,0 нДж/моль(Ма У» и наконец дляГполи-Ав2поли-У-12,60 нДж/моль(М р 3« Погрешность в определении энтальпий образования комплексов не превышала 0,4 нДк/моль о ) Полученные результаты авторы объясняют тем, что при связывании ионов магния с синтетическими полинунлеотидами происходит ослабление контакта пар оснований. Оценки степени ослабления контакта оснований изученных поли-нуклеотидов, приведенные в работе,согласуются с литературными данными. Рассмотрим теперь работы по калориметрическому изучению комплексообразования двуспиральных НК с биологически активными соединениями - с аминопроизводными акридина, антибиотиками и с олиго- и поли- пептидами..;Определение термодинамических характеристик этих комплексов представляет значительный интерес для биохимии поскольку, как известно, эти низномолекулярные соединения обладают антибактериальной и мутагенной активностью [97, 99J и кроме того Комплексообразование этих соединений с ДНК может служить моделью взаимодействийвозникающих при посадке на двуспиральные полинуклеотиды более сложных соединений и в частности белков и ферментов І6, 99І . Для большинства производных аминоакридина (ПА) и ряда ан-тибиотинов обнаружено существование двух типов комплексов с ДНК [98, 99 : комплекс "сильного" типа с большой величиной энергии Гиббса образования (константа устойчивости (К) порядна 10 - 10 ), образующегося при молярном отношении концентрации низномоленулярного соединения к концентрации ДНК(моль фос- (фосфата) ДНК (степень заполнения) " 0,2;-и комплекса второго типа с К порядна I03 - 10 , который образуется при больших заполнениях НК вплоть до t = I. Следует отметить, что номпленсообразование в этих системах изменяет конформацию дву-спиральных полинуклеотидов [jSj . В работах.Квадрифоглио с соавт. [100 - 102] показано, что энтальпия реакции образования комплексов профлавина (ПФ) и бромистого этидия (БЭ) (рис. 2.2) с ДНК в области малых Т (0& 0,15) в пределах погрешности эксперимента не зависит от степени заполнения и ионной силы (табл. 2.2). Измерения проводились на проточном и "Бэч" калориметрах фирмы ЛКБ. Установлено, что в области малых Т ПФ и БЭ находятся в мономерной форме, т.е. отсутствует вклад энтальпии диммеризации этих низкомолекулярных соединений в измеряемую величину. Энтальпии номплексообразования в этих работах рассчитывали на моль связанного красителя (ПФ, БЭ), концентрацию которого определяли методами равновесного диализа и УФ-спектроснопии.
Аппаратура и методика налориметричесних измерений
Для проведения калориметрических измерений в настоящей работе использованы дифференциальный качающийся калориметр "Бэч" фирмы ЛКБ (Швеция), проточный дифференциальный калориметр "Пикера" фирмы "Сетарам" (Франция) и калориметр с изотермической оболочкой Лаборатории структуры растворов Института общей и неорганической химии АН СССР (г. Москва) [l20j . Блок-схема дифференциального "Бэч"-калориметра приведена на рисунке 3.1. Калориметрический блок расположен внутри массивного алюминиевого цилиндра и окружен теплоизолятором (пенопласт). Вся система находится в воздушном термостате, температура которого поддерживается (с точностью - 0,2 К) равной тем- пературе блока и контролируется при помощи термистора. Б качестве датчиков разности температур использованы термопары. Чувствительность термопарных элементов обеих ячеек (рабочей и сравнения) совпадает в пределах 1%. Реагенты вводятся через узкие отверстия в крышке каждой ячейки, каждая из которых разделена внутри перегородками. В перегородках калориметрических ячеек вмонтированы нагреватели для элентрической градуировки. Градуировочный тон может иметь мощность от 5 10 до 5-Ю вт. Пропускание тока осуществляется автоматически с одновременным измерением времени пропускания с точностью 0,01 сек. Смешивание реагентов осуществляется вращением калориметрической системы вокруг оси массивного алюминиевого цилиндра на 2,5 оборота. Сигнал от детектора поступает на усилитель и затем подается на самопишущий потенциометр. Ячейки калориметра выполнены из золота и имеют объем б см3 (4 + 2) (рис. 3.1). Характеристики установки приведены в таблице 2.1. Чувствительность "Бэч"-калориметра составляет I мквт (2»10 К) на шкале усиления "10 мВ" при скорости лентопротяжного механизма регистрирующего потенциометра 10 мм/мин. Энтальпии реакций рассчитывали по формуле: S - площадь под кривой соответствующих участков диаг-рамной ленты в калибровочном и основном опытах; \_С J- концентрация ДНК; V (л)- объем раствора в калориметрической ячейке.
Для проверки надежности работы калориметра были измерены энтальпия реакции образования комплекса между профлавином и ДНК в растворе и энтальпия разбавления водного раствораI та от концентрации _а С1 IOOO EgO до концентрации Пасі» 3000 ЕрОі. Полученные величины —34-,6 - 1,5 кДж/молъ и 102,5- 0,6 дж/моль соответственно - хорошо совпадают с наиболее надежными литературными данными Qo2,i2iJ . Б измерениях термодинамических характеристик комплексов ионов серебра с НК использовали проточный дифференциальный калориметр Пикера, блок-схема которого представлена на рисунке 3.2. Калориметр состоит из четырех основных блоков: I - собственно калориметрический блок; 2 - блок электроники; 3 - блок термостата с насосом эталонной циркуляции и вспомогательного оборудования; 4- - насосы подачи реагентов и регистрирующее устройство. Калориметрический блок расположен в вакуумной камере, окруженной термостатирующей рубашкой, и состоит из двух симметричных и идентичных каналов теплообменников с противотоком (эталонные теплообменники). Реагенты Aj и Вр А2 и В2 после прохождения через термостатированную зону принимают заданную температуру Т0 и поступают в смеситель, где и смешиваются. Мощность, выделяющаяся или поглощающаяся в результате реакции, в обоих теплообменниках полностью отбирается эталонным теплоносителем (вода с температурой Т0), циркулирующей со скоростью, во много раз превышающей скорость потоков реагентов. По заданной определенной частоте и фазе, зависящей от величины ожидае- мого теплового эшфекта, механический модулятор направляет эта- лонный теплоноситель на тер\стр, который детектирует разностный сигнал (относительно Д соответственно по мощности каждо-го теплообменника. Разде ше предварительно усиленных сигналов происходит в блоке демодуляции и затем подается на двухко-ординатный самопишущий потенциометр. Насосы подачи реагентов представляют собой насосы с колеблющейся осью из тефлона; они приводятся в действие синхронным двигателем. Все четыре насоса соединены механически в одном корпусе так, что сумма двух углов проекций осей каждой пары насосов, а следовательно и сумма расходов реагентов, есть постоянная величина (рис. 3.3). Колеблющаяся ось насоса дает возможность механически изменять геометрию каждой пары и таким образом менять расход реагентов от нуля до максимума.
В калориметре Пикера можно проводить калориметрическое титрование, причем благодаря механическому сочленению насосов с самопишущим потенциометром можно непосредственно записывать зависимость теплового эффекта реакции от концентрации реагентов. Теплообменники в микроналориметре выполнены из фторопласта и золота. Градуировка проводится путем подачи электрического тока в нагреватели. Технические характеристики микрокалориметра приведены в таблице 2.1. Нами была проведена модернизация систем термостатирования и эталонной циркуляции микрокалоримегра Пикера, которая заключалась в введении термостатов в эти системы объемом 10 л и I л, вместо используемых в стандартной установке сосудов объемом 0,150 л. Короткие подводящие шланги при этом надежно изолировались. Эта модернизация позволила существенно повысить стабильность нулевой линии, а следовательно повысить точность измерений. Калориметрические измерения проводили в дифференциальном режиме, тепловой эффект реакции коыплексообразования измеряли на фоне теплового эффекта разбавления полинуклеотидов в растворе Н&ЫОя поскольку энтальпия разбавления раствора в исследованном нами интервале концентраций (10 - 2 10 ) не превышала порога чувствительности установни. Энтальпию реанций номпленсообразования рассчитывали по формуле: лК і э 1_1-ОлЬ_ к An-V-M где Q,- калориметрическая чувствительность по данным электрической калибровки (дж/мм); \у, - амплитуда сигнала (мм); V- суммарная скорость потоков в канале (л/с); [М 0"" молярная концентрация связанного с полинуклеотидом металла (Моль/л). Проверку надежности работы калориметра Пикера проводили путем измерения энтальпии разбавления водных растворов N&Ct и KCt , энтальпии образования в растворе комплекса антибио-тина дистамицина с ДНК. Полученные величины приведены в таблице 3.1 и в пределах погрешности совпадают с наиболее надежными литературными данными [121, 102] . Погрешность результатов калориметрических измерений в настоящей работе выражалась в соответствии с рекомендацией комиссии по химической термодинамике ИШАК [I22J как среднее Квадратичное отклонение среднего результата:
