Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Литературный обзор 9
1.1 Биологические свойства 5-галогеноурацилов 9
1.2 Кето-енольная таутомерия и кислотно-основное равновесие 5-галогеноурацилов 13
1.2.1 Теоретическое изучение относительной устойчивости таутомеров 5-галогеноурацилов в газовой фазе 16
1.3 Исследование кето-енольного и кислотно-основного равновесия 5-галогеноурацилов в растворах 20
1.3.1 Теоретическое изучение таутомерного равновесия 5-галогеноурацилов в растворах 21
1.3.2 Теоретическое исследование депротонирования производных урацила в водных растворах 27
1.3.3 Экспериментальное исследование таутомерии и кислотно-основного равновесия 5-галогеноурацилов в растворах 30
1.3.3.1 Электронная и колебательная спектроскопия 30
1.3.3.2 ЯМР спектроскопия 38
1.4 Константы депротонирования 5-галогеноурацилов . 43
1.5 Исследование 5-галогеноурацилов в твёрдой фазе 45
ГЛАВА II. Объекты и методы исследования . 51
2.1 Используемые реагенты 51
2.2 Квантово-химические расчёты 52
2.3 Методы анализа 56
2.3.1 ИК спектроскопия . 56
2.3.2 Электронная спектроскопия 56
2.3.3 ЯМР спектроскопия 56
2.3.4 Высокоэффективная жидкостная хроматография . 57
2.4 Методы проведения эксперимента 57
2.4.1 Приготовление растворов 5-галогеноурацилов для электронной спектроскопии 57
2.4.2 Приготовление растворов 5-галогеноурацилов для ЯМР
спектроскопии 58
2.4.3 Получение монозамещенных калиевых солей 5-галогеноурацилов 59
2.4.4 Синтез 3-метил-5-фторурацила 61
2.4.5 Определение констант депротонирования 1-(тетрагидрофуранил-2)-и 3-метил-5-фторурацила в водных растворах 62
2.4.6 Определение цитотоксической активности 5-галогеноурацилов и их монозамещённых солей 62
ГЛАВА III. Обсуждение результатов 65
3.1 Теоретическое исследование относительной устойчивости таутомеров 5-галогеноурацилов в газовой фазе и в растворах 65
3.2 Кислотно-основное равновесие 5-галогеноурацилов в кислой водной
среде 72
3.3 Кислотно-основное равновесие 5-галогеноурацилов в щелочной среде 75
3.3.1 Идентификация структуры монозамещённых калиевых и натриевых солей 5-галогеноурацилов в твёрдой фазе 76
3.3.2 УФ спектроскопия 78
3.3.3 ЯМР спектроскопия 93
3.4 Установление количественного соотношения анионных и молекулярных форм в щелочных растворах 5-галогеноурацилов 105
3.5 Определение констант депротонирования N(1)- и N(3)- замещённых производных 5-фторурацила 109
3.6 Цитотоксические свойства 5-галогеноурацилов и их монозамещённых солей 111
Выводы 115 литература 116
- Теоретическое изучение относительной устойчивости таутомеров 5-галогеноурацилов в газовой фазе
- Высокоэффективная жидкостная хроматография
- Определение цитотоксической активности 5-галогеноурацилов и их монозамещённых солей
- Идентификация структуры монозамещённых калиевых и натриевых солей 5-галогеноурацилов в твёрдой фазе
Введение к работе
доктор химических наук, профессор Валеев Ф.А.
Актуальность работы. 5-Галогеноурацилы проявляют широкую фармакологическую активность и находят применение в качестве противоопухолевых, антибактериальных и противовирусных препаратов. 5-Хлор- и 5-бромурацил могут образовываться эндогенно при воспалительных процессах и способны внедряться в ДНК и РНК, где образуют «ложные» пары оснований с аденином или, находясь в редкой таутомерной или ионной форме, с гуанином. Литературные данные свидетельствуют о том, что факторы, влияющие на механизм кислотно-основного и таутомерного равновесий, имеют решающее значение при возникновении ошибок в репликации ДНК или РНК. В связи с этим важно понимание закономерностей распределения молекулярных и анионных форм 5-галогеноурацилов в конденсированной фазе. Литературные данные о возможных таутомерных формах урацилов в растворах являются противоречивыми. Вопрос о направлении ионизации в молекуле урацилов является спорным из-за наличия нескольких донорных атомов, потенциально способных к протонированию или депротонированию. Поэтому, исследование таутомерного и кислотно-основного равновесия галогенпроизводных урацилов в растворах является актуальным.
Настоящая работа выполнена в рамках приоритетного направления «Живые системы», в соответствии с планом научно-исследовательских работ Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института органической химии Уфимского научного центра Российской академии наук по темам «Гомо- и гетерофункциональные соединения в комплексообразовании с металлами и фармаконами» (№ гос. регистрации 0120.0 801446), «Реакционная способность гомо- и гетерофункциональных соединений в комплексообразовании с металлами и фармаконами» (№ гос. регистрации 01201152187) при финансовой поддержке Программы №1 ОХНМ РАН «Теоретическое и экспериментальное изучение природы химической связи и механизмов важнейших химических реакций и процессов» и Программы №6 ОХНМ РАН «Химия и физико-химия супрамолекулярных систем и атомных кластеров».
Цель работы. Изучение кислотно-основного и таутомерного равновесия 5-галогеноурацилов в водных растворах и диметилсульфоксиде (ДМСО).
Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:
Квантово-химическое изучение относительной устойчивости таутомеров 5-галогеноурацилов в газовой фазе, воде и диметил-сульфоксиде.
Получение и идентификация солей 5-галогеноурацилов.
Установление донорных атомов в молекулах 5-галогеноурацилов, участвующих в протонировании и депротонировании
Определение количественного соотношения анионов в щелочных растворах 5-галогеноурацилов в воде и ДМСО.
Научная новизна и практическая ценность.
Впервые методом TPSSTPSS/6-311+G(d,p) рассчитана относительная устойчивость 5-фторурацила с учётом специфической и неспецифической сольватации в ДМСО. Определена относительная устойчивость 5-фтор-, 5-хлор- и 5-бромурацилов в водных растворах и ДМСО с учётом неспецифической сольватации. Проведена оценка влияния сольватации на относительную устойчивость таутомеров 5-галогеноурацилов.
Показано, что 5-галогеноурацилы в водных растворах в кислой среде в диапазоне рН = 1.8 5.6 находятся в дикетоформе, в щелочной среде в диапазоне рН = 5.6-10.2 – в виде смеси двух анионов с депротонированием по N(1) и N(3) положениям пиримидинового кольца, а в щелочных растворах в ДМСО – в виде аниона с депротонированием по N(1) положению пиримидинового кольца. На основании данных УФ и ЯМР спектроскопии, и квантово-химических расчётов предложена схема депротонирования 5-галогеноурацилов в водных растворах и ДМСО. Определено соотношение депротонированных форм 5-фтор-, 5-хлор- и 5-бромурацилов при N(1) и N(3) положениях в щелочной среде в воде и ДМСО.
Впервые определены константы диссоциации 1-(тетрагидрофуранил-2)- и 3-метил-5-фторурацилов в водном растворе.
На клеточных культурах НЕК293 проведены сравнительные исследования цитотоксических свойств 5-фтор-, 5-хлор-, 5-бром и 5-йодурацилов и их солей*. Предложен возможный механизм, определяющий цитотоксические свойства калиевой соли 5-фторурацила.
Апробация работы. Результаты исследований были доложены и обсуждены на X Международной конференции по проблемам сольватации и комплексообразования в растворах (Суздаль, 2007), на XIV и XV Международных конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2007» и «Ломоносов-2008» (Москва, 2007, 2008), на IX Всероссийской научно-практической конференции студентов и аспирантов «Химия и химическая технология в XXI веке» (Томск, 2008), на XI Молодежной школе-конференции по органической химии (Екатеринбург, 2008), на Международной конференции «Новые направления в химии гетероциклических соединений» (Кисловодск, 2009), на XVII Международной конференции по химической термодинамике (Казань, 2009), на VIII Всероссийской конференции с международным участием «Химия и медицина» (Уфа, 2010), на III Международной конференции «Химия гетероциклических соединений» (Москва, 2010), на I Республиканской конференции молодых ученых «Химия в интересах человека» (Уфа, 2011), на XV Молодежной школе-конференции по органической химии (Уфа, 2012), на IX Всероссийской конференции «Химия и медицина» (Уфа, 2013), на кластере конференций по органической химии «ОргХим-2013» (Санкт-Петербург, 2013).
Публикации. По результатам исследований опубликованы 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК, и тезисы 13 докладов.
Структура и объём диссертации. Работа изложена на 132 страницах, содержит 33 рисунка, 28 таблиц, библиографию из 147 наименований. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка литературы.
Теоретическое изучение относительной устойчивости таутомеров 5-галогеноурацилов в газовой фазе
Квантово-химические расчёты 5-галогеноурацилов в газовой фазе включают в себя два аспекта. Первый из них касается определения физико-химических свойств молекулярных форм (т.е. УФ поглощения, дипольных моментов, химических сдвигов ЯМР и т.д.). Используя либо полуэмпирические, либо неэмпирические квантово-химические методы расчёта, можно определить физико-химические параметры, согласующиеся с экспериментальными данными. Подобные работы будут обсуждаться в следующем разделе. Второй аспект касается определения относительной стабильности таутомеров и констант таутомеризации в газовой фазе, определение влияния заместителя на смещение таутомерного равновесия и оценку стабильности таутомеров и анионов в растворе.
В этом плане наиболее изученным в ряду 5-галогеноурацилов является 5-фторурацил. В работе [73] различными расчётными методами были определены относительные ряды устойчивости таутомеров A-F (рис. 1.5) в газовой фазе. Относительные энергии (по сравнению с самой стабильной формой) для каждого таутомера приведены в табл. 1.1. Согласно данным расчётам наиболее устойчивой формой 5-фторурацила является дикето-таутомер А, второй по устойчивости является структура В.
В более ранней работе [71] авторы с использованием теории возмущений исследовали стабильность таутомеров 5-фторурацила. Они определили три наиболее стабильные формы A, B и D (табл. 1.1). Согласно их расчётам наиболее устойчивым также является дикето-таутомер, а таутомеры В и D соответственно на 29.3 и 51.8 кДж/моль менее выгодны.
В работе [48] были проведены неэмпирические расчёты 13 конформеров для шести возможных таутомеров 5-фторурацила (рис. 1.6). Под структурами приведена разность энергий (АЕ, кДж/моль) данного конформера по отношению к самой устойчивой форме (А), рассчитанной методом HF/6-31+G(d,p). При определении ряда устойчивости обычно для каждого таутомера приводят относительные энергии самого стабильного конформера. Выбранные таким образом данные для каждого таутомера приведены также в табл. 1.1. Как и в предыдущих работах, наиболее стабильной является дикетоформа А, следующими по стабильности идут 2-гидрокси-4-оксо-форма В, 2-гидрокси-4-гидрокси-форма Е и 2-оксо-4-гидрокси-форма D. Таутомеры С и F более чем на 60 кДж/моль менее устойчивы, чем таутомер А. энергетическую разницу между таутомерами, однако это не влияет на ряд устойчивости таутомерных форм.
Энергии и геометрические параметры конформеров таутомерных форм 5-бромурацила были рассчитаны с использованием метода RI-MP2 и базисного набора cc-pVTZ (рис. 1.5) [26]. По теоретическим данным видно, что енольные и диенольные формы существенно менее стабильны (на 38-113 кДж/моль), чем каноническая дикетоформа.
Относительные энергии устойчивости всех четырёх 5-галогеноурацилов установлены в работе [70] с использованием нескольких методов расчёта (табл. 1.1). Наиболее стабильной для всех 5-галогеноурацилов является дикетоформа А. Вторым по стабильности идет таутомер В, причём его стабильность убывает от 5-фторурацила к 5-йодурацилу. Таутомеры D и Е очень близки по энергии. Однако в ряду 5-фторурацил – 5-бромурацил форма Е более стабильна, чем D.
Таким образом, данные теоретических расчётов для 5-галогеноурацилов показывают, что в газовой фазе наиболее устойчивым является дикето-таутомер А. Полученные данные свидетельствуют о том, что стабильность таутомеров чувствительна и к базисному набору, и к используемому теоретическому методу.
Исследование кето-енольного и кислотно-основного равновесия 5-галогеноурацилов в растворах
Вода является наиболее важной средой для производных урацила, так как она не только взаимодействует с растворёнными молекулами, но и выполняет ряд важнейших функций, связанных с процессами самоорганизации и стабилизации структуры ДНК и РНК. Изменение рН среды может приводить к образованию других молекулярных форм (таутомеров), а также катионов и анионов 5-галогеноурацилов.
Высокоэффективная жидкостная хроматография
ИК-Фурье спектры 5-галогеноурацилов и их солей регистрировали на спектрометре IR-Prestige-21 SHIMADZU на приставке Silver Gate Single Reflection ATR в виде таблетки с KBr.
Отнесение полос поглощения 5-галогеноурацилов было сделано по литературным данным [74, 75, 79], а солей 5-галогеноурацилов – по рассчитанным методом TPSS/6-311+G(d,p) данным ИК спектров.
Электронные спектры поглощения 5-фторурацила, 5-хлорурацила, 5-бромурацила и 5-йодурацила регистрировали на спектрофотометре “Specord M-40” в области 200-350 нм в воде и в области 250-350 нм в сухом ДМСО при комнатной температуре. Использовались кварцевые кюветы с толщиной поглощающего слоя 0.2 см.
ЯМР 1H, 13C, 15N и 19F спектры образцов были зарегистрированы в течение двух часов с момента приготовления растворов на импульсном спектрометре Bruker Avance-III 500 MHz с рабочей частотой 500.13 МГц (1H), 125.47 МГц (13C), 50.58 МГц (15N) и 470.59 МГц (19F) с использованием 5 мм датчика с Z-градиентом PABBO при постоянной температуре образца 298 K. Химические сдвиги в спектрах ЯМР 13С, 1Н приведены в м.д. относительно сигнала внутреннего стандарта тетраметилсилана (ТМС), 19F -относительно CCl3F. Химические сдвиги ЯМР 15N получены из F1-проекции 1H-15N HMBC спектров, значения приведены в аммиачной шкале. С целью
увеличения цифрового разрешения применялось дополнение нулями и умножение Фурье-образа спектра на экспоненциальную функцию (lb= 0.1 Гц для 1H и 1 Гц для 13С). Спектры ЯМР 13С с подавлением по протонам были зарегистрированы при следующих условиях: спектральное окно – 29.8 кГц, количество точек – 64K, длительность возбуждающего импульса (30) – 3.2 мкс, релаксационная задержка – 2 с, количество прохождений 5122048. Редактирование спектров ЯМР 13С проводилось на основании экспериментов DEPT-90 и DEPT-135 [141].
Хроматографический анализ натриевой соли 5-фторурацила и продуктов её метилирования проводили на хроматографе Shimadzu LC-20 (Shimadzu, Япония) со спектрофотометрическим диодноматричным детектором на колонке Atlantis C18 250х4.6 мм; 5 мкм (Waters, США). В качестве подвижной фазы использовался элюент состава вода: ацетонитрил = 10: 90 (об. %). Скорость потока составляла 1 мл/мин. Анализируемый образец в количестве 100 мкл вводился в аналитическую петлю объёмом 50 мкл, и записывалась хроматограмма при длине волны 265 нм.
Разделение продуктов метилирования монозамещённой соли 5 фторурацила проводилось полупрепаративным методом на хроматографической системе Стайер (Аквилон) на колонке Luna C18 250х4.6 мм; 5 мкм (Phenomenex, США). В качестве подвижной фазы использовался элюент состава вода: ацетонитрил = 10: 90 (об. %). Скорость потока составляла 4 мл/мин. Детектирование проводилось при длине волны 265 нм. Для приготовления 510-4 М водных растворов 5-замещённых урацилов навеску соединений (табл. 2.1) помещали в мерную колбу объемом 500 мл и доводили до метки дистиллированной водой. Растворяли при перемешивании на магнитной мешалке. ЯМР спектроскопии Для получения ЯМР спектров 5-галогеноурацилов, тегафура и 5-бромуридина в нейтральной среде и монозамещённых солей 5-галогеноурацилов сухие навески соединений растворяли в ДМСО-d6 и D2O, использованы соответствующие концентрации (табл. 2.2.). Для получения спектров 5-фторурацила в щелочной среде к раствору KOH с соответствующими концентрациями (табл. 2.2) в D2O и DMSO-d6 добавляли 0.01 г (соответственно в соотношениях 1:1, 1:2 и 1:4) 5-фторурацила. Для получения ЯМР спектров тегафура и 5-бромуридина в щелочной среде к раствору КОН с соответствующими концентрациями в D2O и DMSO-d6 добавляли эквимолярное количество тегафура и 5-бромуридина (табл. 2.2).
Определение цитотоксической активности 5-галогеноурацилов и их монозамещённых солей
0.1951 г (1 моль) натриевой соли 5-фторурацила растворяли в 10 мл воды, затем добавляли 485.6 мкл (4 моль) диметилсульфата. Реакционную смесь перемешивали на магнитной мешалке при комнатной температуре в течение двух часов. За ходом реакции наблюдали методом ВЭЖХ. Типичная хроматограмма, соответствующая конечному моменту реакции приведена на рис. 2.3.
- Хроматограммы продуктов метилирования монозамещённой натриевой соли 5-фторурацила. Пик 1 соответствует исходной монозамещённой натриевой соли 5-фторурацила, пик 2 - 1-метил-5-фторурацилу, пик 3 - 3-метил-5-фторурацилу, пик 4 - 1,3-диметил-5-фторурацилу
Разделение реакционной массы проводили полупрепаративно методом ВЭЖХ. Фракция 1 соответствовала исходному соединению, фракция 2 - 1-метил-5-фторурацилу, фракция 3 - 3-метил-5-фторурацилу, фракция 4 - 1,3-диметил-5-фторурацилу. Строение 3-метил-5-фторурацила определено методом ЯМР 13С спектроскопии, отнесение остальных продуктов реакции проводили методом УФ спектроскопии [64]. Определение констант депротонирования 1-(тетрагидрофуранил-2)- и 3-метил-5-фторурацила в водных растворах
Величины рКа определяли по стандартной методике [111] методом потенциометрического титрования в одногорлом термостатируемом реакторе объемом 25 мл с обратным холодильником при четырёх температурах: 20 С, 25 С, 35 С и 45 С. Температура поддерживалась постоянной при помощи термостата LOIP LT-205. При титровании использовался рН-метр рН-150МИ с комбинированным стеклянным электродом ЭСК-10307. Калибровка электрода проводилась с помощью стандартных буферных растворов.
Для поддержания постоянной ионной силы в титруемом растворе использовали 0.1 М раствор KNO3. В качестве растворителя применялась свежеперегнанная бидистиллированная вода. Концентрация свежеприготовленного раствора гидроксида калия устанавливалась кислотно-основным (индикатор - фенолфталеин) титрованием фиксанальным раствором (0.01 М) соляной кислоты. 5-галогеноурацилов и их монозамещённых солей Цитотоксические свойства веществ изучали с помощью витального красителя AlamarBlue согласно протоколу изготовителя (Invitrogen, США). Для этого клетки HEK293 (линия эмбриональной почки человека (Российская коллекция клеточных культур, Институт цитологии РАН, Санкт-Петрбург) высаживали в 96-луночные планшеты в количестве 10000 клеток на лунку. Через 24 ч. в лунках меняли среду, и к клеткам добавляли растворы соединений в ДМСО (100 мМ) до конечной концентрации 0.1, 1, 10, 20, 30, 40, 50 мкМ. Клетки инкубировали в присутствии соединений ещё в течение 72 ч в тех же условиях. По окончании инкубации проводили смену среды и к клеткам добавляли коммерческий раствор AlamarBlue в количестве, рекомендованном производителем (1/10 объёма культуры). Флуоресценцию красителя (степень редукции красителя) измеряли при длине волны 590 нм, используя мультипланшетный анализатор 2300 EnSpire Multimode Plate Readers (“Perkin Elmer”, США). Данные представляли в виде количества живых клеток относительно контроля. За 100% принимали количество клеток в контроле, где клетки инкубировали в отсутствие соединений, но в присутствии растворителя ДМСО (0.1%). Математическая обработка полученных данных включала построение соответствующих графиков “доза-эффект” и расчёт соответствующих величин, характеризующих выраженность потенциальных цитотоксических свойств тестируемых соединений (IC50), с помощью программы GraphPad Prizm 4.0 (GraphPad Software Inc., США).
Репортёрные векторные конструкций, содержащих сайты связывания для транскрипционных факторов CREB, NFAT, NF-кB, p53, STAT1, GAS, VDR, HSF1 и HIF1, получены на базе плазмидного вектора pTL-Luc (“Panomics”, США).
Для проведения транзиентных трансфекций клетки линии HEK293 рассаживали в количестве 40103 клеток на лунку в 96-луночных планшетах в 100 мкл среды без антибиотика (ДMEM, 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мM L-глутамина). Через 24 ч. проводили трансфекции с помощью реагента Липофектамин 2000 (“Invitrogen”, США) согласно протоколу изготовителя. Через 6 ч. после трансфекции среду заменяли на содержащую антибиотик (ДMEM, 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мM L-глутамина, 50 мкг/мл гентамицин) и далее еще через 18 ч. добавляли исследуемые соединения в ДМСО (100 мМ) до конечной концентрации 10 мкМ (0.1% ДМСО). Клетки инкубировали ещё в течение 24 ч. в тех же условиях. Детекцию люциферазной активности в клеточных лизатах проводили с помощью набора для двойного люциферазного анализа Dual-63 Luciferase Reporter Assay System (“Promega”, США), используя мультипланшетный анализатор 2300 EnSpire Multimode Plate Readers (“Perkin Elmer”, США). Для нормализации полученных результатов клетки ко-трансфецировали плазмидой pRLK, кодирующей ген люциферазы Renilla reniformis. Среднее арифметическое полученных значений трёх независимых экспериментов и стандартную ошибку среднего (SEM) находили с помощью модуля описательной статистики в программе Statistica 6.1 (StatSoft. Inc.). Сравнение экспериментальных групп проводили с использованием парного t-критерия Стьюдента для зависимых выборок (n = 3, p 0.05). Квантово-химические расчёты проведены, ЯМР и ИК спектры зарегистрированы на оборудовании ЦКП «Химия» ИОХ УНЦ РАН.
Идентификация структуры монозамещённых калиевых и натриевых солей 5-галогеноурацилов в твёрдой фазе
В щелочной среде, когда соотношение производных урацила и гидроксида калия является эквимолярным, в работе [104] предполагали образование енольной формы. Однако анализ литературных данных показывает, что при увеличении рН происходит ионизация урацилов. В молекулах 5-галогеноурацилов имеются несколько участков, где теоретически возможно депротонирование – две амидные группы и, как следствие образования минорных таутомерных форм, две карбонильные группы. Согласно литературным данным положение депротонирования и доминантные анионные формы является спорным. Данные вопросы в этом разделе рассмотрены с использованием методов ЯМР и УФ спектроскопии.
Идентификация структуры монозамещённых калиевых и натриевых солей 5-галогеноурацилов твёрдой фазе
Чтобы исследовать структуру анионов 5-галогеноурацилов, по методике 2.4.3 были получены их натриевые и калиевые соли. Продукты были идентифицированы методами ЯМР и ИК спектроскопии и элементного анализа.
Идентификацию структуры солей 5-галогеноурацилов в твердой фазе проводили методом ИК спектроскопии. Как показал обзор литературных данных, при исследовании структурных изменений производных урацила методом ИК спектроскопии наиболее информативными являются области спектров 3200-2900 и 1800-1500 см-1, где проявляются валентные колебания N-H и кратных C=O и C=C связей, соответственно. Полосы поглощения в ИК спектрах 5-галогеноурацилов относили по литературным данным [74, 75, 79] (табл. 3.5).
Для интерпретации полос поглощения в ИК спектрах солей 5-галогеноурацилов методом TPSS/6-311+G(d,p) были рассчитаны основные валентные колебания (табл. 3.6) 5-галогеноурацилов и их монозамещенных солей.
Согласно расчётным данным, при образовании солей все основные валентные колебания смещаются в низкочастотную область спектра. При образовании солей структуры AN1 исчезает полосы поглощения, обусловленные валентными колебаниями (N1-H) и сильно смещается полоса поглощения, обусловленная валентными колебаниями (С2=О). При образовании солей структуры AN3 исчезают полосы поглощения, обусловленные валентными колебаниями группы N3-H и сильно смещается полоса поглощения, обусловленная колебаниями группы С4=О. Колебания растяжения связей С4=О соли структуры AN1 проявляются в более высокочастотной области по сравнению с С2=О, а в солях со структурой AN1 – в более низкочастотной области спектра. В экспериментальных спектрах солей 5-галогеноурацилов наблюдается исчезновение полос поглощения валентных колебаний групп С2=О и N1-Н (табл. 3.6), что свидетельствует об их AN1 структуре в твёрдой фазе. Таким образом, методом ИК спектроскопии показано, что в твёрдой фазе соли 5-галогеноурацилов имеют AN1 структуру.
Согласно литературным данным, при увеличении рН в УФ-спектрах водных растворов 5-галогеноурацилов [61, 63, 65] наблюдается смещение полос поглощения с максимумами в области 265-285 нм. Данное смещение большинство исследователей объясняют ионизацией молекулы галогеноурацила. С другой стороны, в теории УФ-спектроскопии подобный батохромный сдвиг обусловлен увеличением длины цепи сопряжения [102]. Изменения структуры молекулы 5-галогеноурацилов в щелочной среде были исследованы с помощью методов УФ и ЯМР спектроскопии.
Как было отмечено в предыдущем разделе, в УФ спектре нейтрального водного раствора 5-фторурацила наблюдается полоса поглощения с максимумом при 266 нм. При увеличении рН наблюдается уменьшение интенсивности этой полосы поглощения (рис. 3.7, спектр 1), обусловленной переходом (рис. 3.5), и появление новой полосы поглощения с максимумом при 310 нм (рис. 3.7, спектры 2-7). Две изобестические точки свидетельствуют о равновесии трёх форм в растворе. При увеличении рН до значения рН = 10.2 интенсивность новой полосы поглощения возрастает, и при рН = 10.2 происходит смещение спектров поглощения с одной изобестической точки. Мы предположили, что наблюдаемые изменения УФ спектров обусловлены депротонированием 5-фторурацила.
При обратном уменьшении рН щелочного раствора 5-фторурацила в интервале 10.2-5.0 (до исходного значения рН) наблюдается гипсохромное смещение полос поглощения, при этом полоса поглощения поглощения с max = 310 нм исчезает и появляется полоса поглощения с максимумом при 266 нм, характерная для нейтральной дикето-структуры 5-фторурацила. Данные изменения в УФ спектрах свидетельствуют об обратимости процесса депротонирования в водных растворах 5-галогеноурацилов.
Взаимодействие 5-фторурацила с гидроксидом калия (реакция получения монозамещённой соли 5-фторурацила) было исследовано методами рН метрии и УФ спектроскопии. Как видно из рис. 3.8, в ходе взаимодействия эквимолярных количеств 5-фторурацила и гидроксида калия происходит постепенное уменьшение рН с последующим выходом на плато (кривые 2, 3). Подобное изменение рН обусловлено диссоциацией 5-фторурацила:
Изменение спектров поглощения в ходе взаимодействия приведено на рис. 3.9. Из УФ-спектров очевидно, что в ходе реакции интенсивность новой полосы поглощения с максимумом при 308 нм, которую связывали с поглощением одной из анионных форм, уменьшается, а интенсивность полосы поглощения с максимумом при 266 нм, наоборот, возрастает, когда рН раствора практически перестает изменяться.
