Введение к работе
Актуальность работы. Желчные пигменты, их производные и синтетические аналоги составляют интересное семейство соединений, мультифункциональных по физико-химическим свойствам, что определяет их биохимические функции и практически полезные характеристики. Среди всех желчных пигментов наиболее ярким представителем является билирубин (BR). Ранее рассматривавшийся исключительно как балластный и токсический продукт метаболизма, в настоящее время он считается одним из важнейших биологически активных соединений.
Усиление интереса к исследованию свойств желчных пигментов обусловлено способностью BR к подавлению окисления липидов клеточных мембран. Клинически доказано, что нормальные физиологические концентрации этого пигмента являются жизненно необходимыми. Однако вследствие наличия в молекуле BR нескольких реакционных центров для взаимодействия с активными частицами и значительного влияния природы окислителей и растворителей на процессы, в которых он принимает участие, детальный механизм антирадикального действия BR в настоящее время остается во многом неизвестным. В связи с этим, исследование превращений BR и, в особенности, кинетики его окисления в различных условиях является важной и актуальной задачей современной физической химии.
Основная транспортная форма билирубина в организме – макромолекулярные комплексы с альбуминами. Недавно обнаруженная способность BR выступать в качестве хромофора в лиганд-активируемых флуоресцентных белках UnaG, является значимым открытием в химии желчных пигментов. В этой связи актуальным является исследование влияния его присутствия в составе транспортного белка-носителя на физико-химические параметры процессов супрамолекулярного комплексообразования различных биомолекул и лекарственных препаратов. Такой подход является основой для разработки современных тест-систем по определению типа и способности низкомолекулярных соединений к взаимодействию с белками, что, в свою очередь, будет полезным для дизайна новых лекарственных препаратов и развития теории молекулярного распознавания.
Таким образом, обозначенный круг проблем актуален для современной химии билирубина и его аналогов в аспекте исследований слабых межчастичных взаимодействий, установления механизмов сложных химических процессов во взаимосвязи с реакционной способностью и строением исследуемых соединений.
Работа выполнена при поддержке ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы (ГК № 14.740.11.0617), грантов РФФИ (проекты № 12-03-31309 и 13-03-90743) и стипендии Президента РФ молодым ученым и аспирантам по приоритетным направлениям модернизации российской экономики (2013-2015 гг.) № СП-6898.2013.4. Доклады, сделанные по результатам работы, были отмечены грамотами, дипломами и премиями на Всероссийской конференции молодых ученых и III школы «Окисление, окислительный стресс и антиоксиданты» им. Академика Н.М. Эмануэля (Москва, 2008), XII Всероссийской конференция по химии органических и элементоорганических пероксидов «Пероксиды» (Уфа, 2009), на конкурсе работ молодых ученых в рамках XVI Международной специализированной выставки «Химия» (Москва, 2011).
Цель работы заключалась в установлении закономерностей окислительных реакций BR, а также выяснении его роли в процессах нековалентного взаимодействия биомолекул с белковыми носителями. Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
1. Исследование процессов окисления BR и его комплекса с альбумином (BRBSA) в различных модельных системах, инициирующих свободные радикалы.
2. Выявление закономерностей в реакциях окисления тетрапиррольного пигмента, а также сравнение кинетических параметров реакций окисления в зависимости от природы и концентрации хромофоров и окислителей, белкового окружения, природы растворителя.
3. Квантово-химическое моделирование реакций окисления BR в газовой и жидкой фазах, определение энергетически предпочтительных маршрутов реакций.
4. Изучение влияния присутствия BR в молекуле альбумина на кинетические и термодинамические параметры связывания низкомолекулярных лигандов – аскорбиновой кислоты (АA), гидрохинона (H2Q), урацила (U), 5-гидрокси-6-метилурацила (5U), мезо-тетракис-п-сульфофенилпорфина (TSPP), борфторидного комплекса мезо-метил-3,3',5,5'-тетраметил-4,4'-дисульфо-2,2'-дипирролилметена (BODIPY) с белками.
Научная новизна. Впервые получены кинетические характеристики окислительных реакций билирубина в водных и неводных растворах под действием инициаторов неорганической и органической природы. Совокупность спектральных и кинетических данных, а также результатов квантово-химических расчетов, позволила установить, что в водных растворах образование биливердина и дипирролилметенов, как продуктов окислительной деструкции, энергетически менее предпочтительно, чем образование монопиррольных производных. Установлено влияние макромолекулярного комплексообразования билирубина с альбумином на кинетику реакций окисления – обнаруживается эффект «белковой защиты». Показано, что в реакциях совместного окисления билирубин ингибирует окисление аскорбиновой кислоты, в то время как замена витамина С на гидрохинон приводит к обратному эффекту.
Впервые установлена роль билирубина в составе альбуминового конъюгата в процессах нековалентного взаимодействия биомолекул с белковыми носителями. Показано его влияние на кинетические и термодинамические параметры образования макромолекулярных комплексов биологически активных молекул (антиоксидантов, оснований РНК, олигопирролов) и белков. Установлено, что взаимодействие белков с низкомолекулярными лигандами носит неспецифический характер.
Практическая значимость. Полученные результаты вносят вклад в развитие химии олигопирролов в целом и химии билирубина и его аналогов. Понимание механизмов антиоксидантного и антирадикального действия билирубина позволит развить существующие и создать новые представления о биохимических функциях соединений на основе тетрапиррольной структуры. Полученные данные по окислению билирубина активными формами кислорода в водных и неводных растворах смогут найти применение при моделировании мембранных структур клетки, в особенности при условиях окислительного стресса, позволяя глубже понять процессы старения. Практическая значимость работы также во многом связана с необходимостью поиска новых технологий удаления избыточных количеств билирубина из биологических сред при гипербилирубинемиях. Конкурирующие реакции окисления билирубина и других фоточувствительных пигментов во многом позволяют понять молекулярные механизмы фотодинамической терапии опухолевых заболеваний и лечения желтух. Выявленные закономерности в области влияния билирубина на физико-химические параметры связывания низкомолекулярных веществ с белками вносят вклад в формирование базы, необходимой для медицинской и супрамолекулярной химии. Полученные результаты используются в образовательном процессе при преподавании дисциплин «Основы координационной и супрамолекулярной химии», «Основы молекулярной биологии», «Химические основы жизни» студентам Ивановского отделения ВХК РАН.
Основные положения, выносимые на защиту. Кинетика индивидуального окисления билирубина и его альбуминового комплекса в водных растворах пероксида водорода, 2,2-азобис(2-амидинопропан)а, системе Фентона. Кинетика совместного окисления BR с АА и H2Q. Кинетика окисления BR пероксидом бензоила в органических растворителях. Квантовохимические моделирование процессов окисления BR в части описания энергетики реакций. Результаты исследования влияния присутствия BR в молекуле альбумина на кинетические и термодинамические параметры связывания низкомолекулярных лигандов – АA, H2Q, U, 5U, TSPP и BODIPY с белками.
Вклад автора. Подбор и анализ научной литературы по теме диссертации, экспериментальная часть работы, проведение компьютерного моделирования и обработка полученных результатов и их обсуждение выполнены лично автором. Стратегическое планирование исследований и методологии выполнения эксперимента, обсуждение результатов выполнены под руководством к.х.н., доцента Румянцева Е.В.
Апробация работы. Основные результаты работы представлены на V Международной конференции по порфиринам и фталоцианинам «ICPP-5» (Москва, 2008); X Международной конференции по физической химии порфиринов и их аналогов «ICPC-10» (Иваново, 2009); XII Молодежной конференции по органической химии (Суздаль, 2009); VIII Всероссийской конференции с международным участием «Химия и медицина, ОРХИМЕД» (Уфа, 2010); VIII Школе-конференции молодых ученых стран СНГ по химии порфиринов и родственных соединений (Абхазия, Гагра, 2009); VIII Международной конференции «Биоантиоксидант» (Москва, 2010); II Международной научной конференции «Новые направления в химии гетероциклических соединений» (Железноводск, 2011); XIX Международном Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Волгоград, 2011); XVI Международной выставке химической промышленности и науки «Химия» (Москва, 2011); Международной молодёжной научной школе «Химия порфиринов и родственных соединений» в рамках фестиваля науки (Иваново, 2012); XIX Международном научном форуме студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2012), XXX Всероссийском симпозиуме по химической кинетике (Москва, 2012), II Всероссийской молодежной конференции «Успехи химической физики» (Черноголовка, 2013), XVth Conference on Heterocycles in Bioorganic Chemistry (Рига, 2013).
Публикации. Основное содержание диссертации опубликовано в 9 статьях (8 статей в журналах из Перечня ВАК), а также в тезисах 14 докладов, опубликованных в трудах научных конференций различного уровня.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 140 страницах, содержит 24 таблицы, 60 рисунков, 3 схемы и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, основных результатов и выводов, списка цитируемой литературы, включающего 220 наименований цитируемых литературных источников.
