Введение к работе
Актуальность темы. Наноматериалы являются объектом интенсивных исследований благодаря уникальным физико-химическим свойствам и применениям в электронике, фотонике, химическом катализе и биомедицине. Среди большого разнообразия современных наноматериалов особое место занимают металлические наночастицы с плазмонным резонансом (ПР), который обусловлен коллективным поведением электронов проводимости на определенных частотах, определяемых природой частицы. Чтобы отличить ПР в наночастицах от распространяющихся плазмонов, его часто называют локализованным поверхностным ПР, подчеркивая локальный характер явления и важную роль поверхности раздела. Физически явление ПР заключается в резонансном увеличении сечений поглощения и рассеяния света частицей, которые на несколько порядков превосходят соответствующие значения для обычных диэлектрических частиц. Длина волны ПР металлических наночастиц и соотношение между их сечениями поглощения и рассеяния зависят от размера, формы, материала и структуры частиц. Именно этим определяются технологические возможности управления оптическими свойствами плазмонных частиц для конкретных приложений.
Относительно новым объектом современной нанотехнологии благородных металлов являются золотосеребряные наноклетки (ЗСНК, название является переводом принятого в литературе термина Au-Ag nanocages) – полые и пористые наночастицы из серебра, золота и биметаллического сплава. Золотосеребряные наноклетки имеют ряд существенных преимуществ по сравнению с частицами других типов. Во-первых, варьирование материала и структуры наночастиц позволяет получить очень широкий диапазон настройки ПР от 400 нм до ближней ИК-области. Во-вторых, наличие полостей внутри ЗСНК и развитой поверхности делает их перспективным шаблоном синтеза композитных наночастиц для адресной доставки лекарств и фотодинамических красителей, конструирования SERS наносенсоров и т.д. В литературе описаны успешные применения золотосеребряных наноклеток для биоимиджинга и терапии опухолей (Au et al. 2008), оптоакустической и когерентной томографии (Yang et al. 2007), для доставки целевых веществ к ядру клеток (Dam et al. 2012) и т.п. К моменту начала исследований, описанных в данной диссертации, имелся ряд нерешенных вопросов, связанных с воспроизводимым получением серебряных нанокубиков (исходных шаблонов для ЗСНК), пониманием некоторых аспектов физико-химических механизмов получения золотосеребряных наноклеток и их функционализации биомолекулами. Не были исследованы возможности использования мультицветных меток на основе ЗСНК для мультиплексного дот иммуноанализа. Наконец, отсутствовали данные о получении и перспективах применения композитных наночастиц, содержащих золотосеребряные наноклетки и фотодинамические красители. Этим определяется актуальность и научная значимость темы диссертации.
Целью диссертационной работы являлся синтез, исследование оптических и физико-химических свойств золотосеребряных наноклеток и композитных наночастиц на их основе для применений в твердофазном иммуноанализе, фототермической и фотодинамической терапии.
Для достижения поставленной цели в работе решались следующие задачи исследования:
Определение физико-химических параметров реакции полиольного синтеза, контролирующих размер и выход серебряных нанокубиков – шаблонов для получения золотосеребряных наноклеток.
Синтез и характеристика различных типов золотосеребряных наноклеток с плазмонными резонансами в диапазоне 450-800 нм.
Разработка физико-химических методов функционализации и демонстрация возможности использования полученных наночастиц в качестве меток для мультицветного дот иммуноанализа.
Синтез композитных наночастиц, состоящих из ЗСНК, покрытых диоксидом кремния и функционализованных различными производными порфирина (иттербиевый комплекс дикалиевой соли 2,4-диметоксигематопорфирина IX, гематопорфирин).
Демонстрация возможности использования композитных наночастиц для фототермического и фотодинамического подавления роста бактерий Staphylococcus aureus и опухолевых клеток HeLa.
Научная новизна работы:
Впервые показано, что выход серебряных частиц кубической формы в индуцированной сульфидом натрия реакции полиольного синтеза определяется такими физико-химическими параметрами, как образование первичных монокристаллических частиц, степень оксигенации этиленгликоля и отсутствие в реакционной смеси следовых количеств ионов примесных металлов. Предложен спектральный критерий формирования нанокубиков даже в отсутствие электронно-микроскопических (ЭМ) изображений.
Впервые продемонстрирована возможность одновременного выявления трех типов молекул-мишеней (антител) с помощью дот иммуноанализа с использованием золотосеребряных наноклеток. При отсутствии неспецифического связывания предел обнаружения равен примерно 20 фмоль при детектировании невооруженным глазом.
Получен новый тип композитных наночастиц, состоящих из золотосеребряных наноклеток, покрытых диоксидом кремния и функционализованных производными порфирина.
Показано, что композитные наночастицы обладают большей фототермической и фотодинамической активностью подавления роста бактерий S. aureus по сравнению с отдельными компонентами композитной наночастицы (молекулами гематопорфирина, ЗСНК).
Научно-практическая значимость работы определяется востребованностью полученных наночастиц, их реальным применением в различных учреждениях РФ, включая ИБФРМ РАН, СГУ им. Н.Г. Чернышевского, СГМУ им. В.И. Разумовского, РОНЦ имени Н.Н. Блохина (г. Москва), ИПЛИТ РАН (г. Троицк), ИПТМУ РАН (г. Саратов) и др.
Достоверность научных результатов подтверждается воспроизводимостью экспериментальных данных и их соответствием теоретическим расчетам, а также согласием с результатами независимых исследований других авторов.
На защиту выносятся следующие основные положения и результаты:
-
Выход серебряных частиц кубической формы в индуцированной сульфидом натрия реакции полиольного синтеза определяется такими физико-химическими параметрами как образование первичных монокристаллических серебряных частиц, степень оксигенации этиленгликоля и отсутствие в реакционной смеси следовых количеств примесных металлов. Наличие основного и двух минорных плазмонных пиков является надежным критерием формирования нанокубиков даже в отсутствие ЭМ-изображений. Размер частиц контролируется временем реакции.
-
Реакция гальванического замещения с использованием серебряных нанокубиков позволяет осуществить эффективную настройку ПР частиц в широком диапазоне длин волн 435-800 нм с максимальной добротностью спектров поглощения и рассеяния на краях указанного спектрального диапазона.
-
Золотосеребряные наноклетки с различной степенью гальванического замещения могут быть использованы в качестве меток мультицветного дот иммуноанализа для одновременной детекции молекул-мишеней как минимум трех видов биоспецифичности с пределом детекции 20 фмоль.
-
Разработан новый тип многофункциональных композитных наночастиц, состоящих из золотосеребряных наноклеток, покрытых диоксидом кремния и функционализованных производными гематопорфирина (ГП).
-
Эффективное подавление роста патогенных бактерий композитными наночастицами ЗСНК/SiO2/ГП по сравнению со свободным ГП обусловлено адсорбцией композитных наночастиц на поверхности бактерий и повышением локальной концентрации ГП.
Личный вклад диссертанта состоит в синтезе серебряных нанокубиков и золотосеребряных наноклеток, разработке протокола функционализации наночастиц и экспериментальной апробации протокола мультицветного дот иммуноанализа на основе конъюгатов наночастиц, анализе данных электронной микроскопии, исследовании физико-химических свойств и оптимизации протоколов синтеза композитных наночастиц.
Работа выполнена в лаборатории нанобиотехнологии Института биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН в рамках плановой темы НИР «Нанобиотехнология частиц с настраиваемым плазмонным резонансом: синтез, функционализация, оптические свойства, применения в биологии и медицине», № гос. регистрации 01200904392, руководитель зав. лаб. д.ф.-м.н. профессор Хлебцов Н.Г.
Гранты. Исследования поддерживались 2 грантами РФФИ (2011-2012 годы), государственным контрактом на проведение научно-исследовательской работы № 14.740.11.0260, Программами президиума РАН «Фундаментальные науки – медицине» и «Фундаментальные основы технологии наноструктур и наноматериалов», грантом Президента РФ МК-1057.2011.02, грантом Правительства Российской Федерации для государственной поддержки научных исследований, проводимых под руководством ведущих ученых в российских образовательных учреждениях высшего профессионального образования; грантом компании ОПТЭК (2012) для поддержки молодых ученых ведущих высших учебных заведений и научных исследовательских центров (руководитель асп. Панфилова Е.В.), стипендией президента РФ 2013-2015 годах.
Апробация результатов. Основные результаты диссертации представлялись автором на следующих научных конференциях:
1. Saratov Fall Meeting – International School for Young Scientists and Students on Optics, Laser Physics & Biophysics, Saratov, Russia, 2010.
2. 4-ый международный форум по нанотехнологиям, Москва, Россия, 2011.
3. VI съезд Российского фотобиологического общества, пос. Шепси, Россия, 2011.
4. Workshop of Local Cluster Saratov (Рабочее совещание в рамках Европейского проекта Photonics4Life FP-7, Саратов, 2011).
5. 10th International Conference “Functional materials” ICFM’2011, Sec. 10: Materials for Medical and Environmental Applications. Biosensors, Partenit, Crimea, Ukraine, 2011.
6. II международная Интернет-конференция "Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологии", Казань, Россия, 2011.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 статей и 16 тезисов докладов конференций, включая 9 статей из списка, рекомендованного ВАК для публикации результатов кандидатских диссертаций.
Структура и объём работы. Диссертация состоит из введения, основной части, содержащей 5 глав, заключения и списка цитируемой литературы, содержащего 321 ссылку. Диссертация изложена на 168 страницах текста, содержит 5 таблиц и 40 рисунков.
