Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Структура и динамика биологических макромолекул по данным спектроскопии магнитного резонанса 8
1.1. Основы метода спиновых меток 8
1.2. Симуляция спектров ЭПР на основе атомистического моделирования 18
ГЛАВА 2. Совместное использование методов спиновых меток и молекулярной динамики 33
2.1. Общая характеристика существующих методов расчета спектров ЭПР спин-меченых макромолекул 33
2.2. Стабильные интермедиаты актин-миозинового цикла по данным метода спин-метки...34
2.3. Анализ траекторий молекулярной динамики 42
2.4. Расчет спектров ЭПР из траекторий МД на основе формализма частичного усреднения тензоров 48
2.5. Расчет спектров ЭПР из траекторий МД на основе формализма ориентационного потенциала 55
ГЛАВА 3. Метод температурно-вязкостной зависимости в спектроскопии ЭПР 63
3.1. Основы метода температурно-вязкостной зависимости 63
3.2. Стабильные интермедиаты актин-миозинового цикла 65
3.3. Образование белкового комплекса барстар-барназа 68
ГЛАВА 4. Использование методов ЯМР для исследования клеточных комплексов переходных металлов 72
4.1. Современные методики ядерного магнитного резонанса в исследовании макробициклических трис-диоксиматов железа(П) и кобальта(П) 72
4.2. Конформационная динамика бис-клатрохелатов железа(П) 74
4.3. Парамагнитные сдвиги в клатрохелатах кобальта(П) 78
ГЛАВА 5. Магнетохимическое изучение макробициклических трис-диоксиматов кобальта(ІІ) 90
5.1. Магнетохимические характеристики комплекса Со(СІ20т)з(ВСНз)2 90
5.2. Влияние апикальных заместителей на магнитные свойства комплексов с шестью реберными атомами хлора 93
ГЛАВА 6. Использование спектроскопии ЭПР для изучения особенностей электронной структуры клеточных комплексов кобальта и железа 96
6.1. Фенол-содержащие макробициклические трис-диоксиматы 97
6.2. Электронная структура инкапсулированного иона кобальта(П) в клатрохелатах кобальта
по данным спектроскопии ЭПР 99
ГЛАВА 7. Ингибиторы протеазы ВИЧ на основе клеточных комплексов железа(П) 109
7.1. Антиретровирусная терапия ВИЧ 109
7.2. Ингибиторы протеазы ВИЧ на основе клеточных комплексов железе(И) 111
ГЛАВА 8. Экспериментальная часть 117
8.1 Приготовление образцов спин-меченых белков 117
8.2. Регистрация спектров ЭПР 118
8.3. Симуляция спектров ЭПР 120
8.4. Регистрация спектров ЯМР 120
8.5. Расчет траекторий молекулярной динамики 121
8.6. Молекулярный докинг клеточных комплексов железа(П) в активный центр протеазы ВИЧ 122
Выводы 124
Список литературы 125
- Симуляция спектров ЭПР на основе атомистического моделирования
- Расчет спектров ЭПР из траекторий МД на основе формализма частичного усреднения тензоров
- Современные методики ядерного магнитного резонанса в исследовании макробициклических трис-диоксиматов железа(П) и кобальта(П)
- Влияние апикальных заместителей на магнитные свойства комплексов с шестью реберными атомами хлора
Введение к работе
Актуальность работы. Конформационная подвижность биологических макромолекул, в частности белков, является определяющим фактором протекания практически всех биохимических процессов. Сложнейшие белковые «молекулярные машины» в процессе своего функционирования подвергаются значительным конформационным изменениям, важным для проявления их функций. Однако, за небольшим исключением, существующие в настоящее время методы исследований позволяют лишь приблизительно определить структуру как активного центра фермента, так и всего белка.
Использование прямого метода рентгеноструктурного анализа также не во всех случаях позволяет сделать вывод о механизме действия белка, поскольку статическая
пространственная структура в кристалле, которую можно установить при помощи дифракционных методов, может в значительной степени отличаться от динамически изменяющейся структуры изучаемой макромолекулы в растворе. Кроме того, вышеуказанные методы предоставляют информацию о структуре белка, соответствующую наиболее устойчивому состоянию системы, и не дают возможности изучить динамику белковой структуры и ее конформационную подвижность. Между тем, именно эти факторы в значительной степени ответственны за проявления биологической активности белков и других классов биологических макромолекул. Как результат, в настоящее время, несмотря на значительный прогресс в структурной биологии, все еще наблюдается дефицит методов, которые могут быть использованы для изучения динамической структуры макромолекул. Спектроскопия ЭПР является эффективным методом исследования структуры и динамики макромолекул в растворе. Комбинированное использование спектроскопии ЯМР и метода спиновых меток, при котором источником дополнительной информации о структуре и динамике системы является взаимодействие парамагнитного центра с магнитными моментами ядер, позволяет исследовать объекты, недоступные для стандартных методов ЯМР и ЭПР.
Таким образом, тщательный анализ особенностей структуры и динамики парамагнитных меток и зондов на основе нитроксильных радикалов и парамагнитных ионов переходных металлов, составляющий предмет диссертационной работы,
предоставляет широкие возможности для их использования при изучении различных биологических и супрамолекулярных систем.
Связь работы с научными программами, планами, темами. Работа выполнена в соответствии с тематиками Федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» (ГК № 02.513.12.0005, ГК № 02.513.11.3251), программ фундаментальных исследований Отделения химии и наук о материалах № 9 «Медицинская и биомолекулярная химия», «Химия и физикохимия супрамолекулярных систем и атомных кластеров» и «Создание научных основ экологически безопасных и ресурсосберегающих химико-технологических процессов», программ фундаментальных исследований Президиума РАН «Развитие методологии органического синтеза и создание соединений с ценными прикладными свойствами» и «Молекулярная и клеточная биология» и при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проекты 06-03-32626, 06-03-90903, 07-03-00765, 07-03-12144, 07-03-12183, 08-03-00341, 08-03-00399, 08-03-90107, 09-03-00540 и 09-03-00688).
Целью работы являлся поиск новых путей исследования динамической структуры биологических макромолекул и супрамолекулярных структур при помощи парамагнитных меток и зондов, позволяющих получать информацию как о макроскопических характеристиках молекул в растворе, так и о слабоамплитудных локальных конформационных изменениях. Основными задачами исследования являются:
- анализ существующих методов теоретического моделирования спектров ЭПР
спин-меченых макромолекул в растворе и определение областей их применимости;
— исследование ряда спин-меченых белков и интерпретация полученных
спектров ЭПР при помощи методов, обеспечивающих повышение достоверности
результатов за счет регистрации большого числа спектров ЭПР при разных значениях
температуры и вязкости, а также за счет регистрации спектров ЭПР в разных
частотных диапазонах при параллельном расчете траекторий молекулярной динамики
для исследуемых белков;
-установление возможности использования макробициклических трис-диоксиматов (клатрохелатов) кобальта(ІІ) в качестве репортерских групп и сдвигающих реагентов в спектроскопии ЯМР;
— определение с использованием методов ЭПР и магнетохимии молекулярной и электронной структуры ряда клеточных комплексов кобальта(П), перспективных с точки зрения создания новых эффективных парамагнитных зондов.
Научная новизна и практическая значимость полученных результатов.
Установлено, что при совместном использовании методов молекулярной динамики и метода спиновых меток симуляция спектров ЭПР из траекторий молекулярной динамики, проводимая на основании формализма частичного усреднения магнитных тензоров, приводит к значительному улучшению согласования рассчитанных спектров с экспериментальными по сравнению с формализмом ориентационного потенциала.
Продемонстрирована чувствительность метода спиновых меток, основанного на изучении зависимости формы спектра ЭПР от температуры и вязкости, как к температурно-индуцируемым конформационным переходам, так и к образованию комплексов белок-белок.
Установлено, что в ряде макробициклических трис-диоксиматов кобальта(ІІ) наблюдаются значительные псевдоконтактные сдвиги в спектрах ЯМР, обуславливающие потенциал этого класса соединений в качестве сдвигающих реагентов и парамагнитных зондов.
Методами магнетохимии и спектроскопии ЯМР обнаружены спиновые переходы в макробициклических гексахлор-содержащих трис-диоксиматах кобальта(ІГ) и подробно изучена их электронная структура.
Апробация результатов работы.
Основные результаты работы были представлены на международных конференциях "Modern Development of Magnetic Resonance" (Казань, Россия, 2004, 2007), "International conference on new techniques and applications of modern physical chemical methods for environmental studies" (Ростов-на-Дону, Россия, 2008), "51st Annual Meeting of Biophysical Society" (Salt Lake City, USA, 2005), "Conference of the International Symposium on Electron Spin Science and the 46th Annual Meeting of the Society of Electron Spin Science" (Shizuoka, Japan, 2007), "EUROMAR-2008" (Санкт-
Петербург, Россия, 2008), "9th European Biological Inorganic Chemistry Conference", (Krakow, Poland, 2008), «Высокоспиновые молекулы и молекулярные магнетики» (Екатеринбург, Россия, 2008), "Joint Conference of 13th In Vivo EPR Spectroscopy and Imaging 10th International EPR Spin Trapping/Spin Labeling" (Fukuoka, Japan, 2008).
Публикации.
Основной материал диссертации изложен в 5 статьях в ведущих отечественных и международных научных изданиях, а также тезисах 9 докладов на международных конференциях и симпозиумах.
Структура и объем работы.
Диссертация состоит из введения, литературного обзора, обсуждения результатов (7 глав), экспериментальной части, выводов и списка литературы. Материал диссертации изложен на 134 страницах, содержит 9 таблиц и 73 рисунка. Список литературы включает 105 наименований.
Образцы белков для исследования методом спин-метки были предоставлены Т.Г. Баландиным, СМ. Деевым, Р.В. Агафоновым и Д.И. Левицким. Образцы клатрохелатов железа(П) и кобальта(П), изученные методами магнитного резонанса, были получены О.А. Варзацким (ИОНХ НАНУ, Киев) и А.С. Беловым, А.Ю. Лебедевым, И.Г. Макаренко (ИНЭОС РАН, Москва). Автор считает своим долгом выразить вышеупомянутым коллегам глубокую признательность. Автор также выражает благодарность А.С. Перегудову (ИНЭОС РАН, Москва) за предоставление приборного времени на спектрометре ЯМР, А.В. Фионову (МГУ) за помощь в регистрации спектров ЭПР при пониженных температурах и К.А. Лысенко (ИНЭОС РАН, Москва) за проведение рентгенодифракционных исследований и квантовохимических расчетов. Автор особенно благодарен Ю.Е. Несмелову и Я.В. Ткачеву за неоценимую помощь в работе и плодотворные дискуссии.
Симуляция спектров ЭПР на основе атомистического моделирования
Тем не менее, предложенные модели переориентации спиновой метки не подходят для описания спин-меченых макромолекул, поскольку движение репортерской группы, ограниченное окружающими аминокислотными остатками, не может быть описано в рамках таких простых приближений. Использование же этого подхода для более сложных моделей движения приводит к ряду трудностей.
Например, вернемся к предположению о малости At, которое накладывает серьезное ограничение на использование данного подхода. В самом деле, если траектория co(t) состоит из N шагов с интервалами At, то полная длина траектории составляет Т = N At. Разрешение полученного спектра определяется как 1/Т = Av. Таким образом, для достижения разрешения 0.3 Гаусс длина траектории должна составит, как минимум, порядка 1 мкс. Следовательно при At = 0.3 не (величина, при которой возможен расчет спектра шириной 1000 Гаусс) необходимо порядка iV 214 точек. Достижение этих характеристик не представляет трудности для траекторий стохастической динамики свободных нитроксильных радикалов (что и было показано авторами [19]), но весьма затруднительно для траекторий молекулярной динамики сложных белковых систем, которые не могут быть получены за адекватное расчетное время.
Так, например, попытка адаптации рассмотренного подхода для симуляции спектров спин-меченых белков была предпринята Штайнхоффом и Хабблом в работе [20]. Авторы отметили, что, по-видимому, именно пространственные ограничения, производимые ближайшим белковым окружением на диапазон возможных переориентации спиновой метки, в первую очередь, оказывают влияние на форму спектра ЭПР. Также было указано, что подход, наиболее часто используемый для интерпретации спектров ЭПР спин-меченых макромолекул [11], не всегда позволяет адекватно разделить изменения в форме спектра ЭПР, вызванные ограничениями амплитуды движения спин-метки и анизотропией тензора диффузии. Данного недостатка лишен, однако, метод, основанный на использовании МД-траекторий.
Тем не менее, в силу указанных выше ограничений, метод, предложенный Робинсоном [19], не применим для расчета спектров ЭПР спин-меченых белков без каких-либо адаптации. Это вызвано, в первую очередь, тем, что длина траектории МД не должна быть меньше времени поперечной релаксации, т.е. не меньше нескольких сотен наносекунд. Поскольку современные вычислительные мощности не позволяют проводить столь сложные расчеты, весь процесс вычислений был разбит на два последовательных шага. Влияние соседних аминокислотных остатков и остова макромолекулы было представлено в виде некоторой потенциальной функции, которая рассчитывалась исходя из траекторий молекулярной динамики длительностью порядка одной наносекунды. Затем вычисленная потенциальная функция использовалась для описания движения нитроксила в одночастичном приближении, что позволило значительно упростить динамические уравнения и дало возможность рассчитать траектории броуновской динамики длиной до 600 не.
Следует отметить, что авторами был предложен способ задания потенциальной функции, заметно отличающийся от того, который использовался ранее. Аналогично работам [11, 12] функция эффективного потенциала U(Q) была связана с функцией распределения W{Q) согласно уравнению но, в отличие от суммы сферических гармоник, наиболее часто применяющейся для описания углового распределения, авторы [20] использовали приближение функции распределения W (D.), полученной из МД, трехмерным распределением Гаусса:
Найденная функция U(Q.) затем использовалась для расчета значительно более длительной траектории ланжевеновской динамики. Разработанный подход был проверен на модельной системе — спин-меченом тримере полилейцина, имеющем альфа-спиральную структуру. Полученные спектры демонстрировали хорошее совпадение со спектрами, рассчитанными на основании модели изотропной диффузии [11]. К сожалению, сравнение полученных спектров с экспериментальными данными для этой системы не проводилось. Тем не менее, авторы указали на возможность использования данной модельной системы для структурного описания конформационных изменений бактериородопсина. Действительно, в последующей работе [21] данный метод был применен для расчета спектров ЭПР мутантов спин-меченого бактериородопсина, в которых аминокислотные остатки с 165-го по 171-ый были замещены на цистеин и помечены тиосульфонатной спиновой меткой MTSSL (Рис. 2b). Выбранный для исследования регион белка по ранее полученным данным являлся важным для понимания структурных перестроек во время каталитического цикла бактериородопсина.
Рассчитанные спектры демонстрировали лишь некоторое сходство с экспериментальными. В относительно недавней статье тех же авторов [22] указанный подход был несколько улучшен за счет того, что расчет траекторий МД проводился при значении температуры, составляющем 600 К. Такая температура привела к повышенной подвижности спин-метки и позволила добиться большего охвата всех областей ее конформационного пространства. Рассчитанные спектры ЭПР мутантных бактериородопсинов с цистеинами в положениях от 157 до 171 достаточно неплохо согласовывались с экспериментальными данными. К сожалению, этого было недостаточно, чтобы оценить достоинства или недостатки метода, поскольку производилось сравнение только со спектрами в Х-диапазоне, в то время как для комплексной оценки динамических характеристик спин-метки необходимо использование также и спектров, зарегистрированных в высокочастотных диапазонах.
Расчет спектров ЭПР из траекторий МД на основе формализма частичного усреднения тензоров
В силу зависимости спектра ЭПР от ориентации нитроксильного радикала в магнитном поле, представлялось необходимым описать эволюцию спиновой метки как угловую переориентацию системы координат, связанной с нитроксилом, относительно лабораторной системы координат. Одним из способов, позволяющих однозначно описать взаимное пространственное расположение двух систем отсчета, является применение Эйлеровых углов [72]. Три последовательных поворота вокруг соответствующих осей позволяют совместить любые две ортогональные системы координат. Математически переход от одной системе координат к другой можно описать как действие матрицы направляющих косинусов Т, зависящей от ер, Э и \j/ -Эйлеровых углов между соответствующими системами координат. Если не указано специально, в качестве лабораторной системы координат была использована система отсчета, которая применялась для расчета траекторий молекулярной динамики. Влияние выбора лабораторной системы координат будет рассмотрено далее.
Нитроксильная система координат должна быть фиксирована по отношению к атомам спиновой метки, и ее направление очевидным образом связано с направлением р2-орбитали связи N-0. Логично совместить начало координат с атомом азота нитроксильнои группы и связать направление основных осей нитроксильнои системы координат с координатами атомов азота и кислорода, входящих в состав нитроксильнои группы, а также координатами двух ближайших к нитроксильнои группе атомов углерода Са и Са-. Тем не менее, в литературе существует три несколько различающихся способа определения положения нитроксильнои системы отсчета. В первом из них, использованном в работе [36], за направление оси х принимали направление связи N-O, ось у направляли вдоль линии, соединяющей атомы Са и Са , а направление оси z определяли в виде векторного произведения осей х и у. Данный метод, однако, имеет недостаток, связанный с тем, что полученная система координат не обязательно будет ортогональной. Другой способ, примененный в работе [22], также использовал определение оси у на основе координат атомов Са и Са-, но в качестве направления оси z принималось векторное произведение векторов, совпадающих со связями Ca-N и Ca—N, а ось х была определена в виде векторного произведения осей у и z. Тем не менее, данный подход также не был лишен недостатков, поскольку при его использовании терялась информация о направлении связи N-O, поэтому в настоящей работе был использован третий подход, предложенный в работе [39]. В рамках данного способа ось х также направляли по связи N-O, а направление оси z совмещали с вектором, представляющим собой сумму векторных произведений (Са—N х N-O) и (N-O х N— Са-). Направление последней оси у определяли как векторное произведение осей z и х. Полученная система координат является ортогональной по определению и достаточно точно передает положение нитроксильной системы координат. 2.3.4. Функции распределения Эйлеровых углов На Рис. 17 приведен трехмерный график, изображающий распределение Эйлеровых углов для АРО-изоформы миозина. Каждая точка графика соответствует одному набору Эйлеровых углов определенного шага траектории МД. На Рис. 19 показаны проекции данного графика на соответствующие оси. Легко видеть, что каждая из этих проекций может быть описана при помощи функции нормального распределения. . Для двух других форм миозина функция распределения имеет более сложную форму. Так, например, на Рис. 18 представлено распределение Эйлеровых углов для ADP-Vi. На проекциях (Рис. 19) особенно хорошо заметно, что функция распределения включает в себя две составляющие, каждая из которых с высокой достоверностью соответствует нормальному распределению. Анализ зависимости Эйлеровых углов от времени указывает на то, что для системы характерно долгое пребывание вблизи каждого из локальных минимумов с редкими переходами между ними. Наиболее сложный вид имеет функция распределения для формы ADP (Рис. 20). Видно, что она состоит из большого числа составляющих, причем разброс возможных положений спин-метки весьма велик. Проекции также демонстрируют значительную дисперсию наблюдаемых параметров. 2.3.4. Разделение траекторий МД на моды Анализ траекторий показал, что для изоформ ADP и ADP-V; траектории молекулярной динамики включают два или более локальных минимума, в которых большую часть времени происходит движение спиновой метки. При этом переход от одного локального минимума к другому реализуется за пренебрежимо малое время, поэтому можно сделать предположение, согласно которому итоговый спектр представляет собой суперпозицию двух независимых составляющих, относящихся к разным локальным минимумам.
Современные методики ядерного магнитного резонанса в исследовании макробициклических трис-диоксиматов железа(П) и кобальта(П)
Полученные значения усредненных тензоров были использованы для расчета спектров ЭПР. Для расчета применялась программа NLSL [40], ранее модифицированная согласно [73, 74]. Время вращательной корреляции, согласно [62], составляло 200 не. Значения тензора ширины линии подбирались отдельно в каждом случае для лучшего согласования симулированного спектра с экспериментальными результатами.
Спектры, рассчитанные для АРО-изоформы миозина (Рис. 23), демонстрируют замечательное совпадение с экспериментальными данными. Особенно хорошее согласование достигнуто в спектре для W-диапазона. Тем не менее, в слабопольной части спектра в Х-диапазоне наблюдается некоторое несоответствие симулированного спектра экспериментальному. Возможная причина этого явления -большая чувствительность спектров в Х-диапазоне к медленному движению спиновой метки. Вероятно, для более точной симуляции спектров в Х-диапазоне нужно вводить поправку на анизотропию той составляющей движения спин-метки, которая связана с диффузией всей молекулы в растворе. Поскольку из данных рентгеноструктурного анализа известно, что молекула S1 имеет не шарообразную, а грушевидную форму [56], описание движения всего белка при помощи анизотропного тензора диффузии, возможно, позволит несколько улучшить соответствие и низкочастотных спектров.
Для спектров, соответствующих ADP и ADP-V,, характерны те же особенности, что и для АРО-спектров: в W-диапазоне соответствие спектров лучше, чем в X-диапазоне. Тем не менее, существуют и некоторые дополнительные отличия. Так, в центральной части высокочастотного спектра, рассчитанного для ADP, заметно расщепление, которое практически полностью усреднено в соответствующем экспериментальном спектре. Это, по-видимому, связано с ограничениями использованной модели: описание сложного движения спин-метки одним набором частично усредненных тензоров не всегда достаточно адекватно отражает действительность. Вероятно, дальнейшее усложнение, заключающееся в использовании кластерной модели, описанной в [17], позволит более эффективно учесть распределение ориентации спин-метки по ансамблю спин-меченых макромолекул. Тем не менее, существующее совпадение уже является вполне достаточным для поставленных целей, поскольку даже такое полуколичественное совпадение рассчитанных спектров с экспериментальными позволяет судить об адекватности результатов, полученных при помощи метода молекулярной динамики.
Формализм ориентационного потенциала, являющийся основой методик симуляции спектров ЭПР SRLS и MOMD, уже использовался вместе с данными расчетов по методу молекулярной динамики в работе [39]. Однако, в указанной работе не были в достаточной степени освещены некоторые моменты процедуры симуляции, важные для применения ее для систем, отличных от описанной авторами [39]. Ввиду этого, в данном разделе настоящей работы была предпринята попытка адаптация указанного подхода для интерпретации данных, полученных при расчете траекторий молекулярной динамики для двух стабильных аналогов интермедиатов актин-миозинового цикла.
Поскольку в основе метода лежит определение коэффициентов сферических гармоник, входящих в выражение для функции плотности вероятности распределения ориентации спиновой метки на первой стадии необходимо было найти указанную функцию Рш(б, р) из траекторий молекулярной динамики. При этом углы 0 и р должны были соответствовать сферическим координатам вектора, фиксированного в . нитроксильной системе координат, по отношению к некоторой молекулярной системе координат. Для того, чтобы можно было выбрать положение молекулярной системы координат наилучшим образом, необходимо еще раз рассмотреть основные координатные системы, используемые в рамках модели SRLS, и связь между ними
координат) и CF (так называемый «внутренний директор») описывается одним, не зависящим от времени набором Эйлеровых углов dec- Применительно к глобулярному белку в растворе данный переход не имеет выраженного физического смысла и вводится только для удобства, поскольку позволяет выбрать такую систему координат CF, что функция плотности вероятности, описывающая переориентацию Псч(0 диффузионной системы координат IF по отношению к CF, будет иметь максимально удобный, т.е. максимально симметричный, вид. При этом очевидно, что если процесс броуновской диффузии всего белка в растворе, описываемый набором Эйлеровых углов QLCO), происходит практически изотропно, что оправдано для подавляющего числа глобулярных белков, то выбор любого направления осей директора никаким образом не повлияет на конечный результат расчета.
Аналогично, положение молекулярной системы координат спиновой метки MF связано с направлением осей диффузионной системы координат IF еще одним не зависящим от времени набором Эйлеровых углов 1сс, которые обычно называют «углами наклона» (tilt angles). Физический смысл данной замены системы координат применительно к спин-меченому белку также не ясен, поскольку даже физический смысл диффузионной системы координат спиновой метки, ковалентно закрепленной на белке, не определен. Таким образом, одно и то же распределение ориентации спин-метки относительно белковой системы координат может быть описано бесконечным числом функций плотности вероятности ориентации спин-метки Ркю(в, р) при различных направлениях осей директора и различных углах наклона. Однако, с учетом того, что в применяемых в настоящее время программах для симуляции спектра ЭПР, основанных на формализме ориентационного потенциала, используются только 5 четных сферических гармоник F2, 722, У4, 742, Y вместо бесконечного набора элементов матрицы Вигнера D (Q), разумно будет выбирать оси директора и углы наклона таким образом, чтобы добиться максимальной симметрии функции РЛФ(в,р) . Замена функции, определенной в пространстве Эйлеровых углов Рш(о), на функцию, определенную на сфере Ркю(в, р), приводит к тому, что для каждого шага траекторий молекулярной динамики необходимо определить только ориентацию одного вектора, фиксированного в нитроксильной системе координат, в одной фиксированной лабораторной системе координат. В данном случае по соображениям удобства определяли направление вектора, направленного вдоль связи N-O в лабораторной системе координат. Последнюю выбирали таким образом, чтобы усредненное положение всех векторов соответствовало значению 9 = 0, ф = 0. Таким образом, для каждой траектории МД получали набор углов, из которого на следующей стадии определяли функцию плотности вероятности Ркю{в,ср). 2.5.2. Определение функции Рмо{в,(р)
Влияние апикальных заместителей на магнитные свойства комплексов с шестью реберными атомами хлора
Как было показано в Главе 1, основной задачей при интерпретации спектров ЭПР спин-меченых белков является повышение достоверности получаемых результатов и снижение вырожденности решения относительно значительного набора параметров, используемых для моделирования формы спектра ЭПР. В Главе 2 были рассмотрены два популярных способа, используемых для снижения вероятности ошибки в интерпретации экспериментальных спектров ЭПР: регистрация спектров в разных частотных диапазонах, обладающих различной чувствительностью к молекулярному движению в разных временных шкалах, и описание одного из движений, в котором принимает участие спиновая метка, при помощи метода молекулярной динамики. Как было показано в предыдущей главе, подобные методы иногда действительно позволяют облегчить интерпретацию экспериментальных данных, однако их использование достаточно затруднительно для широкого круга исследователей, поскольку спектрометры, позволяющие провести регистрацию спектров ЭПР в высокочастотных диапазонах (W-диапазон и выше), крайне дороги, а расчет достаточно длинных (для спектров ЭПР) траекторий молекулярной динамики белковых систем требует наличия значительных вычислительных мощностей.
В данной главе рассмотрен альтернативный подход, описанный в работе [75], названный «методом температурно-вязкостной зависимости», в рамках которого изучают отклик системы на изменение температуры и вязкости раствора спин-меченого белка. В рамках данной работы будет продемонстрировано применение этого подхода для исследования динамических характеристик уже описанных в предыдущей главе спин-меченых аналогов стабильных интермедиатов актин-миозинового цикла, а также для исследования образования белковых комплексов барстара и барназы.
Метод температурно-вязкостной зависимости [75] основан на регистрации и анализе изменений, происходящих в спектрах ЭПР спин-меченых макромолекул, при изменении таких макроскопических характеристик образца, как вязкость и температура. Для изменения вязкости чаще всего используют сахарозу, добавленную к образцу в известной концентрации. В основе метода лежит предположение, согласно которому изменение вязкости образца влияет в первую очередь на диффузию белковой глобулы как целого в растворе, не затрагивая локальную подвижность аминокислотных остатков, в том числе и спин-меченого остатка цистеина. С другой стороны, увеличение температуры ведет как к повышению подвижности белковой глобулы как целого, так и к изменению динамических характеристик спин-меченого аминокислотного остатка (выражающемуся, как правило, в увеличении конформационного пространства, доступного для переориентации спин-метки). В качестве количественных характеристик, описывающих подвижность глобулы в целом и спин-метки относительно глобулы, в частности выступают значение времени корреляции белка т и параметр упорядоченности спиновой метки S соответственно. В качестве анализируемого параметра используют расщепление, наблюдаемое между так называемыми крайними широкими пиками (КШП), которое представляют собой расстояние в гауссах между самым сильнопольным и самым слабопольным экстремумами в спектре. Стоит отдельно подчеркнуть, что данная терминология относится только к спектрам ЭПР, в которых наблюдаются именно крайние экстремумы, уширенные вследствие медленного движения. Спектры ЭПР, представляющие собой три острые линии, не могут быть проанализированы в рамках данной методологии, поскольку вырожденность подобных спектров крайне высока. С другой стороны, часто в спектрах, не имеющих крайних широких пиков при стандартных значениях температуры и вязкости и поэтому не поддающихся однозначной интерпретации в рамках любых подходов, при повышении вязкости и понижение температуры появляются крайние широкие пиков, которые предоставляют возможность недвусмысленной интерпретации спектров ЭПР.
В основе анализа полученного массива экспериментальных данных (порядка 20-25 спектров при 4-5 значениях вязкости и температуры) лежит построение графика зависимости расстояния между КШП (2А ) от значения (Т/г)р, где Т представляет собой температуру, г\ - вязкость, ар- зависящий от экспериментально наблюдаемой ширины линии параметр, в большинстве случаев приближенно равный 0.74. При этом для каждого значения температуры наблюдается линейная зависимость, которая остается линейной до значения вязкости, составляющего около 8-10 сПз (что соответствует, приблизительно, 40% концентрации сахарозы, используемой для модулирования вязкости раствора). При больших значениях вязкости условие о влиянии повышенной вязкости только на диффузию белка как целого, лежащее в основе метода, нарушается и происходят отклонения графика от линейности. Во всех случаях значение 2А будет меньше соответствующего расщепления 2AZZ, наблюдаемого в спектрах тех же самых замороженных образцов. Анализ полученных графиков, более детально описанный в [75], позволяет определить время корреляции спин-меченого белка и значение параметра упорядоченности спиновой метки, описывающее конформационную подвижность спиновой метки по отношению к ее окружению. Кроме того, неожиданные отклонения графиков от линейности могут свидетельствовать о наличие дополнительной доменной подвижности в белковой глобуле и о температурно-зависимом конформационном переходе.
