Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Литературный обзор и задачи исследования 17
1.1. Гидрозоли коллоидного золота и их применение 17
1.1.1. Методы формирования золотых наночастиц и физико-химические основы агрегативной устойчивости золей 17
1.1.2. Влияние полимеров на агрегативную устойчивость золей и формирование конъюгатов КЗ с биоспецифическими макромолекулами 22
1.1.3. Применение биоспецифических маркеров - конъюгатов КЗ 25
1.2. Нерешенные проблемы и постановка задач исследования 34
Глава 2. Материалы и методы исследования 37
2.1. Приборы и реактивы 37
2.2. Методики формирования золотых наночастиц заданного размера (5 - 60 нм) и их конъюгатов с полимерами 38
2.2.1. Получение золей золота со средним диаметром частиц 30 нм .39
2.2.2. Получение золей золота со средним диаметром частиц 15 нм 39
2.2.3. Получение золей золота со средним диаметром частиц 5 нм 39
2.2.4. Образование конъюгатов КЗ с биоспецифическими макромолекулами 40
2.3. Проверка качества биоспецифических маркеров с помощью твердофазного иммуноанализа 42
2.4. Электронно-микроскопический анализ агрегатов наночастиц коллоидного золота 44
2.5. Метод измерения спектров статического рассеяния света на спектрофотометре "Specord М-40" 44
Глава 3. Поглощение и рассеяние света кластерами коллоидных золотых и серебряных частиц, формирующимися в режимах медленной и быстрой агрегации 47
3.1. Зависимость спектров экстинкции от режима агрегации (быстрая/медленная) и размера частиц 47
3.2. Сравнение экспериментальных спектров с модельными теоретическими расчетами 58
3.3. Влияние инициатора агрегации на изменения спектров экстинкции (на примере пиридина) 63
3.4. Влияние предварительной стабилизации золотых золей с помощью Tween-20 на спектры экстинкции их агрегатов 69
3.5. Спектры статического рассеяния света при солевой агрегации золотых наночастиц 74
3.6. Связь между структурой агрегатов и их спектральными свойствами при солевой агрегации золотых наночастиц 83
Глава 4. Спектральные свойства кластеров, формирующихся при агрегации конъюгатов наночастиц коллоидного золота с полимерами 90
4.1. Исследование спектров поглощения и статического рассеяния для агрегатов, формирующихся в системах КЗ + желатин и (КЗ + Tween20) + ЧСА .90
4.2. Спектры поглощения и статического рассеяния при биоспецифической агрегации в системе (КЗ + Protein A) + IgG 96
4.3. Связь между структурой агрегатов конъюгатов наночастиц коллоидного золота с полимерами и их спектральными свойствами 102
4.4. Спектральный вариант метода SPIA для аналитического определения концентрации биополимеров 106
Заключение и выводы 110
Список литературы 113
Благодарности 126
- Методы формирования золотых наночастиц и физико-химические основы агрегативной устойчивости золей
- Методики формирования золотых наночастиц заданного размера (5 - 60 нм) и их конъюгатов с полимерами
- Сравнение экспериментальных спектров с модельными теоретическими расчетами
- Спектры поглощения и статического рассеяния при биоспецифической агрегации в системе (КЗ + Protein A) + IgG
Введение к работе
Для исследования дисперсных систем различной природы часто применяют методы, основанные на эффекте поглощения или рассеяния света малыми частицами. Эти методы позволяют получать информацию о размере, форме, концентрации частиц без препаративного вмешательства в систему и дают взаимодополняющую информацию о системе. Агрегация малых коллоидных частиц сопровождается изменением оптических свойств дисперсной системы, например изменением спектров экстинкции [1]. Эти изменения связаны с электродинамическим взаимодействием частиц из-за многократного внутрикластерного рассеяния. Исследование оптических характеристик агрегированных взвесей позволяет эффективно изучать механизмы их устойчивости и агрегации [2-5]. В частности, имеется большое количество теоретических и экспериментальных работ по оптическим свойствам частиц коллоидного золота и их агрегатов [6-15].
Биоконъюгаты коллоидного золота (КЗ) с полимерами представляют собой наночастицы, к поверхности которых прикреплены макромолекулы. Эти макромолекулы выполняют роль стабилизатора коллоида и имеют специфические «сайты», способные участвовать во взаимодействиях с комплементарными молекулами («молекулами-мишенями») в реакциях типа антиген-антитело, лектин-углевод, рецептор-лиганд и т.п. Такие конъюгаты широко используются в последние годы как эффективные оптические преобразователи биоспецифических взаимодействий в детектируемый оптический сигнал в устройствах, называемых биочипами и биосенсорами [16-22]. В данном случае непосредственно реализуется принципиальная возможность использования резкого усиления оптического сигнала от зонда (золотой наночастицы, коньюгированной с биоспецифическими макромолекулами) из-за усиления возбуждающего локального поля в сформировавшемся агрегате из золотых наночастиц. Подобные устройства представляют большой интерес для биологии (определение нуклеиновых кислот, белков и метаболитов), медицины (скрининг лекарственных веществ, выявление антител и антигенов, диагностика инфекций) и химии (экспресс-мониторинг окружающей среды, количественный анализ растворов и дисперсных систем).
Характерные спектральные свойства КЗ и красный цвет золя обусловлены поверхностным плазмонным резонансом золотых наночастиц вблизи длины волны 520 нм [1] (подробные расчеты спектров экстинкции и рассеяния, металлических и диэлектрических наночастиц приведены в статьях [23]). Взаимодействие конъюгатов КЗ с молекулами-мишенями может приводить либо к агрегации частиц, либо к изменению толщины и структуры полимерной оболочки за счет присоединения молекул-мишеней. В случае агрегации величина и положение резонанса заметно изменяются из-за сильного оптического взаимодействия наночастиц золота, когда среднее расстояние между ними меньше их размеров [13, 24]. При этом спектр экстинкции (поглощение + рассеяние, далее используется термин «поглощение») системы может изменяться существенным образом, вплоть до визуально наблюдаемого изменения цвета. Изменения спектров, обусловленные адсорбцией биополимеров на поверхности металлических частиц, сравнительно малы, однако даже эти малые эффекты были успешно использованы для биологических приложений [17].
Оба описанных сценария (адсорбция на отдельных частицах или агрегация) . относятся к реализации метода, называемого sol-particle-immunoassay (SPIA) [25, 26]. Этот метод весьма прост в реализации, однако за почти 20-летнюю историю развития количество публикаций и примеров его реального практического использования оказалось довольно скромным. Только в самое последнее время появились работы, указывающие на возможность его использования в качестве выскопроизводительного клинического теста [27]. Причина слабого внедрения метода связана, вероятно, с недостаточным пониманием физико-химических и оптических механизмов, ответственных за трансформацию измеряемых сигналов ослабления или рассеяния света при биоспецифическом связывании молекул-мишеней с биоконъюгатами. В частности, не была должным образом изучена зависимость спектров поглощения и рассеяния света кластерами от размера КЗ частиц и времени агрегации, а также зависимость структуры агрегированных биоконъюгатов от условий формирования и связь между структурой кластеров и их спектрами поглощения и упругого рассеяния. Кроме того, не была проведена сравнительная оценка возможностей применения спектров поглощения и рассеяния для разработки аналитических тестов, основанных на биоспецифической, агрегации
частиц КЗ. Большой интерес представляет также сопоставление экспериментальной временной зависимости спектров поглощения и рассеяния света с расчетами на основе современных теоретических моделей.
Целью диссертационной работы являлось экспериментальное исследование процессов агрегации наночастиц КЗ и их конъюгатов с биополимерами методами спектроскопии поглощения и спектроскопии статического рассеяния света (ССРС) под углом 90 градусов. Для интерпретации данных привлекались теоретические расчеты на основе компьютерных моделей кластер-кластерной агрегации и метода дискретных диполей (DDA - discrete dipole approximation). Задачи исследования:
Экспериментальное исследование зависимости спектров поглощения и рассеяния света кластерами, образованными при солевой агрегации КЗ частиц, от времени агрегации, размера частиц и концентрации соли (быстрый и медленный режимы агрегации).
Экспериментальное исследование спектров поглощения и рассеяния света при агрегации золей золота биополимерами, включая биоспецифические пары.
Электронномикроскопическое (ЭМ) исследование структуры агрегатов, сформированных при разных условиях. Исследование корреляции между структурой кластеров и их спектрами поглощения и упругого рассеяния.
Проведение сравнительной оценки возможностей применения спектров поглощения и рассеяния для разработки аналитического теста, основанного на биоспецифической агрегации.
Качественное сравнение временной зависимости спектров поглощения агрегирующих золей с расчетами на основе моделей кластер-кластерной агрегации и DDA.
Научная новизна работы: Обнаружено, что при быстрой солевой агрегации, соответствующей формированию некомпактных диффузионно-ограниченных (DLCA [28]) кластеров, вид спектров поглощения золей КЗ зависит от размера первичных частиц. Этот экспериментальный результат находится в качественном согласии с модельными теоретическими расчетами.
Установлено, что имеется несколько типов возможных трансформаций спектров поглощения при агрегации золей золота или конъгагатов с полимерами на их основе, которым соответствуют определённые типы структур агрегатов. Данная взаимосвязь определяется расстоянием между частицами в агрегатах, размером агрегатов, а также и размером агрегирующих частиц.
На примере биоспецифической пары протеин А + анти-IgG человека экспериментально продемонстрирована возможность оптимизации SPIA с использованием спектров поглощения биоагрегатов.
Научно-практическая значимость работы:
Изучение связи между размером первичных мономеров агрегатов, их структурой и полимерным покрытием частиц необходимо для решения прикладных задач стабилизации дисперсных систем полимерными добавками.
Представленные в работе данные о кинетике спектров упругого рассеяния при неспецифической или специфической агрегации биоконъюгатов на основе КЗ могут найти приложение для развития новых методик анализа на уровне нанограмных количеств полимера в миллилитре раствора.
Результаты работы могут найти также применение для оптимизации высокопроизводительных лабораторных клинических методов анализа, основанных на использовании биоспецифической агрегации, детектируемой планшетным фотометром.
Достоверность научных результатов, представленных в работе, обусловлена использованием для их получения апробированных методик измерений с учетом возможных погрешностей. Достоверность подтверждается воспроизводимостью экспериментальных результатов и их соответствием теоретическим расчетам, а также качественным согласием с независимыми исследованиями других авторов.
На защиту выносятся следующие основные положения: 1. Быстрая солевая агрегация мелких золотых частиц (5 нм) дает сильно уширенные одномодовые спектры с пониженным основным пиком, но без второго пика поглощения. Быстрая агрегация более крупных частиц (15 и 30 нм) сопровождается появлением второго длинноволнового пика поглощения. Этим
спектрам соответствуют рыхлые ветвистые кластеры с фрактальной размерностью меньше 2 и наличием внутренних цепочечных структур.
Агрегация биконъюгатов КЗ приводит к формированию кластеров без прямого контакта частиц, а соответствующие спектры всегда имеют только один максимум, который сдвинут в красную область и заметно уширен. В зависимости от размера агрегатов наблюдаеться как повышение (на начальных этапах), так и уменьшение максимума поглощения.
Величина спектрального смещения максимума поглощения коррелирует с концентрацией молекул-мишеней, вызывающих биоспецифическую агрегацию конъюгатов КЗ с биомакромолекулами при взаимодействии с их «узнающими» сайтами.
Работа выполнена в Лаборатории физической химии клеточных структур ИБФРМ РАН в рамках планов госбюджетных НИР.
Исследования поддерживалась грантами РФФИ (проекты № 98-03-32664а, 01-03-33130, 01-04-48736 и 00-04-96038), CRDF (грант № REC-006), грантом INCASS 98-4-04, а так же двумя аспирантскими грантами Международного научного фонда Дж. Сороса (2000-2001 гг.).
Апробация результатов:
Основные результаты диссертации обсуждались на следующих научных конференциях:
VIII Всероссийская конференция "Химия для медицины и ветеринарии" (Саратов, Россия, 1998).
4-th Conference on Electromagnetic and Light Scatttering by Nonspherical Particles: Theory and Applications (Vigo, Spain, 1999).
Школа-конференция "Горизонты физико-химической биологии" (Пущино, Россия, 2000).
10-th International Conference on Colloid and Interface Science (Bristol, England, 2000).
5-th International Conference on Light Scattering by Nonspherical Particles (Halifax, Canada, 2000).
Saratov Fall Meeting - International School for Young Scientists and Students on Optics, Laser Physics & Biophysics Workshop on Optical Technologies in Biophysics & Medicine (Saratov, Russia, 2000, 2001).
5-я Пущинская конференция молодых ученых "Биология - наука 21-го века", (Пущино, Россия, 2001).
Международная научная конференция. "Биотехнология на рубеже двух тысячелетий" (Саранск, Россия, 2001).
Публикации.
По теме диссертации опубликовано 12 работ (3 статьи в реферируемых журналах и 9 в трудах научных конференций)
Структура и объём работы.
Диссертация состоит из введения, основной части, содержащей 4 главы, заключения и списка цитируемой литературы из 139 ссылок. Диссертация изложена на 126 страницах машинописного текста, содержит 2 таблицы, иллюстрирована 31 рисунком и 3 фотографиями.
Краткое содержание работы.
Во Введении обоснована актуальность темы работы и её научно-практическое значение, сформулированы цель и задачи исследований и кратко изложены основные результаты диссертации.
В Главе 1 представлен обзор литературы по теме работы. В первой части обзора рассмотрены методы синтеза золотых наночастиц и физико-химические основы агрегативнои устойчивости полученных золей, затем влияние полимеров на устойчивость и агрегацию частиц КЗ, а также оптические свойства металлических наночастиц золей и получение конъюгатов КЗ с биоспецифическими макромолекулами. Во второй части обзора обсуждаются: применение биоспецифических маркеров - конъюгатов КЗ, использование КЗ в оптических биосенсорах, формулируются нерешенные проблемы и постановка задач исследования.
Методы формирования золотых наночастиц и физико-химические основы агрегативной устойчивости золей
Для приготовления коллоидных растворов золота существует два основных подхода. Первый основывается на дезинтеграции металлического золота, например, электрической дугой в жидкой среде [31]. Второй - более распространенный метод - основывается на синтезе коллоидных частиц из галогенидов золота, например, золотохлористоводородной кислоты (ЗХВК/НАиСЦ), с использованием химических восстановителей или облучения (ультразвуком, ультрафиолетом, пульсационный или лазерный радиолиз) [32]. Известно около ста различных органических и неорганических восстановителей, применимых для синтеза золотых золей [33]. Согласно исследованию Наумова [34], при формальдегидном восстановлении . золота в слабо щелочной среде происходят следующие реакции: АиС14Н + 2К2С03 + Н20 = Au(OH)3 + 2С02 + 4КС1; 2Аи(ОН)3 + К2С03 = 2Аи02К + ЗН20 + С02; 2Аи02К + ЗНСНО + К2С03 = 2Аи + ЗНСООК + КНШ3 + Н20. Средний диаметр частиц золота в золях, полученных этим методом, обычно находится между 10 и 40 нм. Гидрохинон восстанавливает Аи (III) до металла даже в холодной воде через Аи (I): 2Аи(Ш) + 6СГ + ЗС6Н4(ОН)2 + бе = ЗС 6 Н 4 02 + 2Аи +6НС1. Аскорбиновая кислота восстанавливает золото по уравнению: 2AuCI3 + ЗСбН806 = 2Au + 3C6H606 + 6НС1. Восстановление золота происходит и в кислых растворах (НС1, HNO3), причем быстро, даже при концентрации Аи 0.005 г/л [33]. Аи(Ш) восстанавливается в растворах 1.2 М НС1 до металла аминами и фенолами: 1,3-диамино-4-оксибензолом, n-аминофенолом, резорцином, пирогаллолом, оксигидрохиноном, флороглюцином, о-аминофенолом. Золото (I, III) восстанавливается до элементарного металлами, из которых наиболее активны Zn, Mg, Al, Ni. Они восстанавливают золото в кислом и щелочном растворах, даже если оно находится в растворе в форме прочного цианидного комплекса [33]. Боргидрид натрия NaBH4 восстанавливает Au(III) до металла из растворов 0.1 М НС1, HN03, нейтральных растворов и из растворов 0.5 М NaOH при комнатной температуре. Перекись водорода в щелочной среде восстанавливает Au(III) по уравнению: 2АиС13 + ЗН202 + 6КОН = 2Аи + 302 + 6 КС1 + 6Н20. Необходимыми условиями образования гидрозолей металлов являются следующие требования: 1. Вещество, образованное в результате химической реакции, должно быть практически нерастворимым в жидкости, в которой оно возникает. 2. Реакционная смесь должна быть разбавлена в значительной степени (чем больше разбавление, тем больше дисперсность гидрозоля).
Исходя из этих условий, однако, невозможно даже приблизительно спрогнозировать степень дисперсности золя, которая существенно зависит, . например, от физико-химических свойств восстанавливающих агентов, посторонних примесей и т.д. [34]. Кристаллизация золота начинается лишь после того, как пересыщение атомарного раствора золота в воде достигнет определенной величины, когда атомы золота относительно медленно (по сравнению со скоростями химических реакций) конденсируются в коллоидные частицы, а их размер достигнет таких пределов, которые позволяют им выступать в качестве конденсационных ядер или кристаллизационных центров [35]. Опыты, проведенные Жигмонди, показывают, что для золота величина критического зародыша равна приблизительно 1-2 нм [34].
При использовании сильных восстанавливающих агентов достигается практически мгновенное образование зародышей, в то время как при использовании слабых восстановителей процесс образования центров роста зародышей новой фазы иногда замедляется настолько, что коллоидный раствор вообще не образуется за разумный промежуток времени. В этом случае используют искусственное увеличение числа зародышей, приводящее к преодолению этого барьера, и реакция восстановления идет тем быстрее, чем больше прибавлено зародышей.
Если идет самопроизвольное образование зародышей, то чем больше зародышевых центров образовалось, тем более тонкодисперсными становятся золи вообще. При этом большей частью быстрое образование зародышей и их рост совершаются одновременно, т.е. растворенный металл расходуется как на образование зародышей, так и для их роста. Замедление скорости образования зародышей приводит к более грубодисперсному гидрозолю, а замедление скорости роста частиц - к более тонкодисперсному [34].
Исследование многочисленных препаратов коллоидного золота, полученных с помощью химического восстановления, показало, что большинство из них имеет ограниченную стабильность и широкое распределение по размерам частиц. Стабильные и достаточно монодисперсные золи золота получаются по методу Френса [36] с использованием цитрата натрия в качестве восстановителя ЗХВК при 100С. К кипящему 0.01% водному раствору ЗХВК добавляют раствор цитрата натрия в концентрации, варьируемой в зависимости от требуемого размера частиц. В отличие от эмпирически подобранных концентраций восстановителя, предложенных Френсом, в работах [10, 37] этот метод использовали для получения калибровочной кривой, по которой можно рассчитать необходимое количество цитрата натрия для получения частиц определённого размера (от 10 до 50 нм).
Метод Френса эффективен для приготовления относительно монодисперсных золей КЗ с диаметром частиц в диапазоне от 10 до 40 нм. Однако синтез больших коллоидных наночастиц золота с диаметрами между 40 и 120 им по этому методу дает неудовлетворительные результаты: частицы таких золей полидисперсные и успех в синтезе частиц заданного диаметра невысок. Кроме того, в данном случае трудно получить частицы с тем же самым средним диаметром для двух синтезов, выполненных в идентичных условиях [38, 39]. Авторами работ [38, 39] был использован метод синтеза коллоидных наночастиц золота с диаметрами между 30 и 100 нм зародышевым методом. В качестве исходных зародышей для дальнейшего роста наночастиц золота использовались высокомонодисперсные золи КЗ (со средним диаметром частиц около 12 нм), синтезированные по методу Френса. На основе поверхностно катализируемого процесса (Аи3+ восстанавливается действием NH2OH) можно довыращивать существующие наночастицы в частицы большего размера, определяемого исключительно начальным диаметром частиц и количеством добавленного Au+. Конечный вид распределения частиц имеет меньшую полидисперсность относительно золей золота, приготовленных за один шаг (восстановление Au3+ цитратом). Эффективный химический метод получения золотых частиц (с хорошей предсказуемостью размера и монодисперсностью формы), основанный на использовании золотых частиц с малым диаметром в качестве зародышей кристаллизации для дальнейшего роста золотых слоев, представлен в работах [40, 41]. Серебряные или золотые нанопалочки различной длины и толщины [42] также были синтезированы с использованием малых золотых частиц как затравок для их дальнейшего роста при химическом восстановлении соли серебра или золота в стержнеподобные мицеллы.
Методики формирования золотых наночастиц заданного размера (5 - 60 нм) и их конъюгатов с полимерами
Исследование многочисленных золей КЗ, полученных с помощью химического восстановления, показало, что многие из них имеют ограниченную стабильность и широкое распределение частиц по размерам. Метод с использованием цитрата натрия при 100С в качестве восстановителя ЗХВК, предложенный Френсом [36], позволяет получать достаточно стабильные и гомодисперсные золи золота, но в довольно узких пределах по размеру частиц (от 10 до 40 нм в диаметре [38, 39]). Мы использовали этот метод для получения золей золота с диаметром частиц в диапазоне 15-60 нм. Суть метода заключается в следующем: к кипящему 0.01% водному раствору ЗХВК добавляют раствор цитрата натрия в концентрации, варьируемой в зависимости от требуемого размера частиц. Золи золота со средним диаметром частиц 8-Ю нм получали, используя модификацию вышеизложенного метода, предложенную в работе [43], и отличающуюся порядком внесения реактивов (сначала цитрат натрия, а затем ЗХВК). Получение золей КЗ с диаметром частиц порядка 3 - 5 нм проводили способом [48], сущность которого заключается в восстановлении ЗХВК одновременно натриевой солью этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА-Ыа2) и борогидридом натрия при комнатной температуре и интенсивном перемешивании. Концентрация золота во всех гидрозолях всегда была постоянной и равной 57 мкг/мл (2.85x10"4 Моль). Эту же концентрацию использовали во всех теоретических расчетах. Ниже приведены протоколы получения золей золота со средним диаметром частиц около 30, 15 и 5 нм:
Протокол получения золей золота со средним диаметром частиц 30 нм (КЗ-30): в колбу Эрленмейера наливали 243.9 мл деионизованной бидистиллированной воды; воду доводили до кипения с обратным водяным холодильником на магнитной мешалке с электроподогревом; добавляли 2.5 мл 1% раствора ЗХВК; увеличивали обороты мешалки; добавляли 3.6 мл 1% раствора цитрата натрия; продолжали кипячение еще 30 минут; наблюдали образование золя насыщенно малиново-красного цвета. Протокол получения золей золота со средним диаметром частиц 15 нм (КЗ-15): в колбу Эрленмейера наливали 239.7 мл деионизованной бидистиллированной воды; воду доводили до кипения с обратным водяным холодильником на магнитной мешалке с электроподогревом; добавляли 2.5 мл 1% раствора ЗХВК; добавляли 7.8 мл 1% раствора цитрата натрия; увеличивали обороты мешалки; продолжали кипячение еще 20 минут; наблюдали образование золя красного цвета. Протокол получения золей золота со средним диаметром частиц 5 им (КЗ-5): в колбу Эрленмейера наливали 45 мл водного раствора ЭДТА-Ыаг с концентрацией 0.0003 М; начинали перемешивание без нагрева; добавляли 0.2 мл 0.2 М раствора карбоната калия (реакция проходит в щелочных условиях); добавляли 0.5 мл 1% раствора ЗХВК; увеличивали обороты мешалки; вносили быстро 125 мкл 0.5% раствора борогидрида натрия; наблюдали образование золя оранжево-красного цвета. После приготовления золи золота разливали в стерильные флаконы из темного стекла и хранили в холодильнике при + 4-6 С. Золи КЗ с размером частиц около 45 (КЗ-45) и 60 нм (КЗ-60) получали аналогично протоколу 2.2.1, но используя меньшие количества раствора цитрата натрия (2.5 и 1.7 мл соответственно) для восстановления ЗХВК. Методика получения конъюгатов КЗ с биоспецифическими макромолекулами включает в себя следующие этапы [37,43,58-60]: 1. Приготовление и очистку водного раствора зонда (белка). 2. Определение "золотого числа" (минимального количества белка, защищающего золь против солевой агрегации). 3. Прикрепление зонда к КЗ и добавление вторичного стабилизатора. 4. Концентрирование маркера и оптимизацию конечного продукта для хранения. Очистку водного раствора зонда мы проводили только для IgG, для Рг. А стадия очистки не требовалась. Оптимальные для стабилизации условия обычно достигаются при возможно более низкой ионной силе и при значениях рН на 0.5 ед. выше изоэлектрической точки стабилизирующего вещества. При этом рН исходного золя золота находится в интервале 6.1-3.2 в зависимости от размеров частиц или, точнее говоря, в зависимости от количества цитрата натрия, добавляемого при синтезе. Для каждой новой пары зонд-метка условия стабилизации маркера обычно подбираются экспериментально. Минимальное защитное количество стабилизирующего вещества и значение рН мы определяли в U-образных иммунологических планшетах с лунками объемом 200 мкл. Для этой цели делали серию последовательных разведений зонда соответствующим буфером или бидистиллированной водой. Золь титровали с шагом 0.5 ед. рН фосфорной кислотой или поташом, чтобы затем перед конъюгацией его с конкретным белком доводить значения рН золя до оптимального. В тех лунках, где условия инкубационной среды не были оптимальными по значению рН или золотому числу, происходила агрегация частиц золя после добавления к нему 20 мкл 10% .NaCl. Агрегация сопровождалась изменением цвета золя с красного на голубой или серый.
Сравнение экспериментальных спектров с модельными теоретическими расчетами
Для моделирования процесса агрегации нами использовалась трехмерная решеточная модель кластер-кластерной агрегации с броуновскими траекториями одиночных частиц и промежуточных кластеров [130]. В начальный момент в случайно выбираемых узлах кубической решетки размером L генерировалось NQ частиц. При перемещении частицы или кластера на один случайно выбираемый шаг решетки и наличии контакта с другой частицей или кластером образуется объединенный кластер. Эта модель соответствует диффузионно-ограниченному механизму агрегации, т.е. быстрой агрегации и дает фрактальную размерность агрегатов около 1.8 [130]. На рисунке 3.7 приведены теоретические спектры поглощения для 5, 15 и 30-нанометровых золотых частиц для модели быстрой агрегации (описана выше) рассчитанные по методу связанных диполей, который основан на аппроксимации частиц дискретными взаимодействующими диполями "discrete dipole approximation" (DDA). Основная физическая аппроксимация DDA заключается в замене реального агрегата совокупностью дискретных диполей с дипольными моментами. Оптические свойства каждой частицы моделировались в дипольном приближении, а взаимодействие частиц учитывалось в терминах ренормализационной DDA модели [30].
Поскольку нас не интересовала кинетическая зависимость спектров сама по себе, то мы использовали более простой прием для исследования зависимости спектров от степени агрегации золя. В качестве условной единицы времени нами использовался момент образования 10 новых кластеров в системе. В каждый такой момент определялась функция распределения кластеров по размерам, и вычислялся соответствующий СП. Моделирование проводилось на решетке размером L = 46, число исходных мономеров N0 = 500, так что плотность мономеров р = N0 І І) « 0.005. Генерация обрывалась после того, как в системе образовывался кластер с размером частиц N = 200. Все теоретические спектры в данной работе нормировались на значение оптической плотности мономеров в максимуме ослабления ( А. = Хтях).
Следует отметить, что в случае суспензий поглощающих веществ и в особенности металлов, аппроксимация реальных частиц диполями не учитывает сильной неоднородности поля в области контакта мономеров [131], что приводит к неадекватному описанию оптических свойств агрегата. В настоящее время разработаны более строгие теоретические модели для описания оптических свойств агрегатов из металлических частиц [15].
В работе [30] была предложена модифицированная версия метода, суть которой заключается в замене реального расстояния d = 2Rm между узлами решетки (т.е. контактирующими частицами) уменьшенным расстоянием dL = yRm, где параметр пересечения у =Щп7ъ = 1.612. В данной работе мы использовали у как подгоночный параметр теории, дающий качественное согласие с экспериментом (аналогичная процедура использовалась в работе [129]). Сравнение теоретических и экспериментальных СП (рис. 3.7а, Ь, си 3.1b-3.3b) показывает, что в рамках теории связанных диполей с модельным параметром пересечения (у) действительно подтверждается зарегистрированное различие в спектрах поглощения диффузионно-ограниченных фрактальных агрегатов с малыми (5нм) и более крупными (15, 30 нм) частицами. В первом случае теоретические спектры существенно уширяются, но вторичный пик поглощения четко не проявляется, то есть экспериментальный результат находится в качественном согласии с теоретическим расчетом. Для более крупных мономеров расчеты предсказывают появление второго пика поглощения в красной области, а сама сложная временная динамика спектров во многом напоминает экспериментальные регистрации спектров. Были выполнены также расчеты теоретических спектров при большем числе первичных частиц (N0 = 1000) на решетке L = 58, т.е. примерно при той же концентрации исходных мономеров р» 0.005. Результаты были аналогичны представленным на рис. 3.7.
В нашем распоряжении не было компьютерной модели для медленной реакционно-ограниченной агрегации, поэтому мы не могли провести аналогичных расчетов для сравнения с графиками на рисунках 3.1а-3.3а. Однако, учитывая данные [102], мы исследовали зависимость спектров поглощения в условиях быстрой агрегации от значения параметра пересечения и нашли, что значения у -2, соответствующие реальному физическому контакту частиц, дают однополосные спектры поглощения. Например, на рисунке 3.8 приведены теоретические спектры агрегированных 15 и 30-нанометровых частиц, которые показывают, что в отличие от экспериментальных спектров, теоретический пик поглощения агрегатов заметно смещается в красную область, а его величина для образцов с мономерами 5 (данные не представлены) и 15 нм растет, а не уменьшается в процессе агрегации. Наибольшие трудности в строгой теоретической интерпретации СП агрегатов из металлических наночастиц связаны с решением системы уравнений для коэффициентов мультипольного разложения. Эти коэффициенты описывают оптическое взаимодействие частиц в кластере за счет их многократного переоблучения, которое является исключительно сильным для металлических контактирующих частиц. В последнее время [15] достигнут существенный прогресс в решении указанных проблем.
Спектры поглощения и статического рассеяния при биоспецифической агрегации в системе (КЗ + Protein A) + IgG
Нами были проведены исследования спектральных изменений агрегирующих золей КЗ, когда процесс агрегации инициировался взаимодействием между собой специфической пары биополимеров, один из которых адсорбирован на частицах золя. На рисунках 4.4 и 4.5 приведены примеры кинетических изменений СП и ССРС золей КЗ в процессе их биоспецифической агрегации. В качестве модельных систем были взяты конъюгаты КЗ-15 и КЗ-30 с белком Protein А (КЗ-15 + Рг. А и КЗ-30 + Рг. А) и моноспецифической сывороткой (анти IgG человека) полученной из крови кроликов гипериммунизированиых иммуноглобулином G сыворотки человека (IgG человека) иначе говоря с IgG кролика полученными в ответ на его иммунизацию IgG человека. Молекула белка Рг. А имеет два или более сайтов для специфического взаимодействия с Fc-фрагментом молекул IgG нескольких типов [138]. О биоспецифическом взаимодействии молекул Рг. А, адсорбированных на поверхности нанометровых частиц КЗ, с молекулами анти IgG человека судили по кинетическим изменениям спектров поглощения и рассеяния данных систем. На рисунках 4.4 и 4.5 показана биоспецифическая агрегация конъюгата КЗ с Рг. А после добавки анти IgG человека в количестве примерно в 1.5-2 раза большем, чем его нужно для эквимолярного соотношения по сайтам связывания с Рг. А. Конечная концентрация добавленного анти IgG человека в системе составила 48 мкг/мл. Концентрация Рг. А составила 5 и 8 мкг в расчете па 1мл его конъюгата с золем КЗ-15 и КЗ-30 соответственно, что примерно отвечает его "золотому числу" для данных золей.
Когда добавляемого анти IgG человека было значительно меньше или больше относительно его эквимолярного количества по сайтам связывания с Рг. А, спектральные изменения систем происходили гораздо медленнее и были незначительны.
Следует отметить, что существенный концентрационный недостаток анти IgG человека для его связывания с адсорбированным на частицах золота Рг. А, как правило, меньше сказывался на величине спектральных изменений у данных агрегирующих систем, нежели его многократный избыток. В последнем случае добавление значительного избытка анти IgG человека не приводило к дестабилизации золя. Возможно, это было связано с образованием дополнительного полимерного слоя иммуноглобулинов.
Сравнивая изменения спектров поглощения при биоспецифической агрегации золей КЗ с агрегацией аналогичных золей для случая их неспецифической агрегации (КЗ с Tween-20 и добавка ЧСА, рис. 4.3а, Ь), можно заметить два основных отличия. Во-первых, отсутствует сильное смещение максимумов экстинкции в красную область. Во-вторых, величина максимума СП может повышаться на начальных этапах агрегации относительно своего исходного положения, затем постепенно возвращается к исходному значению и только через 30 мин и более начинает заметно убывать, или сразу уменьшаться относительно своего исходного значения (рис. 4.5а, Ь). Данный факт может быть обусловлен различием в размерах агрегатов, формирующихся в начале процесса биоспецифической агрегации золей КЗ. В случае неспецифической агрегации максимум СП всегда сразу же снижается относительно своего начального значения или его кратковременное повышение мы не могли зафиксировать.
Изменения ССРС при биоспецифической агрегации золей КЗ (кривые с прозрачными значками на рис. 4.4а, Ь) тоже отличаются от случая неспецифической агрегации данных золей (рис. 4.3а, Ь). Основное отличие заключается в отсутствии существенного сдвига плазмонного резонанса рассеяния и его менее выраженном росте при биоспецифической агрегации от своего исходного значения. Например (рис. 4.3а), зафиксированное нами отношение высоты самого высокого резонансного пика рассеяния света системой после смешения ее компонентов к высоте максимума исходной системы (золь КЗ +
Tween-20, штрих пунктирная кривая) равно 45, в то время как аналогичное максимальное отношение для пиков этих кривых на рис. 4.4а достигает только 20. Кроме того, рост и уменьшение резонансного рассеяния при биоспецифической агрегации с течением времени происходит гораздо медленнее, чем в случае неспецифической агрегации золей КЗ с тем же размером частиц. Нами не было зафиксировано существенного относительного увеличения (на порядок или более, а только в 2 - 3 раза) максимума ССРС от своих исходных значений при биоспецифической агрегации конъюгата золя КЗ-30 с с Рг. А (рис. 4.4Ь). Скорость спектральных изменений агрегирующей системы в данном случае была значительно ниже, чем при биоспецифической агрегации конъюгата золя КЗ-15 с Рг. А (рис. 4.4а). Это экспериментальное наблюдение имеет значение для сопоставления с теоретическими расчетами [139], которые не предсказывают отличий в ССРС 15 и 30 нанометровых частиц. Причины расхождений эксперимента и теории пока не ясны.
В экспериментах по биоспецифической агрегации частиц золя КЗ-60 (рис. 4.6) мы не наблюдали сильных изменений ни в СП, ни в ССРС. Частицы этого золя были конъюгированы с анти IgG человека и к полученному конъюгату добавлялся Рг. А. Конъюгат этого золя с Рг. А не использовался, так как Рг. Л не защищал данный золь от солевой агрегации, при определении его "золотого числа". Ранее для золя КЗ-15 нами был проведен ряд экспериментов, когда на частицах золя был адсорбирован анти IgG человека, а Рг. А добавлялся к конъюгату в свободном состоянии (водном растворе), а так же когда с данным золем были приготовлены конъюгаты с анти IgG человека и с Рг. А. В последнем случае для биоспецифического взаимодействия этой пары белков оба конъюгата с КЗ смешивались в равных объемах. Результаты исследований показали, что взаимодействие данной белковой пары, когда оба белка конъюгированы с частицами золя, незначительно отличается по характеру изменения спектральных кривых поглощения от подобной агрегации, когда с золем конъюгирован только один из белков, а второй добавляется в свободном виде, при условии, что концентрации взаимодействующих белков не очень далеки от их эквимолярных соотношений.
Исследованные нами биоконъюгаты не имели строго детерминированного межчастичного расстояния, но для понимания оптических свойств наших объектов решающим обстоятельством является то, что золотые частицы кластера не находятся в непосредственном контакте, а разделены тонкой диэлектрической прослойкой биополимеров. Отсутствие непосредственного контакта между золотыми частицами при биоспецифической агрегации золей КЗ подтверждено прямыми ЭМ исследованиями, представленными в нашей работе [135].
