Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 7
1.1. Иммобилизованные ферменты 7
1.2. Роль диффузии в катализе иммобилизованными ферментами 17
1.3. Уреаза и ее использование в аналитической химии 32
1.4. Кинетика иммобилизации ферментов 45
2. Материалы и методы 53
2.1. Синтез носителей для иммобилизации ферментов 53
2.2. Иммобилизация уреазы и исследование ее свойств . 57
2.3. Получение пористых кремнеземов с различным средним диаметром частиц 59
2.4. Исследование кинетики иммобилизации ферментов на поверхности пористых неорганических носителей при постоянной концентрации белка в растворе 59
2.5. Изучение кинетики иммобилизации белков при изменяю-щейся в ходе эксперимента концентрации последних 63
2.6. Определение скорости гидролиза мочевины растворимой и иммобилизованной уреазой 65
2.7. Определение концентрации мочевины при помощи иммобилизованной на силохроме уреазы 66
2.8. Исследование стабильности ферментного электрода 70
3. рН-зависимость процесса иммобилизации 73
4. Уреаза из staphylococcus saprophyticus L-1 , 81
4.1. Некоторые свойства нативного фермента 81
4.2. Иммобилизованная уреаза и ее свойства 85
4.3. Использование иммобилизованной уреазы для опре.деления концентрации мочевины 97
5. Кинетика иммобилизации ферментов 101
5.1. Исследование лимитирующей стадии процесса иммобилизации 101
5.2. Математическое описание кинетики иммобилизации ферментов на поверхности пористых неорганических матриц 105
5.3. Влияние среднего диаметра пор и удельной поверхности носителей на кинетику иммобилизации ферментов 133
Выводы 133
- Роль диффузии в катализе иммобилизованными ферментами
- Кинетика иммобилизации ферментов
- Исследование кинетики иммобилизации ферментов на поверхности пористых неорганических носителей при постоянной концентрации белка в растворе
- Иммобилизованная уреаза и ее свойства
Роль диффузии в катализе иммобилизованными ферментами
Нативные ферменты работают в однофазных системах. Исключения из этого правила немногочисленны. Ими являются биокатализаторы, субстраты которых нерастворимы в воде, например, липаза, колла-геназа, целлюлаза и др. Эти энзимы работают в двухфазных системах. Кроме поперечно сшитых ферментов, которые в данной работе не рассматриваются, катализ иммобилизованными ферментами всегда осуществляется в двухфазной системе, причем сам белок тем или иным образом фиксирован на поверхности твердой фазы. Для протекания ферментативной реакции молекулы субстрата должны транспортироваться к ферменту. Массоперенос, как известно, осуществляется за счет двух различных процессов - турбулентной и молекулярной диффузии. При интенсивном перемешивании вклад молекулярной диффузии в массоперенос незначителен, поэтому им обычно пренебрегают /61, с. 128/. Однако, когда жидкость движется около границы раздела фаз, ее локальная скорость у поверхности приближается к нулю. Поэтому массоперенос субстрата к каталитически активной поверхности осуществляется исключительно за счет молекулярной диффузии. Толщина гидродинамического пограничного слоя обычно составляет Ю"3 - КГ5 см /62, с. 107/. Однако следует отметить, что это эффективная величина, поскольку резкой границы между перемешиваемой и неперемешиваемой жидкостью не существует /61, с. 173/. Толщина этой неподвижной пленки такова, что позволяет объяснять экспериментально наблюдаемое сопротивление массопереносу. Необходимым условием осуществления диффузионного потока вещества является наличие градиента его концентрации. Уже этот факт подразумевает то, что концентрация субстрата в свободном объеме больше, чем у каталитически активной поверхности. При использовании пористых носителей протекание ферментативной реакции требует проникновения субстрата в поры матрицы. Очевидно, что поток субстрата также осуществляется только диффузионно.Вследствие этого концентрация субстрата на периферии и центре частицы носителя также будут неодинаковыми. Итак, фиксированный на твердой поверхности фермент всегда будет контактировать с субстратом, концентрация которого меньше, чем в растворе. Это - основное отличие реакций, катализируемых иммобилизованным и нативным ферментами с точки зрения кинетики.
Рассмотрим существующие в литературе качественные и количественные оценки влияния диффузии на свойства иммобилизованных ферментов и некоторые экспериментальные работы, подтверждающие их. 1.2.I. Внешнедиффузионное сопротивление. Согласно первому закону Фика, диффузионный поток субстрата из раствора к каталитически активной поверхности описывается уравнением ;=f (Юр-ад (і) где у - диффузионный поток вещества, М/см с; J) - его коэффициент диффузии, см2/с; (Г- толщина гидродинамического пограничного слоя, см; Мр7йп - концентрация субстрата в свободном растворе и возле каталитически активной поверхности соответственно. 1) Отношение - - называют коэффициентом массопереноса А , см/с /31, с. 27/. В стационарных условиях скорость диффузионного транспорта субстрата равна скорости его превращения каталитически активной поверхностью /(LsJP-[s]n)-%5Jn) (г) где V([sj\ " К0НКРетный вил- зависимости скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата. Для ферментов,кинетика действия которых описывается уравнением Михаэлиса-Ментен, уравнение (2) приобретает такой вид: -[3]")= Km+[S]„ (3) Если Es]n [s]p , то реакция контролируется внешней диффузией, а наблюдаемая скорость меньше окорости реакции, катализируемой тем же количеством нативного фермента. Если [sjn [s] , то иммобилизованный фермент работает в кинетической области, и диффузия существенно не сказывается на наблюдаемой скорости реакции. Из уравнения (3) следует, что для перевода работы фиксированного на поверхности фермента из диффузионной области в кинетическую необходимо: 1) уменьшение активности иммобилизованного фермента; 2) повышение концентрации субстрата вблизи поверхности до величины, обеспечивающей нулевой порядок реакции по субстрату; 3) увеличение коэффициента массопереноса.Для этого необходимо, уменьшить толщину гидродинамического пограничного слоя, что возможно при увеличении скорости потока жидкости относительно частиц носителя, поскольку между этими двумя величинами существует соотношение /31, с. 27/. -w 4) где U - скорость потока жидкости, л - константа, равная 1/3 для сферических частиц или для потока жидкости внутри цилиндра. Практическое использование уравнения (2) требует знания коэф- фициента массопереноса f . Известны расчетные и экспериментальные методы его определения, В настоящее время точный расчет толщины диффузного слоя известен только для вращающегося диска и ламинарного движения жидкости /61, с. 55/. Минимальное значение коэффициента массопереноса можно рассчитать по уравнению /63, с. 31/ е- Nul) (Ъ 2R (5) где R - радиус частицы носителя, Nu - число Нуссельта. При малых числах Рейнольдса (для ламинарного потока жидкости) Ми - 2 /63, с. 42/. Для препаратов иммобилизованных ферментов толщину диффузного слоя можно определить и экспериментально, изучив кинетику их действия и обработав полученные результаты в координатах Лайнуивера-Берка.
В диффузионной области зависимость скорости реакции от концентрации субстрата в этих координатах линейна и проходит через начало координат. Тангенс угла наклона &/равен /62, с. 115/ Обратим внимание на то, что входящая в уравнение (6) va определяется довольно точно, а определяемая с большой ошибкой кт не входит. Заслуживает внимания работа /64/, авторы которой предложили интересный метод экспериментального определения Кщ и \ , не осложненных внешней диффузией, а также коэффициента массопереноса на основании данных о кинетике действия иммобилизованного препарата. Из уравнения (I) можно рассчитать также верхний предел активности фермента, иммобилизованного на данном носителе. Вслед за авторами монографии /ЗІ, с. 23/ покажем, как это сделать. Максимальное значение скорости массопереноса, как следует из уравнения (I), должно наблюдаться при Мп- - о . Тогда jmax= Q [$Ъ 1.2.2. ШутрвдиФФузионное сопротивление. Скорость поступления субстрата в частицы носителя описывается уравнением /62, с. 126/ дх [ дх х дх ) (8) где п = О, I, 2 для мембраны, цилиндра и сферы соответственно; X - координата толщины мембраны или радиуса стержня или сферы; Эг - коэффициент диффузии субстрата в частице носителя. По аналогии с уравнением (2) для гетерогенной ферментативной реакции в случав равномерного распределения энзима по всему объему частицы носителя можно записать следующее соотношение: Решение уравнения (9) позволяет рассчитать концентрационный профиль субстрата по радиусу сферы, цилиндра или толщине мембраны и такую важную величину, как фактор эффективности. Последний представляет собой отношение измеренной экспериментально скорости гетерогенной ферментативной реакции к той скорости, которая имела бы место, если бы концентрация субстрата в любой точке частицы носителя была бы одинаковой и равной таковой в свободном растворе. Если кинетика ферментативной реакции описывается уравнением Михаэлиса-Ментен, то уравнение (9) приобретает следующий вид: 7, (?Ш.п ЭГ37)_ UnlSJ ,10) В аналитическом виде уравнение (10) решено для носителей как с пластинчатой /65/, так и со сферической /66/ формой частиц, для ферментативной реакции, имеющей 1-й порядок по субстрату, т.е. Мг/ ка . Если же она характеризуется дробным порядком, т.е. [sj , , то уравнение (10) аналитического решения не имеет. В этом случае концентрационные профили субстрата и фактор эффективности рассчитывают численным интегрированием соответствующего уравнения на ЭВМ. Существуют,однако, способы приближенного решения уравнения (10), которые приведены в работе /67/. Ее авторы предлагают уравнение для расчета фактора эффективности гетерогенного ферментного препарата, имеющего любую форму частиц, и при любых концентрациях субстрата:
Кинетика иммобилизации ферментов
Кинетика связывания белков с нерастворимыми матрицами - мало изученная область науки об иммобилизованных ферментах. Для связывания энзимов с носителями выбираются произвольные времена иммобилизации, причем выбор этот не обусловлен какими-либо теоретическими предпосылками. Вместе с тем,не известно даже, какие факторы влияют на время окончания процесса иммобилизации. Поэтому исследование кинетики этого процесса - задача важная и актуальная. В истории изучения кинетики иммобилизации условно можно выделить три основных этапа. На первом из них, начиная с 60-х годов, в отдельных работах изучалась кинетика связывания некоторых ферментов с определенными носителями /12, 19, 45, 99, 106, 184 -190/. К сожалению,никаких обобщающих выводов из этих работ авторами сделано не было. Полученные данные использовались для обоснования времени.необходимого для получения конкретного препарата иммобилизованного фермента. Из работ того времени можно сделать единственный вывод: время окончания процесса иммобилизации колеблется в весьма значительных пределах - от нескольких минут до нескольких суток. На втором этапе, начиная с середины 70-х годов,был предложен ряд эмпирических уравнений, описывающих кинетические кривые иммобилизации ферментов. Так, в работе /191/ предложено следующее уравнение: где a - величина иммобилизации за время і ; #«»- равновесная величина связывания белка; Ь - константа. Кинетическая кривая связывания ферментов с пористыми неорганическими носителями также описывается уравнением скорости реакции первого порядка /48/ ln(Ct-Cj) = tnC„-kt (16) где L- концентрация белка в растворе после завершения процесса иммобилизации; Q. - концентрация фермента в растворе во время t ; k - константа скорости реакции первого порядка. Показано, что экспериментальные данные по кинетике иммобилизации трипсина на активированных кремнеземах вполне удовлетворительно спрямляются в координатах уравнения (16). В работе /192/ предложено еще одно эмпирическое уравнение кинетики адсорбции белков: -Z,=nn+ntat (17) Приведенные уравнения не описывают начальный участок кинетической кривой, а уравнение (17) - и конечный, при степенях заполне-ния поверхности носителяT lz » превышающих 0,9. Уравнения (15) и (16) при наличии фрагмента кинетической кривой при средних степенях заполнения носителя позволяют рассчитать величину максимального связывания белка и время, за которое будет достигнута желаемая степень заполнения носителя.
Уравнение (17) было предложено для расчета времени окончания сорбции белка. Для этого автор /192/ предлагает рассчитать величину а«, и обработать экспериментальные данные в координатах XlZ » Щ Эту зависимость следует экстраполировать до -i и, таким образом, получить минимально необходимое время для завершения процесса сорбции. Величину а автор /192/ рассчитывал, исходя из величины удельной поверхности адсорбента и размеров молекулы белка. Предполагалось, что при содержании белка в растворе больше емкости монослоя а соответствует моносдойному заполнению поверхности носителя, а при содержании белка в растворе меньше количества, необходимого для создания мономолекулярного слоя, О. , равно количеству всего взятого белка. Проанализируем случай, когда экспериментатор работает с насыщающими концентрациями белков и монослой на поверхности носителей действительно образуется. Удельную поверхность (s _)носителей определяют, как правило, по адсорбции таких низкомолекулярных веществ, как азот, криптон, вода, метанол, бензол. Однако, отметим, что величина посадочной площадки чаще всего применяемого адсорба- та - азота - для адсорбентов различной химической природы прини- о мается от 15,4 до 20 А. К тому же s адсорбентов по разным адсор- батам часто существенно отличаются. Так, удельная поверхность пористого стекла, определенная по адсорбции азота, почти в два раза больше, чем при определении по адсорбции бензола /193/. Поэтому эффективная площадь поверхности адсорбента с хорошо развитой поверхностью - величина, зависящая от размеров молекулы адсорба-та. К тому же, молекулы перечисленных выше адсорбатов значительно меньше молекул белков. Вследствие этого некоторые микропоры поверхности носителей, которые доступны для этих адсорбатов, и . вносят определенный вклад в величину удельной поверхности адсорбентов, по стерическим соображениям могут быть недоступными для молекул белков, и рассчитанная таким образом емкость монослоя будет завышена.
Так, в работе /19/ показано, что доступная для молекул трипсина площадь поверхности магнетита составляет всего 20% таковой, определенной по адсорбции криптона, а рассчитанная емкость монослоя в 5 раз превышает экспериментально полученное значение. Авторы работы /16/ исследовали изотерму иммобилизации химотрипсина на поверхности активированного угля. Максимальная величина связывания, которую удалось достичь на носителях, обработанных различными способами, составляла несколько десятков миллиграмм фермента на I г матрицы. Монослойное заполнение, рассчитанное исходя из удельной поверхности носителей и размеров молекулы фермента, составляло 943 мг/г. В этом случае расчетная величина а с более, чем на порядок превышала экспериментальное значение. Если содержание белка в растворе меньше количества, необходимого для формирования монослоя, то полная сорбция достигается, по-видимому, далеко не всегда. Действительно, рядом авторов показано, что изотерма иммобилизации белков напоминает по форме лэнг-мюровскую /13, 105, III, 126, 184, 190/. Поэтому в растворе всегда присутствует несвязавшийся фермент, и рассчитанное значение а в этом случав также будет завышенным по сравнению с экспериментальным. Таким образом, расчет а по величинам удельной поверхности адсорбента и посадочной площадки юлекулы фермента может привести к завышенным значениям по сравнению с экспериментально полученными величинами и, тем самым, к завышенным расчетным временам достижения адсорбционного равновесия. Этим, по-видимому, можно объяснить такие времена иммобилизации, как I05 суток, сообщаемые в работе /192/ Для адсорбции щелочной фосфатазы на карбохроме. Уравнения (15), (16) и (17) вполне удовлетворительно описывают кинетические кривые иммобилизации ферментов, но физический смысл входящих в них констант не понятен, поэтому приведенные выше уравнения не позволяют предсказать кинетику связывания белка с матрицами, отличающимися от исследованных. На третьем этапе, начиная с 80-х годов, в литературе появились работы, авторы которых предпринимают попытки при определенных допущениях вывести уравнение кинетики иммобилизации ферментов. В работе /194/ приводится ряд кинетических схем:
Исследование кинетики иммобилизации ферментов на поверхности пористых неорганических носителей при постоянной концентрации белка в растворе
После активации поверхности кремнеземов по одной из приведенных выше методик последний высушивали и рассеивали ситами на ряд фракций. Средний размер каждой фракции представляли как среднее арифметическое диаметров не меньше 70 частиц, измеренных при помощи микроскопа МБС-9. Для проведения исследований по теме настоящей диссертации нами было сконструировано несколько установок и приспособлений, конструкция и принцип действия которых описан ниже. 2.4. Исследование кинетики иммобилизации ферментов на поверхности пористых неорганических носителей при постоянной концентрации белка в растворе Исследование кинетики адсорбции из газовой фазы при постоянном давлении адсорбата осуществляется довольно давно. Для этой цели предложены и описаны в литературе конструкции соответствующих установок /195, с. 24 - 29/. Такие установки, однако, неприменимы для исследования аналогичных процессов из жидкой фазы, поскольку регистрация величины адсорбции осуществляется, в основном, гравиметрически, как правило, при помощи кварцевых пружинных весов Мак Бена. Изучение подобных процессов из жидкой фазы ставит перед исследователем определенные технические трудности. Без применения каких-либо технических средств для решения подобной задачи экспериментатор вынужден, проинкубировав адсорбент с большим избытком адсорбата в течение определенного времени, отмыть образец от несвязанного вещества и при помощи тех или иных методов определить величину адсорбции. Помимо неизбежно вносимых при анализе ошибок, кинетическая кривая будет строится по точкам, что также не способствует повышению точности кинетической кривой. В числе возможных источников ошибок следует отметить возможность частичной десорбции адсорбированного вещества в процессе отмывки образца от раствора адсорбата, находящегося в порах адсорбента. Конструкции установок для изучения кинетики адсорбции из жидкой фазы при постоянной концентрации адсорбата в растворе в доступной нам литературе не приведены. Нами впервые была сконструирована такая установка /246/. Ее блок-схема приведена на рис. 4. В кварцевую кювету I вносили определенный объем раствора белка. Поршневой насос 2 обеспечивал циркуляцию последнего через теплообменник 3 и колонку с носителем 4, термостатируемых в емкости 5. Оптическую плотность раствора в кювете при 280 нм измеряли при помощи спектрофотометра «Specord UV-Vis" (ГДР), обладающим вполне удовлетворительной стабильностью показаний.
Для того, чтобы получить с его выхода напряжение, которое изменялось бы с изменением оптической плотности, мы воспользовались выходным реохордом вышеупомянутого прибора, который изме- Эта установка описана также в рационализаторском предложении № 2/83 от 14.03.83 г., выданном Г.В.Любинскому и В.В.Янишпольско-му и принятом к использованию в Институте физической химии им. Л.В.Писаржевского АН УССР. няет свое сопротивление от 0 до I кОм при изменении поглощения от 0 до 100$. На него со стабилизатора 6 подавалось напряжение 38 В. Снимаемая с реохорда ЭДС, пропорциональная показаниям прибора, подавалась через делитель 8 и рН-метр 9 на вход блока автоматического титрования 10. На последнем задавали точку титрования в соответствии с поглощением раствора белка той концентрации, при которой исследовалась кинетика иммобилизации. Как только в результате иммобилизации концентрация фермента в кювете I уменьшается, падает напряжение, подаваемое с выхода спектрофотометра 7 через делитель 8 и рН-метр 9 на вход блока автоматического титрования 10. От появляющейся на выходе блока автоматического титрования ЭДС срабатывает электромагнитное реле II, замыкающее цепь питания реверсивного двигателя РД-09 12. Вращение двигателя 12 через шестерни 13 передается на вал с резьбой 14, который при помощи подшипниковых узлов 15 крепится к верхней и нижней пластинам 16 и при вращении перемещает вверх столик 17. Перемещаясь по четырем направляющим 18, столик 17 выдавливает из шприца 19 более концентрированный раствор белка, который через капилляр 20 поступает в кювету I до тех пор, пока концентрация фермента в растворе не достигает первоначального значения. Вал 14 через червячную передачу (на схеме не показана) связаны с пером самописца типа ЭПП, в котором снят двигатель, перемещающий перо, а работает только лентопротяжный механизм. Таким образом, при уменьшении концентрации белка в растворе установка позволяет автоматически осуществлять добавление более концентрированного раствора фермента до достижения исходной его концентрации. Необходимый для этого объем раствора записывается на диаграммной ленте самописца. Определив зависимость объема жидкости, выдавленной из шприца 19, от показаний пера самописца, нетрудно подсчитать величину связывания белка в данное время. Концентрация белка в ходе эксперимента колеблется в незначительных пределах» В этом нетрудно убедиться, записав на диаграммной ленте самописца спектрофотометра зависимость оптической плотности раствора белка от времени. Необходимо отметить, что, применяя другие датчики в качестве нуль-индикатора, можно изучать кинетику адсорбции других веществ при постоянной их концентрации в растворе. Например, используя ион-селективные электроды и заправляя шприц более концентрированным раствором соли данного иона, можно изучать кинетику ионного обмена при постоянной концентрации данного иона в растворе. 2.5. Изучение кинетики иммобилизации белков при изменяющейся в ходе эксперимента концентрации последних Кинетику иммобилизации трипсина исследовали при помощи установки, блок-схема которой приведена на рис. 5. В кварцевую кювету I вносили 2,5 мл раствора фермента.
Поршневой насос 2 обеспечивал циркуляцию этого раствора со скоростью 4,5 мл/мин через теплообменник 3 и колонку (внутренний диаметр 4 мм) с носителем 4, тер-мостатируемых в емкости 5. О кинетике иммобилизации судили по изменению оптической плотности раствора при 280 нм во времени, которую ЗаПИСЫВаЛИ При ПОМОЩИ СПеКТрофОТОМетра Specord uv-vis (ГДР) 7. Поскольку при степенях заполнения носителей больше 0,5 - 0,7 скорость иммобилизации невелика и на диаграмме самого прибора линии сливаются, для записи мы использовали миллиамперметр КСУ-4, который подключили к выходному реохорду прибора через резистор 8. ЭДС на выходной реохорд оптического прибора подавали со стабилизатора 6. Кинетику иммобилизации уреазы исследовали аналогично, однако количество связавшегося фермента определяли, измеряя активность фермента, оставшегося в растворе к моменту измерения. Скорость гидролиза мочевины уреазой определяли методом рН-ста-та. Установка, смонтированная нами для этой цели (рН-стат), мало чем отличается от таковой для исследования кинетики иммобилизации белков при постоянной концентрации их в растворе (см. рис. 4). ЭДС на вход рН-метра подавалась с электродной пары (водородный электрод - электрод сравнения). Эта ЭДС, как известно, линейно связана с рН раствора. Если гидролиз мочевины протекает при рН меньшем 8,82 в слабо забуференном растворе, то рН его, как известно, повышается. Поэтому шприц заполняли 0,1 N или 2 N раствором соляной кислоты (в зависимости от величины измеряемой активности). Таким образом, рН-стат записывал расход титранта, необходимого для поддержания постоянного рН раствора во времени. Скорость гидролиза мочевины растворимой и иммобилизованной уреазой, определяли при 25С следующим образом: к 5 мл раствора мочевины добавляли 0,1 - 0,2 мл раствора фермента (или суспензии иммобилизованной на аэросиле уреазы) и при помощи рН-стата записывали количество соляной кислоты, необходимое для поддержания заданного рН. Скорость гидролиза мочевины уреазой, иммобилизованной на силохроме, определяли в безградиентном реакторе, аналогичном описанному в работе /202/. Объем раствора субстрата в ячейке - 10 мл. Циркуляция его через теплообменник и колонку с иммобилизованной уреазой обеспечивалась при помощи пеЭта установка описана в рационализаторском предложении № 41 от 21.12.81 г., выданном В.В.Янишпольскому и Г.В.Любинскому и принятом к использованию в Институте физической химии им. Л.В.Писар-жевского АН УССР. ристальтического насоса Ш-І со скоростью 10 мл/мин. Внутренний диаметр микроколонки составлял 4 мм. Активность (в международных единицах) рассчитывали по начальному участку кинетической кривой по формуле /140/:
Иммобилизованная уреаза и ее свойства
Исследование иммобилизации уреазы, выделенной из микроорганизма Staphylococcus saprophytics L-1, на аминосилохроме, активированном хлористым циануром, показало, что добавление в буфер, используемый для этого процесса, I мМ/л двунатриевой соли этилендиамин-тетраацетата (ЭДТА) повышает активность получаемого препарата в два раза /264/По-видимому, этот факт можно объяснить тем, что HagHKb, употрзбляемый для приготовления буфера, содержит примесь катионов тяжелых металлов. Действительно, использованная соль квалификации "чда" содержит около 0,001$ последних. Учитывая, что кон- Основные результаты изложены в работах /245, 248, 253, 254/. центрация На2НРО в буфере составляла 0,1 М, нетрудно подсчитать, что концентрация катионов тяжелых металлов имеет порядок 10" -Ю"6 М, а концентрация фермента - не более I0""9 М (для иммобилизации использовали раствор с концентрацией энзима I мг/мл; его молекулярная масса - около 250000 Д). Таким образом, концентрация катионов тяжелых металлов на два - три порядка превышает концентрацию фермента, а из литературы известно, что последний в значительной степени ингибируется такими катионами /138, 152 - 154/. Добавленный в буфер ЭДТА связывает катионы тяжелых металлов, что и приводит, по-видимому, к повышению активности получаемого препарата иммобилизованной уреазы. На основании ранее описанных результатов следует, что процесс иммобилизации уреазы из Staphylococcus saprophytics L-1 целесообразно проводить при рН 7 - 8 независимо от химии поверхности матрицы. Исследование кинетики иммобилизации уреазы показало, что время, в течение которого практически полностью заканчивается связывание этого фермента с силохромом С-80 (фракция 0,25 - 0,365 мм) также практически не зависит от свойств поверхности последнего и составляет 4 - 5 ч /248/. Растворитель представляет собой 0,1 М фосфатно-цитратный буфер, в котором растворен I м/л ЭДТА. Используя найденные нами оптимальные условия иммобилизации, был получен препарат уреазы из Staphylococcus saprophytics L-1 , связанный с поверхностью силохрома с помощью дисульфидных связей.35 Средний диаметр частиц матрицы составлял 0,222 мм; активность ге-терогенизированной уреазы - 112 ед/г. Изучение кинетики гидролиза мочевины этим препаратом показало, что экспериментальные данные не спрямляются в координатах , г у [S]Q , а образуют s Носитель - силохром С-80,модифицированный 7"-меркаптопропил-триметоксисиланом и активированный реактивом Эллмана. два линейных участка с точкой перегиба при [S]0 = 75 - 100 мМ.
Значение Км составляет 9,3 + 2,5 и 35,1 + 4,5 мМ при высоких и низких концентрациях субстрата соответственно /245/. Мы полагаем, что такой ход кривой вызван не изменением кинетических свойств фермента при иммобилизации, как считают авторы работы /178/, а обусловлен внутридиффузионным торможением по субстрату и продукту реакции. Для подтверждения этого предположения был получен препарат уреазы, иммобилизованной на непористом носителе -аэросиле A-I75, активированном аналогичным способом. Его активность составляла 277 ед/г. По формуле, приведенной в работе /70/: [6]Ц + [Кт Щ + JlSJn -ЩНт -0 (26) где [5]п - концентрация субстрата возле каталитически активной поверхности матрицы, М/сиг; [$]р - концентрация субстрата в свободном объеме, МУсиг; Цт - константа Михаэлиса гидролиза мочевины иммобилизованным препаратом, М/сьг; Vm - максимальная скорость гидролиза мочевины препаратом иммобилизованной уреазы, М/см2 с; & - толщина гидродинамического пограничного слоя жидкости, см; Э - коэффициент диффузии мочевины, см/с, мы рассчитали концентрацию субстрата возле каталитически активной поверхности препарата, полагая, что Км фермента при иммобилизации существенно не изменяется и равна 6 10" М/см; толщина гидродинами-ческого пограничного слоя - Ю см (верхний предел значений этой величины, приведенный в /62, с. Ю7Д а коэффициент диффузии мочевины при 25С равен 13,78« 10 CMVC /ЗІ, С. 45/. Оказалось,что Г CJ при [$]п = 0,5 мМ :Jp = 0,999, т.е. концентрация субстрата воз- Lojp ле каталитически активной поверхности практически равна таковой в свободном объеме даже при очень низких ее значениях. Таким образом, диффузионное торможение не должно искажать кинетику действия такого препарата. Изучение последней показало, что эксперименталь- [S] ные данные удовлетворительно спрямляются в координатах Лг j[S]n VQ в области концентраций субстрата 0,5 - 1000 мМ. Константа Михаэли-са гидролиза мочевины этим препаратом составляла 8,3 + 2,3 мМ /245/, что хорошо совпадает с ее значением для нативного фермента. Таким образом, изменение наблюдаемых кинетических свойств фермента, иммобилизованного на силохроме с помощью дисульфидных связей, вызвано диффузионным торможением по субстрату и продуктам реакции. Отметим, что кинетические свойства уреазы, иммобилизованной на непористых стеклянных шариках в отсутствие диффузионного торможения, также практически совпали с таковыми нативного фермента /86/. Аналогичного вида зависимость демонстрируют обработанные в координатах -1Г } [S]Q . экспериментальные данные по кинетике гид- "0 ролиза мочевины препаратом иммобилизованной на активированном хлористым циануром аминоорганосилохроме С-80 (фракция 0,25 - 0,365 мм) уреазы /253/. Значения Км составляют 3,1 + 0,3 и 21 + ЗмМ при низких и высоких концентрациях субстрата соответственно.
Как и в описанном выше случае, изменение наблюдаемых кинетических свойств иммобилизованного на силохроме фермента объясняется, по-видимому, диффузионным торможением, поскольку кинетика действия уреазы, иммобилизованной на активированной аналогично поверхности аэросила A-I75, вполне удовлетворительно спрямлялись в координатах l-oJo f Уо [S]0 в области концентрации субстрата 0,5 - 1000 Ш. Км этого препарата составляет 5,5+0,6 Ш, что также вполне удовлетворительно совпадает с таковой для растворимого фермента /253/, Следует обратить внимание, что при концентрации мочевины I М ее гидролиз иммобилизованной на силохроме уреазой протекает практически с максимальной скоростью (так как Км = 21 - 35 мМ, то нетрудно подсчитать, что скорость реакции равна 96 - 98% от vm ) и процессы диффузии субстрата мало влияют на активность гетерогени-зированного фермента. Поэтому представляется интересным исследовать рН-зависимость действия данного препарата при [5]0 = I М. Установлено, что последняя сильно отличается от рН-зависимости активности растворимого фермента (рис. 13, а, в). Если субстрат растворен в бидистилляте, то в интервале рН от 7 до 4,5 скорость реакции слабо зависит от концентрации протонов /253/. О существовании рН-зависи-мостей такого характера сообщается в работах /47, ПО/. Наличие плато на рН-зависимости иммобилизованной на силохроме уреазы можно было бы объяснить влиянием диффузии субстрата /98/. Однако, как следует из данных по изучению кинетики действия иммобилизованной на силохроме уреазы, при концентрации мочевины I Ми рН 7,0 диффузия последней не является лимитирующей стадией процесса. Таким образом, наличие плато, очевидно, можно объяснить лишь смещением рН раствора внутри пор носителя в результате образования продуктов гидролиза субстрата. Действительно, показано, что рН внутри пленки геля с иммобилизованной уреазой при гидролизе мочевины в безбуферной среде существенно выше, чем в свободном растворе /107, 108/. В работе /109/ рассчитаны рН-зависимости водонерас-творимых катализаторов в случае выделения в результате реакции протонов, наличия диффузионного торможения по последним и отсутствия его по субстрату. Было установлено, что при достижении относительно больших скоростей реакции концентрация протонов возле каталитически активной поверхности практически не зависит от таковой в растворе, и скорость превращения субстрата с участием такого препарата мало изменяется при изменении рН раствора. При рН, меньшем рН-оптимума, наблюдается совпадение рН-профилей растворимого и иммобилизованного фермента.
