Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 9
1.1. Особенности сорбции из многокомпонентных жидких растворов 9
1.2. Исследование сорбции из растворов методом жидкостной хроматографии 16
1.2.1. Модели удерживания в условиях ВЭЖХ 19
1.2.2. Влияние температуры на хроматографическое удерживание в ОФ ВЭЖХ 23
1.3. Установление взаимосвязи «структура – физико-химическое свойство – биологическая активность» 27
2. Экспериментальная часть 32
2.1. Объекты исследования 32
2.2. Особенности строения и физико-химические свойства азолов 34
2.3. Методы исследования 37
2.4. Методика эксперимента 39
2.5. Оценка вероятности проявления биологической активности молекул
2.6. Расчет физико-химических параметров молекул 48
2.7. Статистическая обработка результатов 49
3. Обсуждение результатов 51
3.1. Изучение особенностей сорбции азолов на неполярном сорбенте из водно-ацетонитрильных растворов 51
3.1.1. Взаимосвязь фактора удерживания с физико- химическими параметрами молекул исследуемых бензимидазолов 58
3.1.2. Зависимость удерживания исследуемых азольных производных бензойной кислоты от их физико-химических параметров 63
3.1.3. Взаимосвязь потенциальной биологической активности и хроматографического удерживания исследуемых бензимидазолов 68
3.2. Влияние состава подвижной фазы на хроматографическое удерживание исследуемых бензимидазолов 71
3.3. Исследование температурной зависимости факторов удерживания исследуемых бензимидазолов 74
3.4. ВЭЖХ исследование некоторых бензимидазолов с использованием амперометрического детектора
Заключение 100
Список литературы
- Исследование сорбции из растворов методом жидкостной хроматографии
- Влияние температуры на хроматографическое удерживание в ОФ ВЭЖХ
- Особенности строения и физико-химические свойства азолов
- Взаимосвязь фактора удерживания с физико- химическими параметрами молекул исследуемых бензимидазолов
Исследование сорбции из растворов методом жидкостной хроматографии
Одной из фундаментальных задач современной физической химии поверхностных явлений является исследование и теоретическое описание механизмов сорбции соединений различной природы из многокомпонентных жидких растворов на твердых поверхностях сорбентов. Решение этой задачи позволит развить теорию адсорбции, глубже проникнуть в механизмы взаимодействия сорбатов с сорбентом. Изучение сорбции биологически активных соединений, очевидно, имеет прикладной характер, так как оно позволит решить ряд важнейших практических задач экстрагирования этих веществ из многокомпонентных растворов, в том числе из биологических жидкостей. Например, для медицинских целей является важным исследование процессов, которые происходят на молекулярном уровне в физиологических жидкостях человека, так как изучение принципов динамики молекул в различных биологических структурах организма позволяет установить специфику различных заболеваний.
Сорбция из жидких растворов изучена значительно менее сорбции из парогазовой смеси. Это связано с тем, что процесс сорбции из жидких растворов значительно сложнее, так как помимо взаимодействия сорбента с растворенным веществом происходит сорбция молекул растворителя. Следует также учитывать при этом взаимодействие сорбата с растворителем. Механизмы сорбции из растворов объясняют, исходя из представлений, выведенных для газовой фазы. Эти представления дополняются или ограничиваются специфическими для жидкой фазы условиями.
В процессе сорбции из растворов молекулы компонентов раствора (сорбата) мигрируют из объема среды к поверхности твердого тела (сорбента) и переходят в его сорбционный слой. Адсорбированные молекулы мигрируют в этом слое, диффундируют в объем сорбента или десорбируются. В адсорбционном слое молекулы удерживаются за счет взаимодействия с поверхностью сорбента. Вследствие разной интенсивности взаимодействия молекул сорбата и воды с поверхностью сорбента, концентрация растворенного вещества в сорбционном слое повышается, а в растворе снижается. Энергия взаимодействия молекул сорбата с молекулами растворителя оказывает влияние на процесс сорбции [15]. Например, в водном растворе это энергия гидратации молекул, которая проявляется в растворимости вещества в воде. С увеличением растворимости вещества возрастает энергия гидратации молекул растворенного вещества, следовательно, молекулы сорбата испытывают большее противодействие при переходе на поверхность сорбента, поэтому вещество слабее адсорбируется из раствора.
Химическая природа и геометрия молекул сорбата, а также геометрия и химия поверхности сорбента влияют на взаимодействие молекул растворенного вещества и растворителя с сорбентом.
В процессе сорбции поверхность сорбента, непосредственно контактирующая с раствором, покрыта полностью молекулами компонентов раствора. Поэтому в образовавшемся сорбционном слое молекулы компонентов раствора перераспределяются в соответствии с их энергией взаимодействия с сорбентом. Чаще всего сорбция молекул растворенного вещества сопровождается десорбцией молекул растворителя с поверхности сорбента.
Схематически баланс энергетических взаимодействий, которые приводят к избирательной сорбции органического соединения из водного раствора, можно записать в виде следующего равенства [16]: где а.р. – энергия сорбции органического соединения из водного раствора; а. – энергия сорбционного взаимодействия молекул этого соединения в отсутствии молекул воды и других компонентов раствора; р – энергия взаимодействия молекул воды с сорбентом; в – энергия взаимодействия молекул сорбата с молекулами воды в растворе. Из уравнения(1.1) следует, что величина в в уравнении зависит только структуры молекул сорбата и воды, поэтому уменьшить ее возможно, создавая условия, при которых гидратация молекул сорбата была бы минимальна. Величины а и р зависят не только от структуры молекул компонентов раствора, но и от химического характера поверхности сорбента. Усилить избирательность сорбции веществ из раствора можно, добиваясь при выборе сорбента, соответствующего химического строения, увеличения разности а – р.
На энергию взаимодействия адсорбированных молекул с сорбентом большое влияние оказывает размер его пор. В соответствии с классификацией пористых структур активированных углей и других сорбентов Дубинина М.М., которая основана на теории капиллярных и адсорбционных явлений, можно выделить следующие типы пор: микропоры с эффективным радиусом 0.6-0.7 нм, супермикропоры, имеющие эффективным радиус от 0.6-0.7 до 1.5-1.6 нм, мезопоры (или переходные поры) с эффективным радиусом в пределах от 1.5—1.6 нм до 100-200 нм, и макропоры с эффективным радиусом, превышающий 100-200 нм [17 – 19]. В работе [20] рассмотрена классификация плоскощелевых микро- и мезопор активных углей по ширине, которая определена как расстояние между центрами углерода, расположенных на противолежащих стенках поры. В соответствии этой классификацией выделяют 5 групп пор: мезопоры шириной больше 1.36 нм, заполняемые за счет взаимодействия адсорбат -адсобент по механизму капиллярной конденсации; супермикропоры типа А с размерами от 1.28 до 1.36 нм, в которых заполнение обусловлено совместным действием притяжения адсорбат – адсобент и адсорбат – адсорбат; супермикропоры типа В с размерами от 0.91 до 1.28 нм, в которых непрерывное заполнение сменяется спонтанным заполнением узкой щели; ультрамикропоры типа А с размерами от 0.69 до 0.91нм, в которых происходит непрерывное заполнение, и ультрамикропробы типа В с размерами от 0.69 до 0.60 нм, заполняемые лишь при повышенных давлениях, при которых преодолеваются силы межмолекулярного отталкивания. Таким образом, радиус пор влияет на энергию взаимодействия адсорбированных молекул с атомами, ограничивающими полость сорбента. Чем меньше радиус, тем сильнее это взаимодействие, и, следовательно, в наибольшей степени выражено в узких микропорах. По мнению Когановского А.М. [16], это можно объяснить тем, что в узких микропорах происходит перекрывание полей действия дисперсионных сил противолежащих стенок поры. Вследствие чего, энергия дисперсионного взаимодействия с адсорбированной молекулы почти не зависит от ее местоположения в пространстве поры. Если диаметр поры не менее чем в два раза превышает ван-дер-ваальсовское сечение молекулы органического компонента, то в таких порах могут образовываться полимолекулярные слои органического компонента.
Влияние температуры на хроматографическое удерживание в ОФ ВЭЖХ
Для изучения сорбции бензимидазола и его производных использовали метод обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии. Расчеты физико-химических параметров молекул изучаемых соединений осуществляли с использованием программы HyperChem 7.0 Professional. С её помощью можно проводить неэмпирические и полуэмпирические квантово-химические расчеты. Среди полуэмпирических методов наибольший интерес представляют методы, с достаточной точностью предсказывающие некоторые свойства молекул: метод CNDO (Complete Neglect of Differential Overlap) в параметризации Фишера -Колльмара, Бойда - Уайтхеда, а также многоконфигурационный вариант метода CNDO Икера - Хинце, INDO (Intermediate Neglect of Differential Overlap) и его модификации MINDO / 2 и MINDO / 3. Современный метод MNDO (Modified Neglect of Diatomic Overlap), позволяет получить точные значения молекулярных характеристик, сравнимые с точностью их экспериментального определения [125].
Наиболее популярными полуэмпирическими методами являются АМ1 (Austin Model 1) и его последняя модификация РМ 3 (Parameter Model 3). Данные, рассчитанные с их помощью, в достаточной мере согласуются с экспериментальными. В рамках метода РМ 3 возможно производить расчеты с полной оптимизацией геометрии молекулы, а также вычислять полную энергию и теплоты образования, электронные структуры различных соединений.
В настоящей работе для всех исследуемых соединений были определены виды биологической активности и рассчитаны вероятности их проявления. Расчеты сделаны с использованием программы PASS С&Т (Prediction of Activity Spectra for Substances: Complex & Training) на основании структурной формулы соединений. В основе работы программы лежит анализ зависимостей «структура – активность» для соединений из обучающей выборки. В состав выборки входят более 45000 различных биологически активных соединений (фармакологически активные вещества и субстанции известных лекарственных препаратов) [126].
Для установления взаимосвязи фактора удерживания с физико химическими параметрами молекул исследованных соединений, а также для расчета термодинамических характеристик использовали линейный регрессионный анализ [127]. 2.4. Методика эксперимента Хроматографическое исследование азолов проводили в условиях обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии.
Изучение хроматографического поведения бензимидазолов проводили на микроколоночном жидкостном хроматографе «Милихром А-02» с применением УФ-спектрофотометрического детектора. Детектирование осуществляли при длинах волн 210 нм, 254 нм, 300 нм. Использовали хроматографическую колонку длиной 75 мм, внутренним диаметром 2 мм, заполненную сорбентом ProntoSil 120-5-С18 AQ. Размер зерен сорбента 5 мкм, масса сорбента 0,2 грамма. Удельная площадь поверхности сорбента составляла 300 м2 /г. Температуру колонки поддерживали с помощью твердотельного электрического термостата и варьировали в интервале от 308 до 348 K. Перед проведением хроматографического эксперимента колонку термостатировали и промывали элюентом в течение 15 минут. Элюирование осуществляли в изократическом режиме. В качестве подвижной фазы применяли смесь ацетонитрила с водой в различных объемных соотношениях (75/25, 65/35 и 50/50 % об.). При изменении состава подвижной фазы проводили регенерацию хроматографической колонки. Подвижную фазу перед проведением анализа дегазировали на установке марки УЗДН–2Т и отфильтровывали. Объемная скорость потока элюента составляла 50 мкл/мин. Сорбцию некоторых производных бензимидазола изучали на жидкостном хроматографе «Цвет Яуза» с применением амперометрического детектора. Использовали хроматографическую колонку длиной 150 мм, внутренним диаметром 4.6 мм, заполненную Zorbax SB-C18. Исследование проводили при составе подвижной фазы – ацетат аммония (0,05 М) : ацетонитрил : метанол в соотношении 50:45:5 % об. Элюирование проводили в изократическом режим. Напряжения рабочего электрода и электрода сравнения составляли 0.9 В и -0.2 В соответственно.
Изучение хроматографического поведения азольных производных бензойной кислоты проводили на жидкостном хроматографе «Миллихром-1» (г. Орел, Россия) со шприцевым насосом и с применением УФ -спектрофотометрического детектора. Детектирование осуществляли в диапазоне длин волн 190 - 360 нм. Использовали хроматографическую колонку Ultrasep ES 100RP18 (120х4мм), с размером частиц 4 мкм. Элюирование осуществляли в изократическом режиме. В качестве подвижной фазы применяли смесь ацетонитрила с водой в объемном соотношении - 15/85 % об.
Растворы исследуемых сорбатов готовили растворением сухих индивидуальных веществ в ацетонитриле. Объем вводимой пробы 1 - 2 мкл. Значение мертвого времени определяли по времени выхода системного пика. Обработку результатов эксперимента проводили с применением программ «МулътиХром» и «Zlab». На основании экспериментальных данных определены следующие хроматографические и термодинамические характеристики сорбции исследованных соединений:
Особенности строения и физико-химические свойства азолов
Показано, что для двухпараметрических корреляционных уравнений в целом коэффициенты детерминации выше, чем у однопараметрических. Замечено, что присутствие в двухпараметрических уравнениях в качестве независимого параметра дипольного момента приводит к увеличению коэффициента корреляции, что, в свою очередь, увеличивает прогнозирующую способность уравнений. Анализ трехпараметрических корреляционных уравнений показал, что добавление третьего параметра в двухпараметрические уравнения приводит к увеличению коэффициента детерминации, и для описания хроматографического удерживания исследуемых азолов наиболее значимыми параметрами являются молекулярная рефракция, дипольный момент и поляризуемость молекул сорбата (ур.1 табл. 3.6).
На основании полученных многопараметрических зависимостей были рассчитаны значения факторов удерживания для азольных производных бензойной кислоты. На рис. 3.10 представлена зависимость между теоретическими и экспериментальными значениями фактора удерживания.
Зависимость логарифма фактора удерживания, рассчитанного по ур. 1 табл. 3.6, от экспериментального логарифма фактора удерживания (состав подвижной фазы MeCN/H2O – 15/85 об.%). Представленная выше зависимость иллюстрирует хорошее совпадение экспериментальных и теоретических значений фактора удерживания, что позволяет прогнозировать сорбцию исследуемых и близких по строению азольных производных бензойной кислоты на октадецилсиликагеле из водно-ацетонитрильных растворов.
Взаимосвязь потенциальной биологической активности и хроматографического удерживания исследуемых бензимидазолов
Изучение взаимосвязи сорбционных характеристик бензимидазола и его производных с их потенциальной биологической активностью проводили с помощью регрессионной модели «биологическая активность – удерживание». На рис. 3.11 – 3.13 представлены корреляционные зависимости вероятности проявления биологической активности Pa от логарифма фактора удерживания.
МеCN/H2O – 50/50 % об., Т=350С). Из представленных рисунков видно, что с увеличением фактора удерживания сорбата склонность к проявлению биологической активности вида Transferase stimulant снижается, причем снижение достаточно высокое. Соединение 11 (1-(4-бензилоксибензил)бензимидазол) имеет вероятность проявлению биологической активности вида Transferase stimulant близкую к 65 %. Из входящих в выборку соединений это вещество обладает наибольшим значением логарифма коэффициента распределения в системе н-октанол-вода (lgP=4.47), то есть наименьшей гидрофильностью по сравнению с другими соединениями. Также установлено, что наименьшее отклонение от линейной зависимости характерно для модели «биологическая активность -удерживание» при составе подвижной фазы с 75%-ным содержанием ацетонитрила и при увеличении температуры ее прогнозирующая способность возрастает (рис. 3.14). Ра
Из рис. 3.14 видно, что зависимость значений, характеризующих вероятность проявлению биологической активности вида Transferase stimulant у исследованных бензимидазолов от фактора удерживания имеет линейный характер и характеризуется удовлетворительным коэффициентом детерминации (R2=0.94) [129]. Зависимость, приведенная на рис. 3.14, может быть использована для предварительного прогноза потенциальной активности близких по структуре бензимидазолов.
В обращенно-фазовом варианте ВЭЖХ удерживание молекул сорбата происходит за счет взаимодействия с неполярной гидрофобной поверхностью сорбента, но при этом взаимодействие с полярной подвижной фазой вносит существенный вклад в селективность сорбции. Поэтому в отличие от газохроматографических систем подвижная фаза в жидкостной хроматографии будет оказывать существенное влияние на хроматографическое поведение сорбатов.
Увеличение содержания воды в элюенте приводит к возрастанию удерживания бензимидазолов, что согласуется с сольвофобным механизмом удерживания в обращенно-фазовой ВЭЖХ. Это, очевидно, связано с усилением специфических взаимодействий между компонентами элюента, что приводит к выталкиванию молекул сорбатов на поверхность октадецилсиликагеля и, следовательно, к их большей сорбции.
Для изучения влияния состава подвижной фазы на сорбцию часто используют полуэмпирическую модель удерживания Снайдера-Сочевинского. Эта модель описывается уравнением, связывающим логарифм фактора удерживания с мольной долей органического модификатора (Хт) (3.2):
Взаимосвязь фактора удерживания с физико- химическими параметрами молекул исследуемых бензимидазолов
При увеличении концентрации ацетонитрила до Xm = 0.4 абсолютные значения мольных энтропий уменьшаются, что свидетельствует об увеличении подвижности молекул сорбатов в приповерхностном слое. Такие же закономерности были выявлены автором [131] для ароматических гетероциклических соединений. Увеличение мольной энтропии сорбции при содержании в элюенте 0.5 мольных долей ацетонитрила свидетельствует о более локализованной сорбции молекул бензимидазолов. Это, по-видимому, связано с тем, что исследуемые азолы, сорбируясь на «псевдослое», специфически взаимодействуют с молекулами ацетонитрила.
Из данных табл. 3.13 видно, что изменения энтропии для некоторых бензимидазолов (соединения 2, 4, 7 и 12) при определенных составах объемного раствора имеют положительные значения, что указывает на возрастание вариантности сорбционной системы. Вероятно, это является результатом одновременно происходящих процессов, таких как десольватация молекул сорбата, вытеснение молекул ацетонитрила из сорбционного слоя в объемный раствор, происходящее при сорбции молекул аналита. Интересно было установить, существует ли компенсационные зависимости между энтальпией и энтропии, так как они позволяют сделать вывод о схожести механизмов сорбции изучаемых соединений в исследуемых системах «водно-ацетонитрильный раствор – октадецилсиликагель».
В работе получены компенсационные зависимости между изменениями стандартных мольных энтальпий и энтропий процесса перехода бензимидазолов в слой октадецилсиликагеля из водно-ацетонитрильных растворов (рис. 3.26 – 3.28). -АН0, кДж/моль
Полученные компенсационные зависимости не имеют стопроцентной достоверности вследствие имеющих место погрешностей при расчете термодинамических характеристик сорбции. Критерием оценки достоверности полученных зависимостей, как следует из работы [133], может служить несоответствие среднегармонической температуры (Tav) эксперимента с температурой компенсации р. В настоящей работе Tav. = 329.8 К. Установлено, что истинный энтальпийно-энтропийный компенсационный эффект наблюдается в системе с подвижной фазой состава МеCN/H20 - 75/25 % об. Из зависимости, представленной на рис. 3.26, рассчитаны значения температуры компенсации и свободной энергии физико-химических взаимодействий при этой температуре. Полученные результаты представлены в табл. 3.14. Таблица 3.14 Значения температуры компенсации р (К) и свободной энергии физико-химических взаимодействий АСр(Дж/молъ) при этой температуре для
Наличие корреляции между энтальпией и поляризуемостью непосредственно указывает на то, что между молекулами сорбатов и поверхностью неполярного сорбента реализуются преимущественно неспецифические межмолекулярные взаимодействия [134]. Из рис. 3.32 нетрудно видеть, что для соединений 1-4, 6, 10 наблюдается, в целом, закономерное увеличение абсолютных значений энтальпии сорбции с ростом поляризуемости молекул сорбатов. Соединения 5 и 7 характеризуются значениями энтальпии перехода из объемного раствора в поверхностный слой ниже, чем у вышерассмотренных соединений, в то время как, значения поляризуемости у них мало отличаются, а для некоторых соединений совпадают. Это, очевидно, обусловлено усилением специфических взаимодействий их гидроксильных групп, находящихся в пара-положении относительно бензимидазольного фрагмента, с молекулами элюента.. Соединение 12 характеризуется самой большой поляризуемостью, и, следовательно, неспецифическая сольватация его молекулами элюента будет наибольшей. Десольватация этих сильно сольватированных молекул и приводит к понижению абсолютных значений энтальпии [135].
Взаимосвязи между изменениями стандартных мольных энтальпий на фазах с различным содержанием ацетонитрила не наблюдается (рис. 3.33).
Взаимосвязь между изменениями стандартных мольных энтальпий на фазах с различным содержанием ацетонитрила. Однако показано, что существует отличная корреляция между изменениями мольных энергий Гиббса сорбции на фазах с различным содержанием ацетонитрила в элюенте (рис. 3.34).
Взаимосвязь между мольными энергиями Гиббса указывает на общую сходимость механизма сорбции на фазах с различным содержанием ацетонитрила на октадецилсиликагеле. Следовательно, для более глубокого исследования механизма сорбции целесообразно определять изменения мольных энтальпий и энтропий процесса.
В настоящей работе на основании температурных зависимостей натурального логарифма фактора разделения (lna=f(1000/T)) [64] рассчитывались энергетические вклады различных функциональных групп в значение мольной энтальпии и энтропии (табл. 3.15).
