Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Анализ литературных данных 9
1.1 Кинетические закономерности и механизм неингибированного окисления 9
1.1.1 Насыщенные и непредельные соединения 9
1.1.2 Полиненасыщенные жирные кислоты 11
1.2 Кинетические закономерности и механизм ингибированного фенолами окисления 16
1.2.1 Структура и классификация фенольных антиоксидантов 16
1.2.2 Реакции с участием фенолов 18
1.2.3 Реакции с участием феноксильных радикалов 19
1.2.4 Кинетический анализ ингибированного окисления 22
1.2.5 Реакционная способность фенолов 25
1.2.6 Влияние среды на активность антиоксидантов 28
1.3 Методы определения антиоксидантной активности 29
1.3.1 Прямые методы изучения кинетики окисления 29
1.3.1.1 Модели инициирования перекисного окисления 29
1.3.1.2 Субстраты окисления 30
1.3.1.3 Методы определения величин К7 и f в модели перекисного окисления 31
1.3.1.4 Экспериментальные методы мониторинга перекисного окисления 34
1.3.2 Прямые конкурентные методы 36
1.3.3 Косвенные методы определения антиоксидантной активности 38
1.4 Кинетика и механизм антиоксидантного действия полифенолов 41
1.4.1 Строение молекул полифенолов и прочности связей О-Н 41
1.4.2 Антиоксидантная активность полифенолов. Косвенные методы определения 49
1.4.3 Антиоксидантная активность полифенолов. Прямые методы определения 58
Глава 2. Экспериментальная часть 68
2.1 Применяемые материалы 68
2.2 Реакторы и установки 69
2.3 Методы исследования 70
2.4 Статистическая обработка данных и компьютерное моделирование 72
2.5 Квантовохимические расчеты 73
Глава 3. Реакционная способность полифенолов при окислении стирола в растворе 75
3.1 Механизм процесса 75
3.2 Разработка методики изучения антиоксидантной активности полифенолов в неполярной среде 80
3.3 Параметры антиоксидантной активности полифенолов 87
3.3.1 Стехиометрические коэффициенты ингибирования 91
3.3.2 Значения для полифенолов 98
3.4 Антиоксидантная активность фенолов различных классов и прочности связей О-Н 102
Глава 4. Реакционная способность полифенолов при окислении метиллинолеата в растворе 108
4.1 Параметры антиоксидантной активности полифенолов при окислении метиллинолеата в растворе 108
4.2 Сравнение антиоксидантной активности полифенолов при окислении метиллинолеата в растворе и мицеллах 116
4.3 Сравнение различных методов определения антиоксидантной активности 119
Заключение 126
Список использованных источников 128
- Методы определения величин К7 и f в модели перекисного окисления
- Антиоксидантная активность полифенолов. Косвенные методы определения
- Разработка методики изучения антиоксидантной активности полифенолов в неполярной среде
- Сравнение антиоксидантной активности полифенолов при окислении метиллинолеата в растворе и мицеллах
Введение к работе
Актуальность работы. Полифенолы (ароматические соединения, содержащие несколько ОН-групп в бензольном кольце) широко распространены в природе. К природным полифенолам относятся флавоноиды и полигидрокси-кислоты, а также образованные на их основе таннины и лигнины. Полифенолы содержатся во многих фруктах и овощах, а также в таких продуктах питания, как чай, кофе, шоколад, красное вино.
Большой интерес к изучению полифенолов вызван тем обстоятельством, что эти соединения способны снижать риск развития атеросклероза, онкологических и сердечно-сосудистых заболеваний, а также возникновения мутаций. Принято считать, что подобные свойства объясняются высокой антиоксидантной активностью полифенолов. В результате эти соединения способны ингибировать процессы радикально-цепного окисления в организме, защищая биомолекулы (липидные мембраны, белки, ДНК) от окисления. Таким образом, изучение антиоксидантной активности полифенолов представляет большой интерес, как для химии, так и для биологии и медицины.
В последнее время к определению антиоксидантной активности полифенолов и полифенолсодержащих природных продуктов приковано большое внимание, основные результаты опубликованных работ изложены в ряде обзоров [1-4]. В исследованиях используются самые разнообразные подходы к оценке антиоксидантной активности. Однако результаты многих работ являются неоднозначными и невоспроизводимыми. Это связано с использованием в качестве субстратов окисления природных систем (растительные масла, клетки органов животных, плазма крови). Скорость зарождения цепей в таких исследованиях часто неизвестна и изменяется в течение опыта. Для инициирования иногда используются ионы металлов переменной валентности, в результате чего не удается отличить ингибирование окисления полифенолами за счет обрыва кинетических цепей от связывания ионов металлов в комплексы. Зачастую ре-
зультаты исследований представляют в виде невоспроизводимых полуколичественных величин.
В то же время, существует обоснованный подход к определению анти-оксидантной активности, основанный на использовании модели контролированной цепной реакции окисления. Центральным моментом такой модели является строго постоянная и легко контролируемая скорость генерации активных радикалов, что достигается применением радикальных инициаторов. Теоретически обоснованная процедура определения антиоксидантной активности фенольных соединений в рамках такой модели была первоначально разработана для монофенолов [5], а затем была модифицирована для полифенолов на примере гидрохинонов [6]. Антиоксидантная активность фенольных соединений характеризуется двумя независимыми параметрами, константой скорости реакции пероксидного радикала с ингибитором (&7) и стехиометрическим коэффициентом ингибирования (/).
Изучение антиоксидантной активности природных соединений и их аналогов чаще всего проводят в гетерогенных системах, близких по строению к клетке живого организма, - мицеллах и липосомах. Однако антиоксидантная активность, определенная в этих условиях, зависит от различных факторов. Для того чтобы разделить влияние этих факторов, необходимо исследовать антиоксидантную активность этих соединений при окислении модельных субстратов в растворе.
Таким образом, актуальным представляется изучение антиоксидантной активности полифенолов при ингибировании окисления в растворе.
В качестве объектов исследования настоящей работы были выбраны важнейшие природные полифенолы класса флавоноидов и ароматических гид-роксикислот, простейшие синтетические полифенолы - аналоги природных соединений, а также некоторые антиоксиданты класса полифенолов, применяемые в химической и пищевой промышленности.
Цели исследования:
установление параметров антиоксидантной активности полифенолов при ингибировании окисления в растворе;
выявление связи антиоксидантной активности полифенолов со строением соединений и термодинамическими характеристиками процесса.
Научная новизна. В настоящей работе впервые проведено систематическое исследование антиоксидантной активности полифенолов при окислении стирола и метиллинолеата в растворе. Обнаружено, что значения/для некоторых полифенолов заметно меньше двух, что объясняется их автоокислением в растворе. Установлена связь значений /с7 со строением молекул полифенолов. Установлено, что для монофенолов и производных гидрохинона и пирокатехина существует единая линейная корреляция между логарифмом значения к7 и прочностью связи О-Н. Обнаружена линейная корреляция между логарифмом константы равновесия и энергией комплексообразования полифенолов с метил-линолеатом.
Положения, выносимые на защиту:
— Связь антиоксидантной активности полифенолов со строением соеди
нений.
-Связь антиоксидантной активности полифенолов с термодинамическими параметрами процесса.
Научно-практическая ценность. Примененный в настоящей работе подход к определению антиоксидантной активности полифенолов при окислении модельных соединений может использоваться и для изучения других природных антиоксидантов. Обнаруженные закономерности связи антиоксидантной активности полифенолов со строением и термодинамическими характеристиками процесса могут быть использованы для объяснения антиоксидантной активности полифенолов в реальных биологических системах.
Структура работы. Диссертация состоит из введения, четырех глав и заключения. Работа изложена на 141 странице, включая 22 рисунка и 29 таблиц. Список использованных источников включает 136 наименований.
В первой главе проанализированы литературные данные о механизме неингибированного и ингибированного окисления органических соединений, рассмотрены различные методы определения антиоксидантной активности. Особое внимание уделено результатам определения антиоксидантной активности полифенолов и механизму их действия.
Во второй главе описаны объекты и применяемые методы исследования.
В третьей главе рассмотрены особенности механизма ингибированного полифенолами окисления стирола, приведено обоснование выбора растворителя для проведения исследований. Приведены параметры антиоксидантной активности полифенолов при окислении стирола, рассмотрена их взаимосвязь со строением соединений и прочностями связей.
В четвертой главе представлены параметры антиоксидантной активности полифенолов при окислении метиллинолеата в растворе. Рассмотрены причины последовательного снижения величины к-] при переходе от стирола к ме-тиллинолеату в растворе и мицеллах. Проведено сравнение результатов настоящей работы с результатами косвенных методов определения антиоксидантной активности.
Автор считает своим приятным долгом выразить глубокую благодарность своему научному руководителю д.х.н., профессору Плиссу Е.М., а также д.х.н., профессору Русакову А.И. и д.х.н. Рогинскому В.А. за постоянную помощь и поддержку на всех этапах работы.
Методы определения величин К7 и f в модели перекисного окисления
Выполнение соотношения (1.2) неоднократно проверялось при окислении ПНЖК и их эфиров, как в гомогенных растворах [13, 14], так и в микрогетерогенных системах (мицеллы, липосомы) [15-18].
Несмотря на то, что в первом приближении формально-кинетические закономерности окисления ПНЖК и модельных углеводородов близки, процесс окисления ПНЖК имеет ряд отличий, обусловленных особенностями структуры ПНЖК и термодинамикой радикальных реакций с их участием.
Строение природных жирных кислот можно описать обобщённой формулой СН2-(СН=СН-СН2)„-СН2 . Характерная деталь структур ПНЖК (п 2) - наличие диаллильных метиленовых групп -СН=СН-СН2-СН=СН-, фланкированных двумя двойными связями, что определяет их способность к окислительным превращениям. В таблице 1.1 приведены термодинамические параметры некоторых реакций с участием ПНЖК и их более насыщенных аналогов.
Можно увидеть, что прочность связи С-Н (Д:н) в метиленовой группе снижается с ростом п от нуля до двух [20]. В том же направлении увеличиваются экзотермичность реакции продолжения цепи (2) и константы скорости к2 [13, 20]. Низкая величина DCH В диаллильном фрагменте ПНЖК и её высокая реакционная способность обусловлена образованием при разрыве этой связи сопряжённого и поэтому термодинамически выгодного пентадиенильного радикала:
Дальнейшее увеличение количества двойных связей {п 2) сопровождается лишь ростом числа диаллильных групп -СН2-, поэтому можно считать, что при п 2 величина сн остается практически постоянной [14].
Как следствие высокой химической активности связей С-Н в диаллиль-ном положении именно эти связи должны преимущественно подвергаться атаке свободными радикалами. Это согласуется с экспериментом. При взаимодействии радикалов (СН3)зСО с метиловыми эфирами линолевой кислоты и других ПНЖК образуются практически только пентадиенильные радикалы [21]. Вклад алкильных радикалов, возникающих при атаке метиленовых групп вдали от двойной связи, становится заметным только в смеси эфиров ПНЖК и насыщенных ЖК, сильно обогащенной насыщенным компонентом. Оцененное в работе [21] отношение вероятности атаки радикалом (СНз)СО связи С-Н алкильном, аллильном и диаллильном положении составляет 1 : 18 : 116 (303 К). Это соотношение сохраняется при переходе от метиловых эфиров к триглицеридам, в которых фрагменты жирных кислот разной степени ненасыщенности находятся в одной молекуле. Аналогичный процесс с участием пероксидных радикалов (реакция (2)) ещё более селективен. Отношение констант скорости взаимодействия радикалов (СН3)СОО с эфирами ряда жирных кислот с п = 0, 1 и 2 составляет 1 : 102 : 10 [20]. Подобное отношение сохраняется и в случае реакций эфиров ЖК с собственными пероксидными радикалами [13]. О высокой селективности реакции (2) говорит также изомерный состав образующихся при этом гидропероксидов. В случае линолевой кислоты и её эфиров образуются практически только гидропероксиды, сопряжённые с двумя двойными связями СН(ООН)-СН=СН-СН=СН-СН2 (так называемые диеновые конъюгаты -продукты превращения пентадиенильных радикалов) [22]. Таким образом, при окислении реальных фосфолипидов, содержащих фрагменты насыщенных, ненасыщенных и полиненасыщенных жирных кислот, окислению преимущественно будут подвергаться последние. Так, скорость окисления смесей метило-леата с метиллинолеатом и метилолеата с метиллиноленатом практически пропорциональна концентрации эфира ПНЖК [14]. Окисляемость ПНЖК, выражаемая параметром к к 5 пропорциональна числу диаллильных групп в молекуле [23].
Термодинамический расчет показывает, что если при взаимодействии радикалов LO2 с фрагментами моноеновых кислот с реакцией (2) может конкурировать присоединение радикала по двойной связи, то в случае ПНЖК относительный вклад последней реакции мал [19]. Действительно, выход гидропе-роксидов, образующихся в реакции (2), при окислении ПНЖК близок к 100% [13,22].
При увеличении параметра п реакция (1) присоединения 02 к алкильно-му радикалу L становится менее экзотермичной. В случае ПНЖК величина -Д#і столь мала, что реакция (1) становится обратимой при достаточно низких температурах, в то время как для алкилпероксидных и аллилпероксидных радикалов обратимость возможна лишь при более высоких температурах [19].
Место присоединения кислорода к пентадиенильному радикалу также определяется термодинамикой. По данным ЭПР спиновая плотность в пента-диенильном радикале в положении 3 (0,45) выше, чем в положениях 1 и 5 (0,39) [21], однако основными продуктами окисления ПНЖК, как уже говорилось, являются диеновые конъюгаты, образующиеся в результате присоединения кислорода в положения 1 и 5. Причиной этого является большая экзотермичность и, как следствие, меньшая обратимость присоединения в положения 1 и 5, чем в положение 3 [19].
Обратимость реакции (1) обуславливает разнообразие геометрических изомеров гидропероксидов - продуктов окисления ПНЖК. Так, при окислении метиллинолеата (цис,цис-изомер 1) образуются как цис,транс- (2, 3), так и транс,транс-гидропероксиды (4, 5). Изомеризация пентадиенильного радикала происходит через обратимое присоединение кислорода (рисунок 1.1). В образующихся пероксидных радикалах возможно вращение вокруг связи С-С, поэтому отрыв кислорода может происходить как с образованием цис-, так и транс-конфигурации радикала. Второй процесс протекает быстрее (&_It = 430 с-1 против _1С = 27 с-1), поэтому среди продуктов окисления метиллинолеата преобладают транс,транс-гидропероксиды [22].
Антиоксидантная активность полифенолов. Косвенные методы определения
Наиболее прямым, ясным и непротиворечивым с точки зрения теории методом определения антиоксидантнои активности является непосредственное изучение кинетики ингибированного окисления органических субстратов. При этом применяются две модели окисления: автоокисление и инициированное окисление. В первой модели окисление протекает в режиме неконтролирован-ной цепной реакции, скорость которой увеличивается за счет накопления гид-ропероксидов и их последующего распада. При этом величина Rx неизвестна и переменна во времени. Вследствие этого величины периода индукции и глубины ингибирования, зависящие от R\, не несут в себе значимой информации, поскольку являются невоспроизводимыми [3]. Другим ограничением данной модели является частое использование для инициирования окисления фентоновских и подобных им систем, в результате чего не удается отличить механизм антиоксидантного действия (обрыв цепей окисления или комплексо-образование антиоксиданта с ионами металлов) [1, 3]. В другой модели окисление протекает в режиме контролированной цепной реакции, что позволяет получать интерпретируемые и воспроизводимые данные. Для поддержания постоянной скорости инициирования наиболее часто используются азоинициа-торы, распадающиеся под воздействием температуры. Наиболее типичными из них являются водорастворимый 2,2 -азо-бис-(2-амидинопропан)-гидрохлорид (ААРН) и растворимые в органической фазе 2,2 -азо-бис-изобутиронитрил (АИБН) и 2,2 -азо-бис-(2,4-диметилвалеронитрил) (AMVN). С использованием таких соединений легко получить требуемую скорость инициирования в широком диапазоне температур. При этом скорость инициирования зависит только от температуры и концентрации азоинициатора и не зависит от содержания других компонентов в реакционной смеси. Скорость инициирования достаточно легко определяется методом ингибиторов. Суть его состоит в следующем: проводится окисление в присутствии сильного ингибитора с известным значением/ измеряется период индукции, после чего по уравнению (1.4) определяется значение скорости инициирования. В качестве ингибиторов в этом методе широко применяются синтетические аналоги токоферола — водорастворимый Trolox и жирорастворимый С-1, для которых/= 2 [40].
Важным вопросом при изучении кинетики ингибированного окисления является выбор субстрата окисления. Некоторые исследователи используют в качестве субстрата природные компоненты (липиды, растительные масла, клетки животных, плазма крови). Недостатки такого подхода очевидны: состав субстрата неизвестен и может изменяться, в результате чего невозможно добиться воспроизводимости результатов. Кроме этого, неизвестными являются также концентрация субстрата и константа скорости реакции продолжения цепи к2, вследствие чего невозможно охарактеризовать силу антиоксидантного действия константой скорости реакции антиоксиданта с пероксидным радикалом 7. К тому же биологические субстраты окисления уже могут содержать антиокси-данты (например, витамин Е), что также затрудняет методику тестирования.
Этих недостатков лишены синтетические субстраты — индивидуальные вещества. Для разных типов антиоксидантов были предложены различные типы субстратов окисления. Так для водорастворимых антиоксидантов используют водные системы (мицеллы [18, 41, 42] или фосфолипидные липосомы [43]). Для жирорастворимых антиоксидантов в качестве субстрата используют модели липидов (ПНЖК и их эфиры) в гомогенной среде или модельные углеводороды. Преимуществом использования углеводородов является отсутствие ком-плексообразования антиоксиданта с субстратом, которое может приводить к снижению антиоксидантной активности. В результате константы скорости k-j, определенные в неполярных субстратах, являются истинными, в отличие от значений к7 в липидах и мицеллах, которые являются эффективными и заниженными. Поэтому истинную реакционную способность антиоксидантов предпочтительнее определять в среде углеводорода.
В качестве неполярного субстрата наиболее удобно использовать стирол, поскольку он обладает рядом преимуществ [29]: 1) Константа скорости продолжения цепи ki достаточно велика (57 л/(моль-с) при 310 К [44]), поэтому окисление в присутствии ингибитора протекает с измеримой, достаточно высокой скоростью. 2) Продолжение цепи происходит по реакции присоединения, в результате чего при окислении образуется полипероксид, а не гидропероксид, и обратная реакция (-7), осложняющая механизм ингибирования, становится невозможной: 3) Для стирола невозможна реакция продолжения цепи радикалом ин гибитора, поскольку отсутствует возможность отрыва атома водорода: В случае очень слабых антиоксидантов для определения стехиометри-ческого коэффициента ингибирования / возможно использование субстрата с относительно низким значением к2, например, кумола {к2 = 0,18 л/(моль-с) при 303 К [45]). Методы определения величин к7 и/в модели перешеного окисления Методы определения к-] основаны на конкуренции реакции (7) с одной из реакций с участием RO2" — продолжением цепи (2) или квадратичным обрывом (6). Вывод и конечный вид формул для расчета к7 зависит от применяемого метода мониторинга окисления. Рассмотрим расчет к7 для случая наиболее практически важного, простого и широко применяемого метода измерения поглощения кислорода (манометрического или волюмометрического). В этом методе результатом эксперимента является кинетическая кривая зависимости количества поглощенного кислорода от времени. По этой кривой при необходимости определяют скорость окисления в начальный или произвольный момент времени.
Разработка методики изучения антиоксидантной активности полифенолов в неполярной среде
Периодический мониторинг процесса перекисного окисления основан на анализе проб, отобранных на разных стадиях процесса. Кроме уже упомянутого спектрофотометрического определения гидропероксидов в продуктах окисления, могут применяться химические методы, например, иодометрическое титрование ROOH, реакция с Fe2+ или с тиобарбитуровой кислотой. Иодометрическое определение может проводиться индикаторным, потенциометриче-ским или спектрофотометрическим способом [1]. При этом следует учитывать, что выделяющийся йод способен реагировать с субстратом окисления. Также йод может образовываться при взаимодействии иодида калия с кислородом.
Гидропероксиды способны окислять Fe" до Fe , что можно использовать для их идентификации. Полученный Fe3+ определяют спектрофотометри-чески по реакции образования комплекса с ксиленоловым оранжевым (Л = 560 -580нм)[1].
Реакция с тиобарбитуровой кислотой служит для обнаружения малонового диальдегида — продукта разложения ROOH. При взаимодействии этих веществ образуется окрашенный комплекс, который обнаруживают по поглощению при Я = 535 нм или по флуоресценции [1]. Однако, образование малонового диальдегида не является единственным путем разложения ROOH, поэтому данный метод приводит к существенно заниженным результатам [3].
Кроме непосредственного изучения кинетики ингибированного перекисного окисления иногда применяются методы, основанные на конкуренции реакций RO2 с антиоксидантом и вводимым в систему индикатором. В присутствии антиоксиданта скорость реакции RO2" с индикатором снижается, что дает возможность оценить антиоксидантную активность.
В одном из методов в качестве вводимого индикатора используют R-фикоэритрин, который представляет собой натуральный протеин, обладающий способностью к флуоресценции. При введении в систему RO2", образующихся при разложении азо-инициатора, интенсивность флуоресценции снижается вследствие деструкции R-фикоэритрина. В присутствии антиоксиданта скорость уменьшения интенсивности флуоресценции снижается вследствие снижения концентрации RO2", что дает возможность оценить активность антиоксиданта. Существуют две модификации этого метода. В первом методе скорость уменьшения интенсивности флуоресценции остается постоянной до степени превращения 80%. Эффективность антиоксиданта характеризуется параметром TRAP (total radicalrapping antioxidant parameter), который вычисляется из периода индукции по методу касательных [46]. Во втором методе скорость уменьшения интенсивности флуоресценции является переменной во времени. Эффективность антиоксиданта характеризуется параметром ORAC (oxygen radical absorbance capacity), который как площадь под кривой зависимости 1/10 от времени (/о и / — интенсивность флуоресценции в отсутствии и в присутствии антиоксиданта соответственно) [47]. В обоих методах результат выражается в единицах эквивалента Trolox, который выбран стандартным антиоксидантом. Следует отметить, что описанные методы не имеют строгого физического толкования, поскольку используют упрощенные представления о механизме процесса [3].
В методе с использованием дихлорфлуоресцин-диацетата индикатором служит продукт окислительного превращения — дихлорфлуоресцеин. При взаимодействии исходного соединения с RO2 ААРН образуется продукт, обладающий способностью к флуоресценции. Определение антиоксидантной активности основано на снижении скорости увеличения флуоресценции при введении в систему антиоксиданта [48].
Вместо флуоресценции возможно использование индикаторов, имеющих поглощение в видимой области излучения, таких как кроцин и р-каротин. Кроцин представляет собой природное соединение, обладающее высоким поглощением в видимой области. При взаимодействии с RO2 происходит обесцвечивание кроцина. В присутствии антиоксиданта скорость обесцвечивания снижается, что дает возможность определить активность антиоксиданта. Метод был описан в работе [49] и модифицирован в работе [50]. Первоначально метод был разработан для анализа плазмы крови, однако может использоваться и для анализа индивидуальных соединений. Аналогично вместо кроцина может использоваться (3-каротин. При автоокислении линолевой кислоты в водной эмульсии происходит обесцвечивание Р-каротина. Недостатком этого метода являются неконтролируемые условия протекания окисления, что ведет к невоспроизводимости результатов [3]. В целом, описанные методы аналогичны методу TRAP с присущими ему недостатками.
Возможно использовать измерение скорости не расходования, а образования индикатора. На этом основан метод с использованием иодида калия [51]. Иодид калия реагирует с R(V азо-инициатора с образованием свободного йода, который определяется путем автоматизированного потенциометрического титрования с тиосульфатом натрия. В присутствии антиоксиданта скорость образования йода снижается, на основании чего определяется антиоксидантная активность.
В косвенных методах изучается взаимодействие антиоксиданта с радикалами, отличными от RO2". Основная идея этих методов состоит в следующем. Антиоксидантная активность фенолов определяется способностью отдавать атом водорода при взаимодействии с R(V. Измеряя способность различных ан-тиоксидантов отдавать атом водорода при взаимодействии с другими радикалами (не RO2 ), можно получить ряд реакционной способности. В первом приближении зависимость реакционной способности от структуры антиоксиданта должна быть примерно одинакова как для реакции с R(V, так и для других радикалов. Однако необходимо учитывать, что различные радикалы отличаются по способности к отрыву атома водорода и по селективности, поэтому полученные закономерности не всегда справедливы для реакции ингибирования пе-рекисного окисления [1]. В этих методах используются различные типы ради калов и применяются самые разнообразные методы их генерирования. Далее будут рассмотрены наиболее важные из них.
Сравнение антиоксидантной активности полифенолов при окислении метиллинолеата в растворе и мицеллах
Приведенные результаты соответствуют закономерностям для флавоноидов. Так, эпикатехин, не имеющий двойной связи и карбонильной группы, характеризуется почти в два раза меньшим значением ТЕАС, чем кверцетин. Лутеолин, отличающийся от кверцетина только отсутствием ОН-группы в положении 3, также имеет значительно меньшее значение ТЕАС. Тем не менее, результаты, полученные в работе [78], вызывают некоторые вопросы. Так, эпигаллокатехин имеет в 1,5 раза большее значение ТЕАС, чем эпикатехин, в то время как мирицетин имеет в 1,5 раз меньшее значение по сравнению с кверцетином. В одном случае появление третьей ОЫ-группы в кольце В флавоноида повышает его реакционную способность, в другом случае — уменьшает. Это не дает возможности установить однозначную связь строения флавоноидов с их реакционной способностью по результатам метода ABTS.
В работе [79] методом ABTS было изучено влияние рН на ТЕАС различных гидроксифлавонов. Было установлено, что с увеличением рН значения ТЕАС увеличиваются, причем наибольшее увеличение происходит в области рН, соответствующей рКа флавоноидов. На основании этого авторы приходят к выводу, что реакция флавоноидов с ABTS"+ протекает по механизму переноса электрона. При нейтральном значении рН гидроксифлавоны, не имеющие звена пирокатехина в кольце В, характеризуются очень низкими значениями ТЕАС, за исключением 3-ОН-замещенных соединений. При этом корреляция значений ТЕАС при рН = 7 с числом ОН-групп отсутствует.
Влияние метилирования ОН-групп на ТЕАС флавоноидов на примере кверцетина и лутеолина рассмотрено в работе [73]. Метилирование одной из ОН-групп в кольце В приводит к значительному снижению ТЕАС, особенно в случае кверцетина. При этом метилирование групп З -ОН и 4 -ОН имеет практически одинаковый эффект, что может говорить о равнозначности их реакционной способности в реакции с ABTS"+. Интересно, что метилирование ОН-группы и удаление ОН-группы из молекулы флавоноида приводят к одинаковым значениям ТЕАС, что можно увидеть при сравнении зависимостей ТЕАС от рН для соответствующих флавоноидов.
Ограниченность применения метода ABTS для анализа антиоксидант-ной активности полифенолов и его противоречие с результатами других методов рассмотрены в работах [80, 81]. Так, резорцин характеризуется более высоким значением ТЕАС = 2,49, чем пирокатехин (1,45) и гидрохинон (1,33). В то же время другие методы (взаимодействие с О2 , ON02" , ингибирование пере-кисного окисления липидов) свидетельствуют о более высокой активности пирокатехина и гидрохинона по сравнению с резорцином. Аналогичный эффект наблюдается в паре хризин (1,49) — галангин (1,22). Авторами было установлено, что продукты превращения резорцина и хризина способны далее взаимодействовать с ABTS +, что не характерно для других соединений. Значение ТЕАС для этих соединений имеет суммарный характер, реально не отражая собственно взаимодействие антиоксиданта с ABTS"+.
В работе [82] для изучения антиоксидантной активности ряда ди- и три-гидроксиароматических кислот были использованы методы ABTS, DPPH, а также метод перекисного окисления липосом. Результаты всех экспериментов были выражены параметрами ТЕАС. Методы ABTS и DPPH продемонстрировали большую активность производных пирогаллола по сравнению с производными пирокатехина. При использовании метода перекисного окисления липосом был обнаружен обратный порядок реакционной способности: производные пирокатехина оказались активнее. Этот эффект авторы объясняют большей ли-пофильностью производных пирокатехина, что обеспечивает более эффективное ингибирование окисления в органической фазе.
В работе [52] было изучено взаимодействие таннинов и флавоноидов с DPPH, результаты представлены в виде величин 1С5о (таблица 1.9). Наибольшую активность из приведенных в таблице соединений имеют галлокатехин и эллаговая кислота. Следует отметить, что эллаговая кислота (С-С димер галловой кислоты) имеет почти в два раза большую активность, чем галловая кислота. Галлокатехин, имеющий на одну ОН-группу в кольце В больше по сравнению с катехином, активнее последнего. Также результаты соответствуют закономерностям для флавоноидов: кверцетин активнее катехина (за счет наличия Сг=Сз и С4=0 фрагментов), а в парах кверцетин — лутеолин и кемпферол — апигенин более активны первые (за счет фрагмента С3-ОН).
Похожие закономерности для флавоноидов были обнаружены и в работе [83], в которой АОА флавоноидов различных классов была изучена при помощи различных методов (таблица 1.10). Если сравнить флавоноиды трех классов с одинаковым гидроксильным замещением - кверцетин, катехин и таксифо-лин, то можно увидеть, что первый из них более активен, что согласуется с закономерностями для флавоноидов. Также кверцетин активнее лутеолина, а кемпферол — апигенина, что опять же иллюстрирует влияние 3-ОН-группы на АОА флавоноидов. С другой стороны, в работе [84] величины ЕС50, определенные методом DPPH, для кверцетина, катехина, эпикатехина и таксифолина оказались практически равны, что говорит об отсутствии влияния структуры кольца С на активность этих соединений.
В большинстве работ результаты изучения взаимодействия полифенолов с DPPH представлены в виде величин IC50 или стехиометрии реакции. Однако в ряде работ были определены константы скорости взаимодействия полифенолов с DPPH , гальвиноксилом (Galv ) и радикалом 5,7-ди-изопропил-токоферола (Тос ) (таблица 1.11). Результаты, полученные в работах [85, 87, 88], выглядят вполне разумно: кверцетин оказывается активнее катехина и таксифолина, эпигаллокатехин заметно активнее эпикатехина, мирицетин - кверцетина, а кемпферол - апигенина. Результаты же работы [86] выглядят неожиданно: в ряду кемпферол — кверцетин - мирицетин величина константы скорости уменьшается, а не увеличивается, лутеолин оказывается в 5 раз активнее кверцетина. Такой эффект не может иметь разумного объяснения, и эти результаты, видимо, являются ошибочными.
