Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 10
1.1. Видовой состав вирусов косточковых культур в Европейской части России 10
1.2. Основные вирусы, поражающие косточковые культуры 12
1.3. Методы диагностики вирусов косточковых культур 24
1.3.1. Иммуноферментный анализ 28
1.3.2. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 36
1.3.2.1. Особенности метода полимеразной цепной реакции 36
1.3.2.2. Применение ПЦР-теста для диагностики вирусов
косточковых культур 42
Глава 2. Материалы, методы и объекты исследований 46
2.1. Время и место проведения исследований 48
2.2. Объекты исследований и их характеристика 48
2.3. Методика маршрутных обследований и тестирования растительных образцов на наличие вирусов 53
2.3.1. Методика проведения ИФА 53
2.3.2. Методика выполнения ПЦР 57
2.3.2.1. ОТ-ПЦР 57
2.3.2.2. ОТ-ПЦР в реальном времени 60
2.3.3. Тестирование на древесных индикаторах 62
2.4. Элементы учета и наблюдений 62
2.5. Методы статистической обработки данных 62
2.6. Расчет экономической эффективности 62
Глава 3. Результаты исследований 63
3.1. Изучение распространенности и вредоносности вирусов на косточковых культурах 63
3.2. Сравнительная оценка эффективности выявления вируса PPV с использованием методов ИФА и ПЦР 68
3.2.1. Эффективность выявления вируса PPV в зависимости от тестируемого органа растения 68
3.2.2. Эффективность тестирования в зависимости от длительности хранения образцов листьев 72
3.2.3. Диагностика вируса PPV в пробирочных и адаптированных к нестерильным условиям растениях сливы 76
3.3. Совершенствование метода экстракции РЕК вируса из растительных образцов 79
3.4. Эффективность выявления вируса шарки сливы на древесных индикаторах вишни войлочной в зависимости от способа прививки 85
Глава 4. Экономическая оценка различных методов диагностики 90
Выводы 94
Рекомендации производству 96
Список использованных источников
- Методы диагностики вирусов косточковых культур
- Методика маршрутных обследований и тестирования растительных образцов на наличие вирусов
- Сравнительная оценка эффективности выявления вируса PPV с использованием методов ИФА и ПЦР
- Диагностика вируса PPV в пробирочных и адаптированных к нестерильным условиям растениях сливы
Введение к работе
Вирусные и фитоплазменные заболевания вследствие хронического характера и высокой вредоносности считаются одним из лимитирующих факторов повышения урожайности косточковых культур. Наиболее вредоносным вирусом на этих культурах является потивирус шарки сливы (PPV), вызывающий существенное снижение урожая в результате преждевременного опадения плодов и снижения их вкусовых и товарных качеств. В середине прошлого века шарка едва не привела к вырождению культуры сливы в Югославии и Болгарии и вызвала необходимость вырубки сотен тысяч деревьев (Christoff, 1947; Jordovic, 1963). В условиях Молдовы потери урожая у восприимчивых к шарке сортов сливы составляют 70 % и более (Вердеревская, Маринеску, 1985). В бывшей Чехословакии заражение сливовых садов шаркой привело к снижению их продуктивности на 85 % (Blattny, Heger, 1965), а в Польше - на 50 % (Zawadzka, 1978). У больных деревьев от 20 до 100 % плодов преждевременно опадает, а вес оставшихся снижается в среднем на 20 % (Sutic et al., 1971; Zawadzka, Smolarz, 1978). Кроме того, в уцелевших плодах снижается содержание Сахаров (до 25 %), а кислотность повышается, что существенно снижает их вкусовые качества и пригодность для переработки (Jordovic et al., 1971).
В 80-е годы прошлого века в европейских странах были выведены устойчивые и толерантные к шарке сорта сливы, персика и абрикоса (Kegler et al., 1986), и внедрена система сертификации посадочного материала, что позволило снизить распространенность и вредоносность наиболее часто встречающегося серотипа D PPV. Однако повсеместно было констатировано быстрое распространение высокопатогенного серотипа М этого вируса (Nemeth, 1994; Roy, Smith, 1994; Topchiiska, 1997).
Высокой вредоносностью для косточковых культур характеризуются также иларвирусы некротической кольцевой пятнистости косточковых (PNRSV) и карликовости сливы (PDV), вызывающие разнообразные болезни. Вирус PNRSV вызывает такие болезни, как некротическая кольцевая
пятнистость вишни и черешни, кольцевая пятнистость и розеточность персика, кольцевая пятнистость сливы и другие. Так, в Англии в результате заражения PNRSV снижение продуктивности деревьев сливы составляло 13-50 % в зависимости от чувствительности сорта и штамма вируса (Posnette et al., 1981). Во Франции этот вирус вызывал уменьшение диаметра скелетных ветвей сливы до 58 %, а урожайности - в среднем на 20 % (Desvignes, Воуе, 1989). В средиземноморском регионе распространенность вируса PNRSV на сливе составила 27,1 %, PDV - 15,1 %, PPV - 35,7 %, ACLSV - 9,4 %. Насаждения вишни были заражены PNRSV на 48,4 %,PDV-15,1 %, ACLSV-21 % (Myrta et al., 2003).
Вирус PDV вызывает высоковредоносную желтуху вишни, хлоротическую кольцевую пятнистость черешни, скручивание листьев и карликовость сливы, гуммоз абрикоса, зеленую карликовость персика и другие болезни (Вердеревская, Маринеску, 1985).
Вирус PDV приводит к снижению урожайности черешни на 29-48 %, сливы — на 58-99 % в результате преждевременного опадения плодов (Kralikova, 1963), а вишни после поражения желтухой - на 50 % и более (Fulton etal., 1981).
Некоторые штаммы триховируса хлоротической пятнистости листьев яблони (ACLSV) вызывают на сливе и абрикосе растрескивание коры и псевдошарку (Kegler et al., 1964; Dunez, 1986). В первом случае развиваются глубокие и прогрессирующие трещины, что приводит к отмиранию ветвей. При поражении псевдошаркой плоды имеют неправильную форму, различные деформации и преждевременно опадают.
Основным направлением борьбы с этими заболеваниями является перевод питомниководства на безвирусную основу и введение системы сертификации посадочного материала, что уже осуществлено во всех странах с развитым садоводством.
В России в 70-80-е годы были достигнуты существенные успехи в получении и размножении безвирусного посадочного материала косточковых культур, но в настоящее время это направление питомниководства переживает
существенный упадок. В немалой степени это обусловлено финансовыми проблемами и трудоемкостью технологии получения безвирусных клонов. В связи с разработкой программы по развитию питомниководства в РФ возникает необходимость увеличения выпуска оздоровленных растений.
Ключевым элементом любой технологии получения здоровых клонов является диагностика вирусной инфекции. В этом плане важным шагом стало внедрение метода иммуноферментного анализа - ИФА (Clark, Adams, 1977), который позволяет в краткие сроки (2-3 дня) в лабораторных условиях осуществлять тестирование нескольких сотен образцов. Внедрение данного метода позволило практически отказаться от использования травянистых растений-индикаторов.
Однако получение диагностических сывороток возможно далеко не ко всем вирусам и фитоплазмам плодовых культур, а сам метод ИФА имеет недостаточную чувствительность для выявления вирусов в конце вегетации и в состоянии покоя растений, в тканях коры и древесины, а также в культурах in vitro растений. Как правило, использование метода ИФА ограничивается двумя месяцами после начала вегетации растений.
Указанные недостатки позволяют преодолеть методы молекулярной диагностики с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР), являющиеся наиболее современными технологиями диагностики патогенов (Wetzel et al., 1991). Преимуществами ПЦР-теста для выявления фитовирусов являются чрезвычайно высокие специфичность и чувствительность, что теоретически позволяет выявлять единичные молекулы-мишени из смеси многих других. Проведение анализа возможно в течение одного рабочего дня.
ПЦР-тесты для диагностики различных патогенов плодовых культур (вирусов, вироидов, фитоплазм, бактерий, грибов) активно разрабатываются и внедряются во всем мире. В России в этом плане было проведено крайне ограниченное число исследований по немногочисленным объектам (Филимонова и др., 2000; Добржанская и др., 2001), вследствие чего ПЦР-тесты по-прежнему слабо применяются в практике диагностической работы.
Методы диагностики вирусов косточковых культур
Плоды имеют неправильную форму и напоминают ушибы, часть плодов преждевременно созревает и опадает. На листьях симптомы либо отсутствуют, либо имеют вид узкой линейной мозаики. Характерные симптомы на плодах в Англии описаны на сортах Warwickshire drooper, Tydeman s large yellow.
H. Kegler et al. (1964) исследовал связь симптомов псевдошарки на плодах и линейной мозаики на листьях и установил, что оба заболевания вызывают ± штаммы вируса хлоротической пятнистости листьев яблони.
Впервые о выделении вируса ACLSV из деревьев вишни с симптомами некротического узора на плодах сообщил R. Cropley (Cropley, 1968). Вирус был перенесен на травянистые индикаторы и вновь возвращен на сеянцы персика, где вызвал характерные симптомы зеленой вдавленной пятнистости листьев. Однако точные доказательства того, что выделенный вирус ACLSV вызывает некрозы на плодах, в этих экспериментах не были получены.
Позже были описаны симптомы некротического поражения плодов вишни сорта Шатенморель и черешни Гедельфинская и Кассини ранняя, вызванные вирусом хлоротической пятнистости листьев яблони (Baumann, 1972).
Среди сортов вишни, обнаруживших заражение вирусом ACLSV, два выделялись особенно яркими симптомами некротического поражения плодов: Ширпотреб черная и Сеянец Авдеева. Сорт Юбилейная, пораженный некротической крапчатостью плодов, не вызвал симптомов ACLSV на основных индикаторах этого вируса. В Молдавии вирус ACLSV и вызванные им заболевания идентифицированы на сливе, черешне, вишне и персике (Вердеревская, Маринеску, 1985).
Вирус ACLSV распространяется при вегетативном размножении посадочного материала, механически - соком, данных об естественных переносчиках вируса нет.
Методы диагностики. Серологический: ELISA -тест или IEM, заражение соком из лепестков или тканей камбия индикатора Chenopodium qainoa, тестирование на сеянцах персика сорта Эльберта или GF-305 и тестирование в поле на индикаторах Primus tomentosa или Mains platycarpa, молекулярная диагностика методами ОТ - ПЦР, ИС - ОТ -ГЩР (Candresse et al.,1995).
Для предотвращения заражения данным вирусом следует осуществлять размножение только свободных от вирусов клонов косточковых пород, размещение новых безвирусных насаждений изолированно от промышленных садов косточковых и семечковых пород, заложенных несертифицированным посадочным материалом. Неповирус скручивания листьев черешни {Cherry leaf roll nepovirus -CLRV) Основными плодовыми культурами, поражаемыми CLRV, являются вишня и черешня. У вишни этот вирус вызывает бледно-зеленую межжилковую мозаику и быстрое отмирание зараженных деревьев. В молодых деревьях черешни он может несколько лет оставаться латентным, а затем развивается быстро прогрессирующая розеточность с задержкой весеннего распускания почек и отмиранием взрослых деревьев в течение двух-трех лет (Cropley, 1968; Kegleretal., 1985).
Характерным симптомом вируса скручивания листьев на черешне является образование розеток листьев, узких и жестких, иногда с загнутыми вверх краями. Однако эти симптомы неспецифичны, так как похожую розеточность вызывают и другие вирусы, особенно вирусные комплексы.
В Англии при исследовании симптомологии и вредоносности CLRV было установлено, что интенсивность проявления симптомов и вредоносность одного этого вируса на вишне и черешне достаточно высоки, но при совместном заражении другими вирусами резко усиливаются. Отмечено также интенсивное образование энаций, особенно если в комплексе присутствует вирус карликовости сливы (Cropley, 1968).
Листья на деревьях, пораженных розеточностью, обычно свернуты по центральной жилке краями вверх, нижняя поверхность листьев по краям часто окрашена в красноватый цвет или вследствие хлоротичной окраски всего листа выглядит розовой. На молодых деревьях сначала появляются отдельные ветви с подавленным ростом, мелкими ложкообразными листьями, которые уже в середине лета становятся красноватыми.
На плодовых культурах CLRV описан в Англии, Австралии, Бельгии, Чехии, Германии, во Франции, в Венгрии, Италии и Голландии, а также в Северной Америке (Вердеревская, Маринеску, 1985). По данным ряда исследователей, CLRV не оказывает значимого вреда на большинстве косточковых культур (Nemeth, 1986).
Помимо вирусов определенный вред насаждениям косточковых культур могут наносить вироиды, в частности вироид карликовости хмеля и вироид латентной мозаики персика (Колонцов, Заец, 2006). Для их диагностики используется метод ПЦР.
Методика маршрутных обследований и тестирования растительных образцов на наличие вирусов
Изучение распространенности вирусных болезней проводили путем маршрутных обследований насаждений косточковых культур.
В июне 2006-2007 г.г. в период активного роста побегов проведено обследование коллекционных насаждений сливы, вишни, алычи в Московской области.
С растений, проявивших вирусоподобные аномалии и бессимптомных, отбирали листья и плоды и доставляли в лабораторию вирусологии ВСТИСП для дальнейшего изучения.
Отобранный в результате обследований растительный материал анализировали методом ИФА на наличие иларвирусов некротической кольцевой пятнистости косточковых (PNRSV), карликовости сливы (PDV), неповируса скручивания листьев черешни (CLRV), потивируса шарки сливы (PPV), триховируса хлоротической пятнистости листьев яблони (ACLSV).
В серологических тестах применялся сэндвич- вариант иммуноферментного анализа (DAS-ELISA) по методике Clark, Adams (1977). Для анализов использовались диагностические наборы на основе поликлональных антител из НИИ садоводства Молдовы, фирм "Bio-Rad" (США) и Loewe (Германия) с видоспецифическими конъюгатами антител с щелочной фосфатазой. Регистрацию результатов проводили на автоматическом адсорбциометре «Stat Fax 2100» при длине волны 405 нм.
О зараженности образцов и относительной концентрации в них вирусов судили по выдаваемым прибором значениям оптической плотности продукта ферментативной реакции тестируемых образцов (А0) в сравнении с аналогичными показателями для отрицательного контроля (Ак): при AQ/AK 2 образец считался достоверно зараженным вирусом, при А0/Ак = 1,6-1,99 -вероятно зараженным, а при А0/Ак 1,6 - свободным от вирусов. Повторность анализа каждого образца двукратная.
Этапы проведения и буферы для ИФА ИФА осуществляли по следующей методике: 1. Нанесение специфических иммуноглобулинов, растворенных в покрывающем буфере в соответствии с рекомендуемым производителем наборов разбавлением, осуществляли по 100 или 200 мкл в каждую лунку с инкубацией в течение ночи при 4 С. 2. Трехкратно промывали лунки от несвязавшихся иммуноглобулинов с помощью промывающего буфера с интервалом 3-5 мин между промывками. 3. Наносили тестируемые образцы, гомогенизированные в экстрагирующем буфере в соотношении 1:10-1:12, по 100 или 200 мкл, инкубировали в течение ночи. 4. Пятикратная промывка микроплат, как описано выше. 5. Нанесение конъюгата, растворенного в конъюгатном буфере, по 100 или 200 мкл с последующей инкубацией в течение 2 и 4 ч. соответственно при 37 С. 6. Четырехкратная промывка микроплат от несвязавшегося конъюгата, как описано выше. 7. Нанесение субстрата, растворенного в субстратном буфере, по 100 или 200 мкл в каждую лунку; инкубация при комнатной температуре в течение 60-120 мин. 8. Измерение результатов спектрофотометрически при длине волны 405 нм.
В качестве положительного контроля использовали чистый препарат вируса или сок зараженного данным вирусом растения. Отрицательным контролем служил сок тестируемого растения, заведомо свободный от определяемого вируса. Для постановки ИФА использовали следующие буферы: а) покрывающий буфер (буфер присоединения) - 0,05М карбонатно бикарбонатный буфер, рН 9,6 (Na2C03, -1,59 г, NaHC03 - 2,93 г, N3Na - 0,2 г, Н20-до1л); б) промывающий буфер - рН 7,4 (Na2HP04 - 1,15, КН2Р04 - 0,2 г, NaCl 8,0 г, КС1 - 0,2, твин -20 - 0,5 мл, Н20 - до 1 л); в) экстрагирующий буфер (буфер для проб) - это промывающий буфер, содержащий дополнительно 2-4 % поливинилпирролидона (м.в. 10000 или 24000) и 0,2 % бычьего сывороточного альбумина (БСА); г) субстратный буфер: диэтаноламин - 97 мл, Н20 - 800 мл, доводят до 1л и устанавливают рН 9,8 путем добавления концентрированной соляной кислоты.
В качестве субстрата использовали 4-нитрофенилфосфат в соотношении 1 мг на 1 мл субстратного буфера.
В условиях открытого грунта косточковые культуры лучше диагностировать на вирусы в открытом грунте в мае-июне, а в закрытом грунте - в феврале-марте (таблица 9).
Сравнительная оценка эффективности выявления вируса PPV с использованием методов ИФА и ПЦР
Нами был поставлен эксперимент по выделению вируса методом силики-сорбции с использованием ГПБК в растениях сливы и вишни войлочной в период покоя с последующей детекцией методом ПЦР в реальном времени. В опыте использовали изоляты сливы № 64 и вишни войлочной № 3. Анализ флуоресценции образцов коры, древесины и смешанного образца (кора+древесина) сливы показал, что выделение вируса PPV было успешным во всех трех случаях (рисунок 4).
Наибольшая флуоресценция отмечалась при тестировании древесины сливы. Хотя флуоресценция, а, следовательно, и концентрация вируса у образца коры сливы была меньше, но экспоненциальная стадия флуоресценции началась с 10 цикла, что также является признаком хорошей очистки РНК.
Анализируя флуоресценцию образцов вишни войлочной, наибольшую флуоресценцию наблюдали в смешанном образце (кора + древесина), тогда как в древесине флуоресценция была меньше. Экспоненциальная стадия при использовании в качестве образца древесины начиналась с 19 цикла, смешанного образца - 15. Вирус в коре вишни войлочной не детектировался, что связано с его отсутствием или очень низкой концентрацией: кривая флуоресценции незначительно превышала пороговый уровень.
Интенсивность флуоресценции образцов при тестировании растений сливы и вишни войлочной в период покоя методом Realime RT-PCR на вирус шарки: 1 - слива (древесина), 2 - слива (кора), 3 - слива (кора + древесина); 4 - войлочная вишня (древесина), 5 - войлочная вишня (кора), 6 -войлочная вишня (кора + древесина); 7 - положительный контроль.
При проведении стандартного ОТ-ПЦР и использовании набора для выделения на основе хлороформа и изоамилового спирта (ООО «Агродиагностика») также не удалось детектировать вирус в тканях коры. Вероятно, это связано с особенностями анатомического строения коры изучаемых культур: кора сливы отделяется от побега с небольшим количеством камбия, а у вишни войлочной - без него.
Также в этом эксперименте присутствует образец РНК, выделенной из листьев сливы изолята № 64 и хранившейся в течение 20 дней при - 20 С. Видно, что значения репортерной флуоресценция этого образца немного меньше значений образцов сливы (кора, древесина, смешанный) и вишни войлочной (смешанный образец), но выше образца из тканей древесины вишни войлочной, хотя листья являются основным органом для тестирования методами ПЦР и ИФА.
Таким образом, мы доказали, что возможно тестирование органов растений косточковых культур в период покоя, причем предпочтительней в качестве образцов для ПЦР использовать древесину или древесину + кору.
Диагностика вируса PPV в листьях с использованием метода ИФА в осенний период обычно дает сероотрицательные результаты вследствие транслокации вируса в другие органы и снижения его концентрации в листьях ниже порога чувствительности ИФА. В связи с этим нами был осуществлен отбор листьев с изолятов, содержащих PPV, в осенний период и проведена полимеразная цепная реакция.
ПЦР анализ подтвердил наличие вируса PPV на вишне войлочной (растение № 2, изолят № 3), сливе (изолят PPV № 6) и персике (изолят № 3, растение № 1) (рисунок 5). Полученные электрофореграммы ПЦР-продуктов указанных образцов соответствовали положительному контролю, представляющему собой фрагмент кДНК PPV размером 268 пар нуклеотидов.
Часто вследствие отсутствия возможности оперативного выполнения анализа растительные образцы для ПЦР приходится хранить при отрицательных температурах. В связи с этим должен быть уточнен предельно возможный срок хранения образцов, позволяющий выявлять вирусы.
Для изучения этого вопроса методом ПЦР нами были протестированы свежие образцы листьев, листья после хранения при - 20 С в течение 1, 2 и 6 месяцев. На электрофореграммах четко видно, что вирус шарки сливы диагностировался в свежих листьях и листьях после хранения в течение 1 месяца в изолятах персика (изолят № 3), вишни войлочной (изолят № 3), сливы (таблица 17, рисунок 6). В листьях после хранения при -20 С в течение 2 и месяцев вирус PPV был диагностирован только на персике (изолят № 3). На листьях сливы и вишни войлочной результат был отрицательным, что обуславливается элиминацией вируса в листьях при хранении в течение 2 и болеемесяцев. ИЗ ПОЛучеННЫХ результатов Следует, ЧТО ЛИСТЬЯ ВИШНИ И СЛИВЫ; хранящиеся- при -20 С в: течении 2, месяцев, не пригодны для тестирования: методом ПЦР, так как этот температурный режим воздействует на вирионы иг приводит к их постепенной элиминации. Срок хранения при -20 С образцов листьев, равный 1-му месяцу, можно рассматривать как вполне допустимый для всех изученных культур. ,
В исследованиях, Добржанской с соавторами (2001) показано, что в экстрактах из предварительно замороженных при -20 С листьев, вирус PPV не удалось обнаружить. На основании полученных результатов авторами было сделано заключение о непригодности замороженных листьев для выявления; PPV в ПЦР. Однако наши исследования показали ошибочность данного заключения- и возможность: идентификации вируса PPV в ряде образцов, приготовленных из предварительно замороженных w хранившихся в. течении одного месяца листьев.
Диагностика вируса PPV в пробирочных и адаптированных к нестерильным условиям растениях сливы
Использование готовых наборов для диагностики вирусов методом ПЦР имеет как свои преимущества, так и недостатки. К преимуществам можно отнести возможность проведения массовых анализов довольно большого числа образцов. Однако в настоящее время фирмы предлагают лишь один готовый набор для диагностики вируса шарки сливы. Для остальных вирусов плодовых культур такие наборы не разработаны. К тому же использование такого готового набора не позволяет усовершенствовать (упростить, удешевить, ускорить анализ) методику анализа в силу того, что фирмы не расшифровывают ингридиенты.
Поэтому в дальнейших исследованиях наряду с готовыми наборами нами применялись оригинальные методики по выделению РНК, проведению реакции обратной транскрипции и использованию синтезированных праймеров, что позволило оптимизировать метод ПЦР. Для этого в фирме "СибЭнзим" нами были заказаны праймеры на основные вирусы косточковых культур, которые впоследствии использовались при проведении ПЦР. Однако для успешного выполнения анализа одним из ключевых моментов является совершенствование метода экстракции РНК.
В первых исследованиях использование синтезированных на заказ праймеров к PPV не позволило получить электрофореграммы, продуктов амплификации, что мы связываем со слабой отработанностью методики ПЦР и применением на различных его этапах компонентов, произведенных разными фирмами: набором для экстракции РНК "Агродиагностика", набором для обратной транскрипции и ПЦР "Биоком" и праймеров "СибЭнзим". Применение синтезированных праймеров к вирусу ACLSV в случае с одним образцом обеспечило слабую флуоресценцию продукта амплификации.
Сложность заключалась еще и в том, что в литературных источниках отсутствует единообразие в методических подходах к выполнению ПЦР. Все это показывает необходимость дальнейшего совершенствования метода ПЦР. Ктому же при выполнении ПЦР большое значение имеет химическая чистота и срок хранения препаратов. Необходимо использовать только дорогостоящие препараты для молекулярной биологии с непросроченным сроком хранения. Так, применение в наших экспериментах старого Na2 ЭДТА в составе буфера для электрофореза не позволило получить ээлектрофореграммы продуктов амплификации.
На результаты ПЦР определенное влияние оказывают такие факторы, как масса навески растительного образца, соотношение ее к объему буфера, состав лизирующих и экстрагирующих буферов, температуры отжига праймеров и некоторые другие.
Нами проведен эксперимент по оптимизации массы навески растительного образца косточковых культур для выделения вируса PPV и последующей его детекции методом ПЦР в реальном времени.
При гомогенизации листьев сливы в лизирующем буфере в соотношении 1:20 флуоресценция образца с навеской 100 мг была выше, чем у образцов с навеской 50, 150 и 200 мг (рисунок 10).
Наименьшее значение флуоресценции отмечено в варианте с рекомендованной ранее зарубежными исследователями (Menzel et al., 2002) навеской образца 200 мг. Вероятно, это связано с тем, что гомогенизация большего количества навески менее эффективна, чем меньшего. К тому же процесс гомогенизации 200 мг гораздо длительнее, чем 100 мг, что приводит к частичной элиминации вирусов и удлинению технологического процесса. С применением навески 100 мг уменьшается объем многокомпонентного лизирующего буфера, что способствует экономии реактивов.
Следовательно, оптимальная масса навески для косточковых культур составляет 100 мг (вместо рекомендуемых ранее 200 мг). При этом важным показателем является соотношение навески образца к объему буфера. Экспериментальным путем было определено, что оптимальное соотношение навески образца к объему буфера варьирует от 1:10 на вишне войлочной до 1:20 на сливе. Это связано со свойствами сока: у сливы он густой и вязкий, у вишни более разжиженный.
С целью усовершенствования метода выделения вирусной РНК из образцов косточковых культур различного происхождения (коры, древесины, листьев, плодов) нами в гуанидинтиоцианатный буфер непосредственно перед гомогенизацией образца в качестве антиоксиданта было добавлено гидроксипроизводное бензойной кислоты (ГПБК). В эксперименте использовали различные навески ГПБК для определения оптимальной концентрации этого вещества, влияющего на экстракцию вирусной РНК. При анализе продуктов амплификации вируса шарки сливы выявлено, что оптимальные навески ГПБК составили 20 и 30 мг (рисунок 11).
