Введение к работе
Актуальность темы исследований. В настоящее время серьезным препятствием роста урожайности многих культур, в том числе и таких экономически ценных, как бобовые, являются вирусные заболевания . Наиболее радикальным способом защиты растений от фитопа-тогенных вирусов считается создание и использование в производстве устойчивых сортов и форм." Успех селекционной работы в значительной степени зависит от: уровня теоретических исследований в области иммунитета.растений..Задача фитовирусологии состоит в том, чтобы как можно глубже изучить механизм устойчивости с тем, чтобы сделать возможной разработку.новых подходов к созданию устойчивых форм растений и разработать надежные критерии и способы дифференциальной оценки устойчивости селекционного материала к вирусам на. разных уровнях (Коваленко А . Г . , IS83).
В многочисленных исследованиях, посвященных физиологочЗио-химическим аспектам взаимоотношений растений и фитовирусов, показано, что инфекция оказывает существенное влияние на процессы накопления и расхода энергии зараженного растения. Причем наибольший интерес: привлекает специфика изменения таких основных энергетических процессов кислородообмена, как фотосинтез и дыхание, которые следует рассматривать в качестве интегральных механизмов, регулирующих формирование системы растение-хозяин-патоген (Серова З.Я'. идр ; , 1282) . 3 настоящее время указанные процессы кислородообмена изучаются в основном с помощью чувствительного и быстрого, полярографического (амперометрического) метода (Зеленский М.И.г-1986) , который и лег в основу данного исследованиям Функционирование фотосинтетичоского и дыхательного аппарата<определяется. : структурным и Функциональным состоянием
2 основных органолл зеленого растения: хлоропластов» ядер и митохондрий, мембранным комплексам которых принадлежит важная роль в устойчивости к повреждающему действию вируса. Успешно используется сейчас для изучения кислородообменных процессов и более новая модель - изолированные протопласты, восполняющие отсутст- вие промежуточной системы между изолированными органоллами и тканями листа. Протопласты весьма интенсивно применяются также в фитовирусологических исследованиях ( Muraktshi , 1984;
"WooJ , 19 85) , но практически отсутствуют данные по влиянию вирусного инфицирования протопластов на их метаболизм, в частности на фотосинтез и дыхание. Изучение данного вопроса может внести существенный вклад в познание физиологических основ фитоиммунитета, что откроет новые подходы к регулированию виру-'соустоичивости и созданию оффективянх экспресс-методов её оценки.
Целью данного исследования является изучение возможности использования полярографического метода определения кислородо-обмона для оценки устойчивости бобовых культур к широко распространенному вирусу желтой мозаики фасоли (ВШ5 ) . Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
1. выявить влияние механического и векторного инфицирования ЕШБ на кислородообмен протопластов и хлоропластов, митохондрий и ядер, выделенных из листьев различных по устойчивости сортов гороха в динамике патогенеза;
2 . установить дифференциацию фотосинтетической и дыхательной активности изолированных протопластов-различных по устойчивости сортов гороха при инфицировании В Ш . \N vitro , для чего отработать методику инфицирования;
3. установить изменения кислородообмона изолированных хлоропластов, митохондрий к ядер различных по устойчивости.сортов
гороха при инкубации с очищенным препаратом EEHS'-w vitro ;
-
установить, корреляционные зависимости влияния EDS на изменение фотосинтетическои активности протопластов и хлоропдас-тов гороха в модельных экспериментах ш vitro ;
-
провести оценку устойчивости к BBS сортов и видов бобовых культур с .различной половой порахаемастью возбудителем на основе полярографического метода определения кислорода.
Научная новизна результатов. Епервые проведено инфицирова
ние изолированных протопластов контрастных по устойчивости сор
тов гороха вирусом желтой козааки фасоли w vitro с посладущим '
. определением их фотосинтетической и дыхательной активности поля
рографическим методом. '-.'"
Исследован характер изменения фотосинтетической и дыхательной активности протопластов и клеточных орган елл, выделенных из' контрастных по устойчивости к КУ.Э сортов гороха в динамике патогенеза. При этом' для инфицирования растений- использовались различные штаммы возбудителя.
С помощью иммувофлуорвсцентного метода окрашивания прото
пластов показано,; что иммунный к ВаД сорт горох Перфекшя явля
ется факультативно.устойчивым., *
Впервые установлена качественная дифференциация фотосинтв-тической.'активности изолированных хлоропластов контрастных по устойчивости сортов гороха, вызванная инкубированием органелл с очищенным препаратом ECS т vitro , на основе чего разработана методика экспресс-оценки вирусоустойчивости бобовых культур.
Установлены-корреляционные зависимости.изменения фотосинте
тической активности протопластов и-хлоропластов гороха под влия
нием Ш2Л5.. . ' " '
Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на научной конференции молодых ученых TSC АН*СССР (IS65 г ) , на научной конференции молодых ученых в Университете дружбы народов имени ПатрксаЛумумбы (I9S6 г ) , на научных конференциях профессорско-преподавательского со става'сельскохозяйственного'факуль-' тета УДИ (IS85, 1986 гг) , на расширенном заседании кафедры защиты растений УДН (1987 г) и кафедры сельскохозяйственной фитопатологии ТСХА (1987 г ) . По результатам; исследований опубликовано 2 статьи, подана заявка на изобретение'за №4147 8 91'и получено положительное решение ГоскомкзобретениЙ от 2 8.05.87.
Объем работы. Диссертация состоит'йз введения, обзора лите
ратуры, экспериментальной части, включающей 4 главы, выводов и
списка цитированной литературы, насчитывающего 3 09 наименований,
в том числе 237 на иностранных языках. Работа изложена на 147
-страницах масинописного текста, содержит 35 таблиц, II рисун
ков, 4 фотографии. . <ь
?/есто. УСЛОВИЯ, материал и методика исследований. Все иссле
дования проводкдись в Главном ботаническом саду АН СССР на базе
отдела защиты растеши! (группа вирусологии) и лаборатории биотех
нологии. .
3 качестве модели: была выбрана система "вирус желтой мозаики фасоли - бобовые растения". Непосредственными объектами исследования являлись три идентифицированных-тамга ВВ.Н> (BosL.et3i. , 1974): D25 (типичный),.Е1СЗ (гадтой мозаики гороха) и EI97 (некроза гороха) и два контрастных по восприимчивости к ЕЕЛЙ сорта гороха: Рамонсквй 77 (восприимчивый) и Перфектен (невосприимчивый, считаыцийся иммунным) .
Очистку ЕЗД5 проводили по методике Хаттинга ( HutbNga , 1973, 1974) в HciioJl модификации на ультрацентрифуге "Всокпаы
5 L8-5S". Концентрации вируса определяли на спектрофотометре 05-4. Качество очищенных вирусных препаратов оценивали элект-ронномикроскопичсским методом на электронном микроскопе "PKthps ЕЛ-301". На основе полученных препаратов Н25Ф была приготовлена антисыворотка с титром 1:1024.
Ккслородообмен при фотосинтезе и дыхании протопластов и
органвлл определяли полярографическим методом. Был использован
универсальный полярограф СН-І05 (производства ЕНР) с модифици
рованным электродом Кларка (Трушанов, 1973). .Платиновый катод
был отделен от реакционной среды тефлоном толщиной 20 мкм. Чув
ствительность ячейки - 0,01 А*д/моль, калибровку скалы поляро-
графа.проводили регулярно. *
Выделение протопластов бобовых культур проводили по описанной методике ( PojNar et al. , IS84) в нашей модификации: РН среды выделения доводили до 7.0; в среду дополнительно вводили HEPES-буфер (50 мм), декстран сульфат калия (0,5%). Концентрация целлшазы "OKozufcaR- 10й ~ 1%, мацерозима R- 10 - 0,3$. Подсчет протопластов осуществлялся в камере Горяева. Жизнеспособность изолированных протопластов оценивали окрашиванием мо-тиленовым'синим (Hooley, № Cai-they, 1980); Количество зараженных вирусом протопластов определяли иммунофлуоресценгным методом (Otsuki.TakeW, I9S9), для выделения глобулиновой фракции использовали полученную нами антисыворотку к E2.S.
Подсчет инфицированных окрззенных ШТЦ протопластов осуществляли с помощью микроскопа "Polyvar " (Австрия). Для подтверждения репликации вирионов в изолированных протопластах проводили электронномикроскопкческий анализ ультратонких срезов протопластов. Ззливку.. протопластов в эпон-аралдит осуществляли общепринятыми 1.:етока?.'Д, в качестве буфера на стадии фиксации ис-
пользовался HEPES (50 мм) в 0,6 М растворе сорбита.
Хлорофилл в суспензии протопластов определяли по Арнону (1949) . Протопласты культивировали в среде Аоки-Такебе (1969) .
Хлоропласты выделяли по модифицированной методике Робинсон и Вискич (RobiNSON .Wiskich , 1977) . Интактность хлоропластов оценивали по Лаяли (Lilicy et ai. , 1975) . ИзоЗшрованио митохондрий и определение их дыхательной активности проводили по описанной методике (NacreN, HaatnaN , 1980) . Ядра выделяли по методике Чен (СЪе.ы, 1975), дыхание по Рубину (1973). Статистическая обработка данных проводилась по Доспехову (1985) . Использовался метод оценки существенности разности сопряженных выборок, корреляционный и дисперсионный анализ.
