Введение к работе
-
' Актуальность темы: Необходимым условием эффективной за-
щиты растений от вирусных заболеваний является ранняя-и точная
. диагностика зараженности растений, семенного и посадочного материала - важная часть селекции и семеноводства многих культур. Решение этой задачи возможно при условии применения высо-
' нечувствительных и достоверных и шесте с тем, простых и доступных для практики методов обнаружения вирусов..
Большая роль в решении этой задачи принадлежит методам .иммунодиагностики, вследствие их доступности и быстрого полу-.чения результатов. Наиболее чувствительным из них является им--муноферментшй анализ /ИФА/, 'обнаруживающий вирусы даже в очень ( низких концентрациях, это позволяет.резко поеысить достоверность диагностики зараженности растительного материала. Однако
, возможности ИЗА используются в практике селекции и семеноводства далеко не полностью." В частности, не реализуется одно из его важнейших преимуществ' перед другими методами диагностики
'- возможность получения количественных результатов." Кроме того,
' известно, что достоверность.отрицательных результатов ИФА отио-
- сительна, поэтому продолжаются поиски методов,/выявляющих зараженность'испытуемого образца независимо or концентрации вируса
,в нем..Одним из таких методов является метод."посредника"' /Шмыгля В.А., Макаев С.Щ.*,1985/. Настоящая работа посвящена испытанию И, для определения типов и степени устойчивости то-' мата к вирусу табачной мозаики /BTJi/ и применению метода "пос-
редника" для обнаружения.передачи* некоторгх вирусов сееенлі'-к
томата. * - ^/1 - &03?О _'_
' " Q6a вопроса исследования представляют практический интерес для селекции тсмата на" устойчивость к ВТМ и для вьфаіцива-" кия семян этой культуры,- свободных от вирусных ищекций.
ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИИ. Цели исследований состояли
в разработке способа количественной оценки типа и степени
устойчивости селекционных образцов томата к ВТМ, а также в испы
тании метода' "посредника" для обнаружения передачи некоторых
вирусов семенаїлі томата.' В работе били поставлены-следующие
задачи: " "
-
Испытать нммун'о^ерментный анализ для количественной оценки устойчивости исходных и селекционных образцов томата к ВТМ и разработать рекомендации по методике такой оценки,
-
Провести испытание метода "посредника" для обнаружения передачи вируса табачной мозаики /ВТ1У, М-вируса картофеля /МВК/ и вируса бронзовости томата /BET/ семенами томата;
"НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТіЯЕСНАЯ ЦЕННОСТЬ ИССЛЕДОВАНИЙ. ;
-
Впервые показано, что иммунофермсцтлый анализ монет быть * применен для оценки относительной устойчивости к ВТМ исходных, гибридных'образцов тсмата, при отом достигается значительно большая точность и достоверность.
-
Метод "посредника" vckot быть использован для исследований . семенной передачи вирусов, d также для контроля зараженности партий семян. - , ' г ч
-
Впервые установлено, что М-'вирус карто^еляи вирус Оронзо-вости^ томата передаются семенами тсмата.
АПГППАЦИЯ РАП.Ти. Результаты исследований доложены на научной конференции ТСХЛ /декабрь IS83 года/; ' ."
-.3 - * .'
" ", ОБЪЕМ РАБОТЫ,- Диссертационная'работа положена на 122 * страницах машинописного текста, включает'23 таблицы и 2 рисунка. Она состоит из.введения, 5 глав, выводов и "практических . рекомендаций. Список использованной литературы включает 112L наименование. ..---'-
I. УСЛОВИЯ 'И МЕТОДШІ ПРОВЕДЕНИЯ ІІССЗЩЦОВАІСІЙ.
Исследования выполнены в I986-IQ68 гг. в лаборатории' защиты растений ТСХА.
І.І.' ШС.ЕНЙНИЕ ЇГЛ ДОЯ ОЦЕНКИ УСТОЙЧИВОСТИ ТОМАТА к вта.
Анализировали образцы, гомозиготные и гетерозиготные по генам
Тт-2 и Тщ-2 , а такхе'беэ генов устойчивости к ВТМ /для срав- ,
Ненйя/ из коллекционных и." селекционных питомников Молдавского
НИИ овощеводства и Лаборатории овощеводства ТСХА., Часть'нсследо-.'
ванных образцов в предшествующие годы проела проверку на устой
чивость к ВИ по существующей методике /механическая инокуля
ция и визуальная диагностика зapaeннocти/. В год 'анализа боль
шинство образцов"было инокулировано ВТМ в молодом возрасте -
/семядольные листья - два настоящих листа/. ' '
Инокуляцию.проводили с применением карборунда, растения
выращивали в зимних и весенних теплицах. Растения до инонуляши
выдерживали в темноте в течение суток с целью повышения объек
тивности заражения. У растений предназначенных для ииокуляїзш,
по два листа.припудривали порсаком карборунда, затем наносил і
инокулш.и растирали его *,
по поверхности.листа кусочком поролона. Инокулюм готовили из
листьев турецкого табака /N.cotiana tabaeum L J, краденного
обычным /зеленым/ штаъо/бм ВШ. , ' , -
Кз листьев отжимали сок ручным прессом, в емкости к выжатому соку добавляли стабилизирующий раствор 72# Д1ЭКА.-//а/ для МВК и ВБТ. Для ВТМ стабилизации инокулюма не требуется, т.к. . этот вирус длительно сохраняет инфекционность в соке.
Инокулированше растения затеняли в течение суток, затем 'содержали при рассеянием свете и температуре 18-25.
В МКИИО листья для Ий\ отбирали в защищенном грунте"в фазе
ііачала созреваїшя плодов первой кисти, т.е. примерно через два
месяца после инокуляции. * , ~\
-В открытом грунте - в фазе цветения первой кисти, т.е. примерно через полтора месяца после инокуляции»
При оценке образцов в теплицах Лаборатории защиты растений ТСХА. пробы* листьев отбирали в фазе цветения первой кисти, т'.е. примерно через I месяц после инокуляции.
Во всех случаях от 2-4 растений катщого образца отбирали по одному нормально развитому сложному листу среднего яруса. Сок выжимали отдельно из каждого листа, разбавляли буферным раствором, затем вносили в лунки аналитической"платы для И5А.
Кммунофэрментшй анализ проводили по методике "сэндвич-варианта" /Clat-L Mf, Adams К N ,1977 г./ в модификации % -"micro Elt&A ", / Eichter 1 eb at ,1981, Re.henba. her D, 1984/, с применением коїшогатов, меченных перексидазой."Результаты получали с помощью автоматического ридера Oynalech МР-6С0 при длине волны 490 ict. В каждой серии анализов было два контроля: сок здоровых растений /отрицательный контроль/ и сок рас-
тений, заведомо заражеїшьвс диагностируемым вирусом /пологи- -
тельный контроль/. . , . '
. Для достоверного разграничения фоновых значений абсорбции
/A^qq/ и положительных результатов применяли следуюіцуго формулу:
Р = X + ЗЕ / Caspev їзді/, ГдЄ ' , "._*
- Р - порог достоверности положительных результатов;
X - среднее значение A^gg отрицательного контроля"/здоровый -
материал/; - -
- ' ЗЕ - тройное значение максимального отклонения A^gg от сред
него в"отрицательном контроле. Все значения Ад од выше Р счита
ются положительными результатами. -
При оценке устойчивости селекционных образцов томата к
ВЗМ с применением И2А получали не менее 4 значений A^gg для
кодгого образца. Все образцы, проанализированные в одной серии,,
т.е. в одном возрасте, "при одинаковых условиях вегетации, сро
ках инокуляции и анализа, ранжировали в"порядке возрастания
максимальных значений А^ад для каждого образца. Полученные ва
риационные ряда анализировали статистическими "методами с целью
определения порога положительных результатов /Р/ и разделения
образцов на группы по устойчивости к ВВІ. В тех случаях, когда
результаты ИИ. сока здорового табака оказывались віяло', чем у
первых образцов серий," в качестве отрицательного _ /здорового/ ,
контроля брали значения ИИ. первых трех или четырех образцов
вариационного ряда. . , -
Для разделения'серии на группы'по устойчивости все полученные значения A4gg подвергали дисперсиошіет.'у, анализу по методико многоакторного опыта /Доспехов Б.А.,1981/. v " Полученные при этом значения контроля и HCPgg служили
критерием для определения границ между группами по устойчивое-,
ти: , ..-..,
1-я группа - максимальные значения A^qq не выше X + ІШР^; 2-я группа - максимальные значения А^од но Е1ЛПе X + ЗНСРдд; 3-я группа - максимальные значения А4уо ^^6 ^ + ^KCPq^;
В некоторых опытах была-применена другая схема: по'2-4 растешія катдого образца оставляли без инокуляции, выращивали до анализа в тех ло условиях,' что и инокулированные растения и анализировали' в один день. Значения ИІА обрабатывали статистически по к&чщему образцу в отдельности по модели однофактор-ного опыта, где контролем служили неинокулированные растения. В этом случае образцы оценивали как по величине максимальных значений ИЗ&, так и по соотношению фактических различий A^gg инокулнровашгых и нешюкулнрованшх растений с HCPq^- -
1.2. ТРАНСПГДНТАІЩ ПР0Р0СТКСЗ И ЄРАПАЕНТОВ ТКАНИ НА ОТДЕЛЕННЫЕ Л'.СТЬЯ TQ.IATA II ТАБАКА /метод "ПОСРЕДНИКА"/.
1 Трансплантация живой растительной ткани на системно-вос
приимчивые растешія позволяет диагностировать крайне низкие
концентрации или неактивные формы вирусов, недоступные для дру
гих методов диагностики вирусов в растениях, в том числе в то-,
матах. В трансплантационной системе происходит активизация ви- -
руса и размножение,:его в клетках системно-восприимчивого расте
ния с образованием типичных вирусных частиц с обычными свойст-
.вами. Через некоторое время вирус может быть' обнаружен в рас
тении-акцепторе сравнительно простыми методами. .-
В наших опытах при^изученин передачи семенами томата II-ви-
руса картофеля /МВК/-Ш использовали листья томата сорта Нев
ский и табака Добни /M.coiiana debneyi.Domm, оба растения вос
приимчивы к вирусом Ни S. картофеля/. Для изучения семенной
передачи вируса бронзовости томата /ВБТ-/-- листья махорки
/Mitohana rjgl.ca L /f семенной передачи BT.t - листья турецко- , -
го табака / N tabacum L -/'. Растения томата и табака выра
щивали з изолированных боксах теплицы Лаборатории защиты расте
ний ТСХА. в вазонах со смесью торфа, порогноя и песка. В осенне-
зимний период растения досвечивали лампами "ДРЛ2-400 такім об
разом, чтобы световой період составлял не менее 16 часов. Для
трансплантации использовали растения,- здороше по внеогнему ви
ду и проверенные серологическим методом на .отсутствие вирусных
инфекций. Семена томата, служившие подопытным материалом для
изучения семенной передачи', были получены от растений,' заражен
ных соответствующим вирусом /МВК, ВБТ или ВИ.І/. Проростки Еыра-
щивали в чашках Петри на влажной фильтровальной бумаге или в
перлите. Для диагностики зараженности взрослых растений исполь
зовали ЧереШКИ ЛИСТЬеВ. " '--''...
* МЕТОДИКА- ТРАНСПХДНТАЩГЛ., Для трансплантации отбирали молодые" полностью развитые листья среднего яруса от растений до цветения. Проростки томата для трансплантации брали в фазе пол- ' ного развития семядольных листьев, затем срезали у корня, под-семядольное колено клиновидно'заостряли. На листе акцептора у основания пластинки делали Т-образный надрез и в продольную часть надреза вставляли заостренную часть проростка или черенка. После трансплантации листья с'трансплантантами раскладывали в лотко на влажную фильтровальную бумагу, накривали стеклем и инкубировали 12-15 дней при нзпрерывноы освещении япониейен-
тными или ртутными лампами с интенсивностью около 4000~Лк.
Контроль - листья тех же растений-акцепторов без трансплантации, после инкубации листья анализировали с помощью капельного мотода на зараженность МВД или ВТ!!. ВБТ диагностировали путем механической инокуляции соком листьев - "посредника" молодых растений махорки / М rusbca, L /. При наличии инфекции в используемом" материале на инокулировашшх растениях появлялись типичнее признаюі ВБТ: крупные некрозы на инокули-рованных листьях, хлороз, затем отмирание верхушки.
