Содержание к диссертации
Введение Глава 1.
1.1
1.2 1.2.1
1.2.2
1.3 1.4 1.5 1.6
1.6.1
1.6.2
1.6.3 1.6.4
1.6.5
Стр.
4
Обзор литературы 9
Трансгенные культуры: распространение и 9
использование в сельскохозяйственном производстве
Вертикальный перенос генов 12
Факторы, определяющие степень риска переноса 15
генов
Перенос генов к другим возделываемым сортам 20
растений
Биобезопасность трансгенного картофеля 22
Биобезопасность трансгенной кукурузы 27
Биобезопасность трансгенной сои 34
Методические подходы к определению наличия 38
трансгенов в пищевых продуктах и кормах
Методы оценки содержания генетически- 39
модифицированных источников
Методы на основе полимеразной цепной реакции 40
41 генетически- 42
(ПЦР)
ПЦР-идентификация трансгенов
Неспецифическая ПЦР-детекция
генетически- 43
модифицированных источников
Другие методы детекции
модифицированных источников
Апробация методов ГМ-детекции
Материалы и методы исследований
Объект исследования
Использованные материалы и оборудование
Химические реактивы
2.2.2
2.3
2.3.1
2.3.2
2.3.3
2.3.4
Оборудование 47
Использованные методы 48
Выделение ДНК из различных тканей растения 48
Амплификация геномной ДНК 50
Электрофорез ДНК в агарозном геле 51
Фотодокументирование продуктов амплификации 52
Глава 3. Результаты и обсуждение 53
3.1 ПЦР-детекция трансгенных растений 53
3.2 ПЦР-идентификация трансгенных растений 58
-
Влияние различных веществ на специфичность и 61 (или) выход ПЦР-реакции
-
Полуколичественная оценка генетически- 63 модифицированных источников (ГМИ)
-
Оценка риска вертикального переноса генов от ГМ- 65 картофеля
-
Оценка риска вертикального переноса генов от ГМ- 73 кукурузы
Выводы 95
Практические рекомендации 97
Список литературы 98
Приложения 118
Введение к работе
Актуальность работы. Успехи современной биотехнологии привели к созданию генно-модифицированных (ГМ) растений и их широкому внедрению в практику сельскохозяйственного производства.
Перспективным направлением в биологической защите растений является использование генно-модифицированных биозащищенных от вредителей сортов, а также сортов, устойчивых к гербицидам. Это особенно важно, если учесть, что многие вредители сельскохозяйственных культур приобрели резистентность к большинству химических инсектицидов, следствием чего является увеличение объемов их внесения, загрязнение окружающей среды и в итоге потери урожая.
Значительный вред урожаю также наносит конкуренция со стороны сорных растений. В данной ситуации имеет большое значение использование раундап-защищенных сортов сои и кукурузы, так как Раундап широко применяемый гербицид, известный своей очень высокой эффективностью и имеющий высокие показатели безопасности. Широкое использование ГМ-растений в сельскохозяйственном производстве ставит на повестку дня вопросы их биобезопасности.
Одним из аспектов биобезопасности ГМ-культур является оценка вертикального переноса генов от ГМ-растений к культурным сортам и диким сородичам. Потенциальная опасность здесь заключается в том, что новые привнесенные признаки устойчивости дадут дополнительные преимущества диким видам растений, и будут способствовать их быстрому распространению.
В этой связи актуальность наших исследований определяется необходимостью инструментального контроля ГМ-растений и получаемых на их основе продуктов и кормов для животноводства. Основным методом для быстрого и эффективного мониторинга ГМ-растений в настоящее время является ПЦР (полимеразная цепная реакция). Однако используемые в нашей стране методики ПЦР-детекции не достаточно эффективны и требуют
5 доработки. До сих пор не разработаны рекомендации по безопасному выращиванию ГМ-культур, и, в частности, не исследованы вопросы переноса генов от трансгенных растений другим представителям биоценоза.
Цель и задачи исследований. Цель настоящей работы - оценить риск вертикального переноса генов от трансгенных биозащищенных растений кукурузы и картофеля к культурным сортам и диким сородичам. Для достижения поставленной цели в задачи исследований входило: модифицировать методику выделения препаратов ДНК из семян растений, для их анализа методом полимеразной цепной реакции (ПЦР); модифицировать методы ПЦР-детекции и идентификации трансгенных растений; - разработать методы полуколичественной оценки генетически- модифицированных источников (ГМИ); разработать методику оценки риска вертикального переноса трансгенов на примере ГМ-кукурузы, устойчивой к гербициду Раундап, и ГМ-картофеля, устойчивого к колорадскому жуку; определить степень риска и разработать меры по предотвращению вертикального переноса генов от раундап-защищенной кукурузы и Bt-защищенного картофеля к культурным сортам и диким сородичам.
Научная новизна. В настоящей работе: представлена модифицированная методика выделения ДНК по Дорохову и Клоке (1997) применительно к семенам растений, пригодная для проведения ПЦР; повышена эффективность методов детекции и идентификации трансгенных растений посредством оптимизации условий проведения ПЦР-реакции и подбора специфичных праймеров, а также использованием в реакции дополнительных положительных контролей; разработана методика полуколичественной оценки генетически- модифицированных источников на основе амплификации участка целевого гена; - оценен риск и разработаны меры по предотвращению вертикального переноса генов от генно-модифицированных биозащищенных растений к диким сородичам и другим культурным сортам.
Научно-практическая ценность работы. Результаты опытов по вертикальному переносу генов от генно-модифицированных биозащищенных растений к культурным сортам и диким сородичам позволяют оценить риски интродукции трансгенных растений в окружающую среду, определить особенности их выращивания, а также защиты от вредителей и сорняков. Внедрение в сельскохозяйственное производство генно-модифицированных биозащищенных от колорадского жука сортов картофеля и Раундап-защищенных сортов сои и кукурузы будет способствовать сокращению использования химических средств защиты, что приведет к уменьшению потерь урожая и к улучшению состояния окружающей среды. Для целей более эффективного мониторинга ГМ-растений и продукции на их основе рекомендуется использовать модифицированные методы ПЦР-детекции, а также разработанные методы полуколичественной оценки ГМИ.
Основные положения, выносимые на защиту:
ПЦР-детекцию необходимо проводить с дополнительным положительным контролем, для сои - амплификация участков генов актина (350 п.н.) и лектина (318 п.н.), для кукурузы - генов актина (350 п.н.) и зеина-19 (387 п.н.) и для картофеля - пататина (216 п.н.), что позволяет проверить качество (чистоту) препарата выделенной ДНК, а также проверить другие химические компоненты ПЦР-реакции во избежание ложно отрицательных результатов; - разработанный нами метод полуколичественной оценки ГМИ позволяет проводить не только детекцию трансгенов в зерне и семенах, но и определять
7 их количественное содержание без использования дорогостоящего оборудования; - риск вертикального переноса генов от трансгенного картофеля можно считать минимальным, изоляция трансгенного картофеля от других сортов не требуется. Риск вертикального переноса генов от ГМ-кукурузы к культурным сортам существует. Поля с трансгенными сортами кукурузы должны быть удалены не менее чем на 200 м от полей с традиционными сортами. При этом рекомендуется использовать защитные мероприятия, а частности, путем создания барьеров на пути движения пыльцы.
Апробация работы. Результаты работы докладывались на Всероссийской научно-технической конференции "Биотехнология 2003" (Сочи 22-26 сентября 2003), на Всероссийском конгрессе «Здоровое питание населения России» (Москва 12-14 ноября 2003), на 2-м Московском международном Конгрессе "Биотехнология: состояние и перспективы развития" (Москва, 10-14 ноября 2003), на 5-й региональной научно-практической конференции молодых ученых «Научная обеспечение агропромышленного комплекса» (Краснодар, 18-19 декабря 2003 г.), на II региональной научно-практической конференции молодых ученых и студентов Краснодарского края «Медицина и здравоохранение». - Анапа, 21-23 апреля 2004, на III ВОГиС) Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития (Москва 6-12 июня 2004), на международной научно-практической конференции «Биологическая защита растений - основа стабилизации агроэкосистем» (Краснодар, 29 сентября - 1 октября 2004 г), на 7-й региональной научно-практической конференции молодых ученых «Научное обеспечение агропромышленного комплекса».-Краснодар, 8-9 декабря 2005 г.
Декларация личного участия автора. Диссертация содержит фактический материал, полученный лично автором в течение 2002-2005 гг. Полевые опыты по вертикальному переносу генов кукурузы и определению видового состава
8 насекомых проводились совместно с лабораторией гербологии ГНУ ВНИИБЗР
РАСХН. Личный вклад автора в получение результатов исследований составляет 80%.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 работ.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 128 страницах машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы, методики проведения исследований, результатов исследования, выводов, практических рекомендаций, приложений. Содержит 8 таблиц и 30 рисунков. Список использованной литературы включает 171 источник, в том числе 157 на иностранном языке. Диссертация является самостоятельным завершенным научным трудом.
Автор считает своим долгом выразить глубокую благодарность и признательность научным сотрудникам ГНУ ВНИИБЗР РАСХН, содействовавшим выполнению настоящей работы и в особенности научному руководителю диссертационной работы к.с.-х.н. В.И. Килю; к.б.н. А.П. Савве; д.с.-х.н. В.Е. Болахоненкову; д.б.н. Е.П. Угрюмову; к.б.н. В.Я. Исмаилову и сотруднику КубГУ д.б.н. Ю.А. Волчкову.
