Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 10
Терминология 10
1.1. Устойчивость растений к болезням 11
1.2. Индуцированная устойчивость растений, ее виды 15
1.2.1. Системная приобретенная устойчивость 15
1.2.2. Системная устойчивость, индуцируемая ризосферними бактериями 17
1.2.3. Спектр генов арабидопсиса, экспрессируемых при активации защитных ответов на некрозообразующий патоген, салициловую кислоту, метилжасмонат и этилен 20
1.3. Элиситоры устойчивости растений к болезням 21
1.3.1. Элиситоры общих защитных отетов растений 22
1.3.1.1. Флагеллин 22
1.3.1.2. Бактериальный фактор элонгации. 23
1.3.1.3. Бактериальные белки холодового шока 23
1.3.1.4. Консервативная область трансглютаминаз видов рода Phytophthora - пептид Рер-13 25
1.3.1.5. Липополисахариды 25
1.3.1.6. Пептидил-пролил цистрансизомераза ю бактерии P. Jluorescens. 27
1.3.1.7. Хитин и хитозаны 27
1.3.2. Элиситоры устойчивости растений, участвующие в процессе взаимодействия растение - патоген 27
1.3.2.1. Факторы авирулентности 27
1.3.2.2. Харпины 28
1.4. Механизмы распознавания растением химических детерминант микроорганизмов... 30
1.4.1. Молекулярные детерминанты патогена, PAMPs 30
1.4.2. Распознавание PAMPs у животных и растений 32
1.4.3. Распознавание растением факторов авирулентности патогена 36
1.4.4. Доступность PAMPs для растений 39
1.5. Практическое применение индуцированной устойчивости растений для их защиты от
болезней 39
1.5.1. Обработка растений индукторами устойчивости 39
1.5.2. Создание трансгенных растений, устойчивых к фитопатогенам 40
1.5.2.1. Экспрессия в трансгенных растениях генов антимикробных веществ 42
1.5.2.2. Экспрессия в растениях R-генов близкородственных растений 43
1.5.2.3. Экспрессия в растениях генов элиситоров, вызывающих реакцию СВЧ 44
Глава 2. Материалы и методы исследований. 46
2.1. Материалы 46
2.1.1. Химические реактивы и ферменты, использованные в работе 46
2.1.2. Бактериальные штаммы. 48
2.1.3. Плазмиды 48
2.1.4. Фитопатогенные микроорганизмы . 48
2.1.5. Пептид cspl5 49
2.1.6. Суспензионная культура клеток табака 49
2.2. Методы 50
2.2.1. Трансформация табака методом «листовых дисков» 50
2.2.2. Генетический анализ трансгенных растений поколения ТІ 51
2.2.3. Выделение растительной геномной ДНК 52
2.2.4. Полимеразная цепная реакция 52
2.2.5. Выделение тотальной РНК. 53
2.2.6. Анализ экспрессии CspD гена на уровне синтеза мРНК с помощью обратной транскрипции с последующей ПЦР. 54
2.2.7. Определение уровня экспрессии целевого гена с помощью ПЦР в реальном времени. 54
2.2.8. Выращивание трансгенных растений табака в климатической камере 56
2.2.9. Культивирование гриба Alternaria longipes (Ellis &Everh.) 56
2.2.10. Оценка трансгенных растений табака на устойчивость к патогенному грибу A. longipes. 56
2.2.11. Оценка трансгенных растений табака на устойчивость к вирусу табачной мозаики 57
2.2.12. Оценка активности пептида csp!5 в системе табак - ВТМ 57
2.2.13. Изучение скорости СВЧ реакции в тканях картофеля при несовместимом взаимодействии после обработки пептидом cspl5 58
2.2.14. Изучение влияния пептида cspl5 на прорастание спор гриба Stagonospora nodorum 58
2.2.15. Проверка активности пептида cspl5 с использованием пары пшеница - возбудитель септориоза (5. nodorum) 58
2.2.16. Инфильтрация пептида cspl5 в межклеточное пространство листьев табака 60
2.2.17. Определение содержания салициловой кислоты в тканях картофеля, обработанных пептидом cspl5 60
2.2.18. Измерение защелачивания питательной среды в суспензионной культуре клеток табака после обработки элиситором 61
Результаты исследований и их обсуждение 62
Глава 3. Анализ нуклеотидной и аминокислотной последовательностей гена и белка MF2 (CspD, номер в GenBank AY272058) 62
3.1. Анализ первичной структуры нуклеотидной и аминокислотной последовательностей гена и белка MF2 62
3.2. Анализ нуклеотидной последовательности гена CspD с целью определения возможности его эффективной экспрессии в растениях табака 64
Глава 4. Получение трансгенных растений табака с геном CspD. Биотесты с трансгенными растениями 69
4.1. Конструирование бинарного вектора pBilt7, несущего бактериальный ген CspD, для трансформации растений 69
4.2. Агробактериальная трансформация 71
4.3. Молекулярный анализ трансгенных растений 72
4.4. Сравнение уровня экспрессии в трансгенных линиях табака с помощью ПЦР в реальном времени 75
4.5. Определение числа локусов в геноме растений, в которые произошла вставка Т-ДНК. Наследование вставки в поколении ТІ 77
4.6. Оценка устойчивости трансгенных растений табака 80
4.6.1. Оценка трансгенных растений табака на устойчивость к патогенному грибу A. longipes. 80
4.6.2. Оценка трансгенных растений табака на устойчивость к вирусу табачной мозаики 82
Глава 5. Изучение элиситорных свойств пептида cspl5 87
5.1. Исследование способности пептида cspl5 индуцировать устойчивость в системах
растение-хозяин - патоген 87
5.1.1. Оценка активности пептида cspl5 в системе табак -ВТМ 89
5.1.2. Изучение скорости СВЧ реакции в тканях картофеля при несовместимом взаимодействии с патогеном после обработки пептидом cspl5 90
5.1.3. Изучение влияния пептида csp!5 на прорастание спор S. nodorum 91
5.1.4. Проверка защитной активности пептида cspl5 в паре пшеница -5. nodorum 91
5.2. Изучение защитных реакций растения в ответ на обработку пептидом cspl5 93
5.2.1. Инфильтрация пептида csp 15 в межклеточное пространство листьев табака для обнаружения его способности вызывать реакцию СВЧ 94
5.2.2. Анализ содержания салициловой кислоты в тканях картофеля, обработанных пептидом cspl5 .95
5.2.3. Оптимизация методики тестирования ранних защитных ответов растения в суспензионной культуре клеток табака. Проверка активности пептида cspl5 в культуре клеток табака. 96
Выводы 99
Список опубликованных работ по теме диссертации
- Индуцированная устойчивость растений, ее виды
- Фитопатогенные микроорганизмы
- Анализ нуклеотидной последовательности гена CspD с целью определения возможности его эффективной экспрессии в растениях табака
- Сравнение уровня экспрессии в трансгенных линиях табака с помощью ПЦР в реальном времени
Введение к работе
Защитные механизмы растений развивались в процессе длительной эволюции и, следовательно, способны обеспечить надежное противостояние фитопатогенам. Поэтому наиболее привлекательным в защите растений от болезней является использование естественного защитного потенциала самих растений. Такой подход является более безопасным, чем применение ксенобиотиков, поскольку в этом случае в окружающую среду не вносятся вещества, оказывающее негативное влияние на биосферу. Поскольку одним из механизмов фитоиммунитета, обеспечивающих устойчивость растения к патогенам, является индуцированная устойчивость, в настоящее время активно исследуется возможность использования данного типа устойчивости в сельском хозяйстве. Это, в свою очередь, требует изучения тех процессов, которые происходят в растении в ответ на внедрение патогенов и распознавание их метаболитов (элиситоров), что, в конечном счете, и приводит к возникновению устойчивости.
В середине 1990-х годов во ВНИИ фитопатологии был выделен низкомолекулярный (7,2 кДа) термостабильный белок из Bacillus thuringiensis, получивший название - Microbial Factor 2 (MF2). Было показано, что МБ2-белок способен индуцировать устойчивость растений в следующих парах патоген - хозяин: вирус табачной мозаики - табак, Х-вирус картофеля - табак, Phytophthora infestans - картофель и Magnaporthe grisea - рис. Ген, кодирующий MF2 белок, был клонирован и секвенирован (Djavakhia et al., 2000). Поскольку в ходе дальнейшего анализа оказалось, что белок MF2 относится к классу белков холодового шока, он был переименован в Cold shock protein D (CspD). Было решено исследовать возможность переноса гена CspD в геном растений, чтобы выяснить возможность индукции устойчивости трансгенных растений при экспрессии этого гена. В качестве объекта для получения трансгенных растений был выбран табак, так как это растение легко поддается агробактериальной трансформации и продуцирует большое количество семян, что является важным при изучении наследования признаков.
Цели и задачи исследований.
Одной целью наших исследований было получение трансгенных растений табака, экспрессирующих ген неспецифического элиситора CspD, вьщеленного из бактерии В. thuringiensis, с последующей их оценкой на устойчивость к грибному и вирусному фитопатогенам. Другой целью нашей работы было изучение элиситорных свойств пептида cspl5, представляющего собой консенсусную последовательность активного центра элиситоров из группы бактериальных белков холодового шока. Исходя из целей работы, были поставлены следующие задачи: создание генно-инженерных конструкций для экспрессии бактериального белка CspD в растении; создание трансгенных растений; анализ устойчивости трансгенных растений к фитопатогенам; оценка способности пептида cspl5 индуцировать устойчивость растений в системах растение-хозяин - патоген.
Научная новизна исследований.
Впервые были созданы трансгенные растения табака с геном белкового элиситора неспецифической устойчивости растений CspD, вьщеленного из Bacillus thuringiensis, и показана их устойчивость к грибному и вирусному фитопатогенам.
Впервые показана способность пептида cpsl5, представляющего собой консенсусную последовательность активного центра бактериальных белков холодового шока, индуцировать устойчивость в естественных системах растение-хозяин - патоген у двудольных растений: табак (сорт Xanthi) - вирус табачной мозаики (ВТМ), картофель - Phytophthora infestans.
Впервые показана элиситорная активность пептида cpsl5 по отношению к однодольному растению в паре пшеница (сорт Мироновская 808) - возбудитель септориоза (Stagonospora nodorum).
7 Практическая значимость работы.
Показано, что по сравнению с исходными растениями трансгенные растения табака, несущие ген CspD, обладают повышенной устойчивостью к вирусу табачной мозаики и к грибному фитопатогену Alternaria longipes. Данный факт позволяет начать исследования по созданию трансгенных растений сельскохозяйственных культур с целью их дальнейшего использования в селекционном процессе для создания сортов с широким спектром устойчивости к фитопатогенам.
Оптимизирована методика оценки трансгенных растений на наличие и экспрессию гена CspD с помощью молекулярных методов.
Оптимизирована методика оценки устойчивости табака к некротрофному грибу A. longipes.
Показано, что консенсусная последовательность бактериальных белков холодового шока (пептид cspl5) способна индуцировать устойчивость к грибному фитопатогену у однодольного растения - пшеницы, к оомицету у картофеля и к ВТМ у табака. Такие результаты позволяют начать работу по созданию высокоэффективных биопестицидов широкого спектра действия.
Оптимизирована методика для оценки раннего защитного ответа в суспензионной культуре клеток табака на воздействие элиситоров.
8 Апробация работы и публикации.
Материалы диссертации были представлены на международной научно-практической конференции «Биотехнология овощных, бахчевых, цветочных и малораспространенных культур», проходившей во ВНИИ Овощеводства в марте 2004 г; на международном семинаре "The International Joint Workshop on PR-Proteins and Induced Resistance" 5-9 мая 2004 г в Дании; III Съезде ВОГИС «Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития», 6-12 июня 2004 г в Москве; на третьем московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития», 14-18 марта 2005 г в Москве.
По материалам диссертации опубликовано работ.
Структура и объем работы.
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части (2-5 главы), выводов и списка литературы. Материал изложен на 124 страницах машинописного текста, содержит 8 таблиц, 22 рисункаа и 3 приложения. Список литературы включает 180 работ, из которых 176 на иностранном языке.
Индуцированная устойчивость растений, ее виды
Системную индуцированную устойчивость (ISR) вызывают такие ризосферные бактерии, как Pseudomonas fluorescein, Pseudomonas putida, Serratia marcescens. Ризосферные бактерии индуцируют устойчивость у широкого спектра растений (двудольных и однодольных) к широкому спектру фитопатогенов. Так, наиболее известны случаи ISR у растений по отношению к грибам, вирусам и бактериям. Определенные штаммы ризосферных бактерий вызвали повышенную устойчивость к грибным патогенам: у гвоздики к Fusarium oxysporum f. sp. dianlhi, у огурца к Colletotrichum orbiculare и Fusarium oxysporum f.sp. cucumerinum, у риса к Rhizoctonia solani, у сахарного тростника к Colletotrichum falcatum; к бактериальным патогенам: у фасоли к Pseudomonas syringae pv. phaseoUcola, у огурца к Pseudomonas syringae pv. lachrymans; к вирусным патогенам: у огурца к вирусу мозаики огурца, у табака к вирусу некроза табака (TNV) (Ramamoorthy et al., 2001). Также имеется информации о наличии ISR у растений по отношению к насекомым (Zehnder et al., 2001) и нематодам (Reitz et al., 2000).
Ризосферные бактерии находятся в большом количестве возле корней, где выделения растений служат их питательными веществами (Lynch and Whipps,1991). Кроме обеспечения ISR в растениях была показана способность ризосферных бактерий напрямую подавлять рост почвенных фитопатогенов и стимулировать рост растений (Wei and Beer, 1996; Pieterse and Van Loon, 1999).
Механизм ISR, вызываемой ризосферными бактериями, изучен слабее, чем механизм SAR. ISR описывается в литературе, как такое состояние растения, при котором после стимуляции ризосферными бактериями, растение приобретает способность быстрого реагирования на патогены, что приводит к скорейшей локализации патогена (van Loon et al. 1998). Феномен ISR наиболее изучен для Arabidopsis thaliana (арабидопсис), поэтому, далее будут приведены результаты исследований для этого растения. При активации ISR у арабидопсиса не наблюдается реакции СВЧ, характерного маркера SAR. Активация ISR не зависит от СК. В настоящее время никаких четко отличимых признаков (например, повышенная экспрессия каких-либо белков) для ISR у арабидопсиса не было обнаружено (van Loon and van Strien, 1999). Кроме независимости от СК отличительной чертой ISR является отсутствие синтеза PR-белков непосредственно после контакта с ризосферными бактериями, однако при инокуляции вирулентным патогеном индуцированного растения PR-белки экспрессируются более эффективно, чем у растения, неконтактировавшего с ризосферными бактериями.
Феномены SAR и ISR объединяет их зависимость от функционирования гена nprl. В целом уровень защитного эффекта достигаемого при ISR ниже, чем таковой при SAR. Отсутствие индукции биосинтеза PR-белков при ISR может свидетельствовать о непосредственно защитной роли этих белков, так как сигналы в случае SAR и ISR оказываются комплементарными на уровне nprl (Van Wees et al., 1998). SAR сопровождается повышением уровня СК, в то время как ISR не сопровождается повышением уровня СК, этилена или жасмоновои кислоты, однако является зависимой от этилена и жасмоновои кислоты. Обработка арабидопсиса метилжасмонатом или 1-аминоциклопропан-1 карбоксилатом (предшественником этилена) приводит к такому же уровню ISR, как и при обработке растений ризосферними бактериями, однако при этом не наблюдается увеличения эндогенных метилжасмоната и этилена (Pieterse et al., 2000). Тем не менее, этилен и метилжасмонат необходимы для развития ISR. Обработка этими веществами мутантов арабидопсиса, невосприимчивых как к жасмонату, так и к этилену, не приводит к развитию ISR Обработка метилжасмонатом etr мутанта арабидопсиса, невосприимчивого к этилену, приводит к индукции ISR, а обработка 1-аминоциклопропан-1-карбоксилатом генотипа JA response-mutant (jarl) не вызывает индукции ISR, что указывает на последовательность передачи сигнала при ISR (рис. 3).
Интересным является тот факт, что у различных экотипов арабидопсиса, способность к проявлению ISR в ответ на обработку P. fluorescens различается и наследуется в соответствии с Менделевскими законами. Так был идентифицирован локус ISR1 у экотипов арабидопсиса Ws и RLD, которые обладают пониженной способностью к проявлению ISR.
Предполагается, что данный локус принимает активное участие в передаче сигнала зависимого от жасмоновой кислоты и этилена (Ton et al., 2001).
Как было отмечено выше, в активации индуцированной устойчивости растения большую роль играют такие сигнальные молекулы как СК, метилжасмонат и этилен. Обработка растений этими веществами по отдельности в определенной мере приводит к развитию индуцированной устойчивости (Pieterse et al. 2000; Oostendorp et al., 2001). Важным является вопрос о взаимодействии друг с другом различных механизмов индуцированной устойчивости. В какой-то мере на этот вопрос проливает свет работа Schenk и соавторов (2000). Исследователи изучали профиль экспрессируемых/репрессируемых генов арабидопсиса в ответ на инокуляцию несовместимым некрозообразующим патогеном Altenmria brassicicola или сигнальными молекулами, принимающими участие в защитных ответах растения (СК, метилжасмонат, этилен). При помощи микрочипов одновременно были изучены изменения в экспрессии 2375 генов после обработки растений патогеном или сигнальными молекулами. Наибольшее число генов, индуцируемых и репрессируемых одновременно (25%) было отмечено после обработок СК и метилжасмонатом. Более 50% генов, индуцируемых после обработки этиленом, индуцировались также после обработки метилжасмонатом (рис. 4). Такие результаты говорят о наличии хорошо скоординированной регуляторной сети между различными сигнальными путями, активируемыми при развитии защитных реакций растений.
Фитопатогенные микроорганизмы
В работе использовался штамм Escherichia coli: DH5a (F , I 80d lacZAM15, recAl, gyrA96, thi-1, hsd R17, (rk , mk+), supE44, relAl, deoR, A(lacZYA-argF), U169). Для выращивания клеток E. coli использовали жидкую или агаризовашгую (1,5% - бакто-агар) питательную среду LB (Sambrook et al., 1989), содержащую: бакто-триптон - 10 г/л, бакто-дрожжевой экстракт - 5 г/л, NaCl - 10 г/л, рН - 7, 5. Для роста трансформированных бактериальных клеток в среду LB добавляли селективный агент ампициллин (100 мг/л).
В работе использовался штамм AGL0 агробактерии Agrobacterium tumefaciens (Lazo et al., 1991), предоставленный к.б.н. Шульгой О. А. из Центра «Биоинженерия» РАН, который выращивали при 28С на среде YEB: (бакто-дрожжевой экстракт - 1 г/л; бакто-мясной экстракт - 5 г/л; пептон - 5 г/л; сахароза - 5 г/л; MgSCM - 0, 5 г/л; агар - 15 г/л; рН - 7,2).
В качестве источника гена CspD была использована плазмида p\JC\9/CspD, полученная ранее в лаборатории молекулярной биологии ВНИИФ (Djavakhia et al., 2000).
Для создания кассеты экспрессии бактериального гена в растении применяли плазмиду pRTlOl (Topfer et al., 1988). Плазмида pRTlOl была любезно предоставлена доктором Э. Клоке из немецкого Института декоративных растений (Institute of Chorticultural crops, BAZ, Germany). Для получения бинарных векторов для трансформации растений использовали плазмиду pBinl9 (Bevan, et al„ 1984), предоставленную к.б.н. Шульгой О. А. из Центра «Биоинженерия» РАН.
Гриб Alternaria longipes (изолят ml8/10/99) был любезно предоставлен доктором Р. Кремером из немецкого Института декоративных растений (Institute of Chorticultural crops, BAZ, Germany). Гриб Stagonospora nodorum (синоним Septoria nodorum) был любезно предоставлен отделом грибных болезней зерновых культур ВНИИ Фитопатологии. Вирус табачной мозаики поддерживался в лаборатории молекулярной биологии на живом растении табака Nicotiana tabacum (сорт Samsun), которое выращивалось в климатической камере при 16 часовой длине дня и температуре 24С днем и 20С ночью. По мере надобности проводилась инокуляция новых растений путем натирания листа растения соком инфицированного растения совместно с карборундом.
Пептид cspl5 был синтезирован сотрудниками группы инструментальных методов синтеза под руководством к. т. н. М. Б. Бару (Отдел биоинженерии филиала Института биоорганической химии им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН, Пущино).
Суспензионная культура клеток табака Nicotiana tabacum L. (сорт Wisconsin 38, штамм 217) была получена из «Специализированной коллекции культуры клеток высших растений» института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, где ее выращивали на среде следующего состава (на 1 л): MS соли; тиамин-НС1 - 0,4 мг; аденин - 1 мг; мио-инозитол - 100 мг; кинетин - 0,4 мг; 2,4-Д - 2 мг; гидролизат казеина - 1 г; сахароза - 30 г; рН 5,8, (протокол предоставлен к.б.н.Смоленской И. Н.). В дальнейшем суспензионную культуру выращивали при 25С с постоянным освещением на орбитальной качалке "Lab-Shaker" (Adolf Kuhner AG, Switzerland) при R = 2,5 см и 100 об/мин, в 250 мл колбах (65-70 мл клеток) в жидкой среде NT (МС соли, витамины Нитча, сахароза - 30 г/л; мио-инозитол -400 мг/л; а-нафтален-уксусная кислота (НАА) - 1мг/л; N-бензиладенин - 230 мкг/л; рН - 5,5) согласно соавторам Felix и Meins (1987). Для опытов использовали клетки, находящиеся в экспоненциальной фазе роста (5, 6 и 7 дней после отсева). Для получения свежей суспензионной культуры, 8 мл десятидневной культуры добавляли к 60 мл питательной среды.
Эксперименты по трансформации проводили на растениях табака Nicotiana tabacum [сортов Xanthi (NN) и Samsun system (nn)] согласно Horsch et al. (Horsch et al., 1985). В качестве селективного агента для отбора трансгенных растений использовали антибиотик канамицин, что обусловлено присутствием в Т-ДНК бинарного вектора pBilt7 маркерного гена nptll, кодирующего фермент неомицинфосфотрансферазу, обеспечивающий устойчивость растений к канамицину. Элиминацию A. tumefaciens осуществляли на среде с антибиотиком карбенициллином, на которой проводили и регенерацию побегов. Эксперимент по трансформации включал ряд контрольных вариантов. Отрицательный контроль - листовые диски без инкубации с агробактерией на селективной среде - был необходим для того, чтобы отслеживать эффективность селективного агента канамицина. Положительный контроль - листовые диски без инкубации с агробактерией на среде без селективного агента - необходим для отслеживания пригодности питательной среды для регенерации.
Для получения исходного листового материала для трансформации в культуре in vitro выращивали растения табака из поверхностно стерилизованных семян при 16 часовой длине дня и температуре 24С днем и 20С ночью. Из листьев вырезали диски площадью 0,25 см . Двадцать пять дисков помещали на чашку Петри диаметром 9 см, содержащую 10 мл среды А2 (МС соли по Murashige и Skoog, 1962; 3% сахароза; рН 5,5). Далее добавляли в ту же чашку 2,5 мл ночной культуры агробактерии штамма AGLO (Lazo et al., 1991), содержащего плазмиду с целевым геном CspD, и инкубировали в течение 15-20 минут при комнатной температуре. Затем помещали листовые диски на стерильную фильтровальную бумагу после чего располагали их на питательной среде А2 верхней стороной листа вниз. В течение трех дней держали чашки Петри в климатической камере затененными. Через три дня листовые диски промывали в чашках Петри жидкой средой А2, содержащей 500 мг/л карбенициллина. После промывания подсушивали листовые диски на стерилыюм фильтре и помещали их на среду A3 (МС-соли; 2,0% глюкоза; 0,3% фитогель, 0,1 мг/л никотин-уксусная кислота [НУК]; 1,0 мг/л бензиламинопурина (БАП); рН 5,5), содержащую канамицин - 100 мг/л и карбенициллин - 500 мг/л. Каждую неделю перекладывали экспланты на свежую среду A3, содержащую канамицин и карбенициллин в тех же концентрациях. Через 3-4 недели образовавшийся каллус отделяли от эксплантов и помещали на среду А4 (то же что и A3, но без НУК) с канамицином и карбенициллином. Через 3-4 недели регенерировавшие побеги срезали с каллуса и помещали на среду А5 ( МС-солей; 3,0% сахароза; 0,3% фитогель; канамицин 100 мг/л и карбенициллин 500 мг/л) для укоренения.
Анализ нуклеотидной последовательности гена CspD с целью определения возможности его эффективной экспрессии в растениях табака
С помощью программы (http://ca.expasv.org/tools/pi tool.html) было определено, что белок MF2 состоит из 66 аминокислотных остатков и имеет расчетный молекулярный вес равный 7239 Да. Это полностью согласуется с экспериментальными данными, полученными при электрофоретическом разделении белка в ПААГ (Djavakhia et al., 2000). Суммарное количество отрицательно заряженных аминокислотных остатков (Asp + Glu) составляет 11, а суммарное количество положительно заряженных аминокислотных остатков (Arg + Lys) - 6, теоретическое значение изоэлектрической точки равняется 4,6.
С того момента как известна нуклеотидная последовательность гена, становится возможным определить, к какому классу принадлежит исследуемый белок. Кроме того, в отдельных случаях возможно достаточно точное определение третичной структуры изучаемого белка in silico (моделирование третичной структуры белка осуществляется с помощью специальных компьютерных программ; в основе расчетов лежит і спользование данных для гомологичных белков, полученных экспериментально, например, с помощью рентгеноструктурного анализа).
Чтобы определить к какому классу белков принадлежит белок MF2, проводили поиск гомологичных последовательностей среди имеющихся в GenBank последовательностей (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.html) с помощью программ Nucleotide-nucleotide BLAST (для нуклеотидной последовательности) и Protein-protein BLAST (для последовательности аминокислотных остатков), находящихся на сервере NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov, Altschul et al., 1987). Последовательность аминокислотных остатков белка MF2 анализировали с помощью программы ScanProsite (http://www.expasv.ch/prosite, Bairoch et al., 1997). Данная программа осуществляет поиск функциональных единиц в предложенной последовательности аминокислотных остатков, сравнивая ее с известными функциональными последовательностями, которые находятся в базе данных PROSITE.
Последовательность белка MF2 оказалась высоко гомологичной последовательностям бактериальных белков холодового шока . Наиболее высокая степень гомологии обнаружена с ортологами данного белка из видов Bacillus: идентичность нуклеотидной и аминокислотной последовательностей с белком CspD из В. anthracis (GenBank Accession Number AAP28787) составила 99% для нуклеотидной и 100% для аминокислотной последовательностей, с CspD из В. cereus (GenBank Accession Number Q45099) была 91% и 95%. На основе полученных данных, кодирующая последовательность гена белка MF2 была представлена в GenBank под названием CspD (cold shock protein D), которая получила номер AY272058.
Эффективность экспрессии в растении чужеродных генов из филогенетически отдаленных организмов, таких как бактерии, зависит от многих факторов и, прежде всего, от нуклеотидного состава экспрессируемого гена. Важным является соответствие частот использования кодонов экспрессируемого гена и растения реципиента (Gouy and Gautier, 1982; Perlaketal., 1991).
В нуклеотидной последовательности прокариотического бактериального гена также могут быть замаскированы такие последовательности, которые в эукариотической клетке растения служат либо сигналом для сплайсинга, либо сигналом для полиаденилирования. По этой причине в растении могут происходить преждевременная терминация трансляции чужеродного гена или альтернативный сплайсинг мРНК (Miki, 2002). Так, низкий уровень экспрессии гена токсина crylA(b) из В. thuringiensis в растениях табака был обусловлен наличием внутри кодирующей последовательности траскрипта сайтов для альтернативного сплайсинга (van Aarssen et al., 1995). В других работах низкий уровень экспрессии генов токсинов crylA(c) и сгуЗСа! из В. thuringiensis в растении был связан с преждевременным полиаденилированием транскрибируемой РНК токсинов. В этих нуклеотидных последовательностях находились UUUGUA- и AAUAAA-подобные последовательности, кодирующие сигнал для начала полиаденилирования в растении (Haffani et al., 2000; Diehn et al., 1998).
Перед проведением исследований по экспрессии гена CspD в растениях табака был проведен анализ его нуклеотидной последовательности. Во-первых, определяли, насколько ее кодоновый состав соответствует частотам использования кодонов у Nicotiana tabacum и, во-вторых, в последовательности гена CspD был проведен поиск областей, которые могут подвергаться сплайсингу при созревании мРНК или преждевременному полиаденилированию. Проведение такого анализа является важным, поскольку позволяет установить нуждается ли нуклеотидная последовательность гена CspD в каких-либо модификациях для эффективной экспрессии в клетках табака.
Сравнительный анализ использования кодонов у Nicotiana tabacum и гена CspD позволил заключить, что нуклеотидная последовательность гена CspD не содержит редкие кодоны и, следовательно, не будет происходить терминации трансляции этого гена в клетках табака (табл. 3). Данный анализ проводился с помощыо программы Countcodon (http://www.kazusa.or.ip/codon/countcodon.htmn при использовании базы данных Codon Usage Database (http://www.kazusa.or.ip/codon/). С помощью компьтерной программы GENSCAN (http://genes.mit.edu/GENSCAN.html) был проведен поиск интронов и поли А сигналов в транскрипте гена CspD. Данный анализ не вьивил в последовательности CspD возможных областей для альтернативного сплайсинга в эукариотических клетках. Кроме того, в исследуемом гене было проверено наличие UUUGUA-подобных и AAUAAA-подобных последовательностей, кодирующих сигнал для полиаденилирования (Haffani et al., 2000; Diehn et al., 1998). Таких последовательностей в пуклеотидной последовательности гена CspD обнаружено не было
Сравнение уровня экспрессии в трансгенных линиях табака с помощью ПЦР в реальном времени
При обработке клеток растений элиситорами происходит быстрая утечка/поглощение ионов К+/Н+ (Atkinson et al., 1985; Viard et al., 1994). В суспензионной культуре клеток растения этот мембранный эффект можно обнаружить уже через несколько минут после обработки элиситором по защелачиванию питательной среды. В работе Феликса и Боллера (Felix and Boiler, 2003) было показано, что пептид cspl5 вызывает защелачивание в суспензионных культурах клеток табака и картофеля. За счет скорости анализа данная система является чрезвычайно удобной для поиска новых индукторов устойчивости растений (Felix et. al., 1999).
Исходную суспензионную культуру клеток табака N. tabacum (сорт Wisconsin 38, штамм 217), сначала выращивали на питательной среде, в которой проводилось поддержание данной культуры клеток в коллекции Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН. Условия культивирования сохранили стандартными (25С, 100 об/мин, 250 мл колбы с объемом культуры 50 мл). Однако, выращенные на данной среде клетки, крайне слабо реагировали на воздействие элиситора cspl5. Внесение пептида в среду до его конечной концентрации 10 нМ вызывало лишь незначительный сдвиг рН (АрН = 0,15). Клетки медленно росли и находились в угнетенном состоянии, что отмечалось по их светло-коричневому цвету вместо светло-зеленого. Поэтому была произведена замена питательной среды. В качестве альтернативной была выбрана среда, на которой проводилось культивирование клеток табака в лаборатории Т. Боллера (состав среды NT см. раздел 2.1.6.). Через три месяца после культивирования на среде NT, клетки табака приобрели нормальную светло-зеленую окраску и значительно повысилась их чувствительность к элиситору. В данном варианте эксперимента внесение пептида в среду до его конечной концентрации нМ вызывало значительный и достоверный сдвиг рН (АрН составляло от 0,60 до 0,75 в зависимости от состояния, возраста клеток и температуры).
Чтобы определить стадию роста, на которой клетки являются наиболее чувствительными к действию элиситоров, анализировали суспензионные культуры в возрасте от 4 до 8 дней. Оказалось, что наиболее сильный ответ на воздействие элиситора дают клетки в возрасте 4-х дней. Оптимальный объем посевной культуры составил 8 мл клеток, выращиваемых в течение семи дней в 50 мл свежей питательной среды. Клетки в возрасте 5-6 дней также подходили для анализа, но их чувствительность к элиситорам значительно снижалась.
Полученные результаты согласуются с данными Феликса и Боллера (2003) о способности пептида cspl5 вызывать утечку/поглощение ионов К+/Н+ у N. tabacum сорта Wisconsin 38 (рис. 20). Добавление элиситора cspl5 в суспензионную культуру клеток табака приводило к быстрому защелачиванию внешней среды, за счет поглощения клетками протонов. Изменение концентрации пептида cspl5 в суспензионной культуре клеток в пределах от 1 до 10 нМ приводило к линейному изменению ДрН. Увеличение концентрации пептида от 10 до 100 нМ лишь незначительно увеличивало сдвиг рН среды. Пептид cspl5 в концентрации 100 рМ практически не вызывал защелачивания среды клетками.
В результате, нами была оптимизирована система для выявления ранних защитных ответов растений в суспензионной культуре клеток табака. В настоящее время эта система используется для обнаружения новых элиситоров различного происхождения. Активация протонной сигнальной системы клеток табака в ответ на обработку разными концентрациями пептида cspl5.
В заключение следует отметить, что бактериальные белки холодового шока способны индуцировать устойчивость, по крайней мере, у табака к ВТМ, картофеля к P. infestans, пшеницы к S. nodorum и для обеспечения их элиситорного действия достаточно активного центра белков холодового шока - пептида cspl5. Вероятно, у растений существуют рецепторы для бактериальных белков холодового шока, и они могут быть структурно или организационно сходны с рецептором флагеллина (FLS2) у арабидопсиса, так как спектр и скорость ранних защитных ответов у арабидопсиса на флагеллин и у табака на cspl5 сходны (Felix and Boiler, 2003). Механизм данного вида индуцированной устойчивости должен быть весьма консервативен, так как один и тот же пептид способны распознавать как двудольные, так и однодольные растения. На примере флагеллина и липополисахаридов (LPS) бактерий было показано, что эти PAMPs способны распознавать, как растения, так и животные. В связи с этим, особенно интересным представляется выяснить, являются ли белки холодового шока PAMPs для животных.
