Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Состояние вопроса 11
1.1. Биологическое разнообразие как основа селекции: понятие и методы оценки 11
1.2. Биологические особенности и внутривидовой полиморфизм сосны обыкновенной 16
1.3. Селекция и семеноводство сосны обыкновенной 24
1.4. Исследования древесных растений с помощью молекулярных маркеров 36
ГЛАВА 2. Объекты и методы исследований 46
2.1. Объекты исследований 46
2.2. Методы исследований
2.2.1. Анализ изменчивости роста, семеношения и смолопродуктивности клонов плюсовых деревьев сосны обыкновенной 49
2.2.2. Анализ генетической изменчивости 51
ГЛАВА 3. Генетическая изменчивость и диффережіиация лесосеменных плантаций первого порядка, насаждений и семян сосны обыкновенной 55
3.1. Генетическая изменчивость насаждений и лесосеменных плантаций сосны обыкновенной 55
3.2. Генетическая изменчивость семян сосны обыкновенной разных селекционных категорий 61
3.3. Генетическая дифференциация насаждений, лесосеменных плантаций и семян сосны обыкновенной 67
ГЛАВА 4. Анализ полиморфизма клонов плюсовых деревьев сосны обыкновенной по росту, семеношению, смолопродуктивности иissr-участкам ДНК 76
4.1. Изменчивость показателей роста клонов плюсовых деревьев сосны обыкновенной 76
4.2. Изменчивость признаков репродуктивной сферы клонов плюсовых деревьев 81
4.3. Изменчивость клонов плюсовых деревьев по смолопродуктивности 83
4.4. Генетический полиморфизм клонов плюсовых деревьев сосны обыкновенной 87
ГЛАВА 5. Отбор ценных генотипов сосны обыкновенной... 91
5.1. Отбор быстрорастущих клонов плюсовых деревьев 92
5.2. Отбор высокосмолопродуктивных клонов плюсовых деревьев 96
5.3. Отбор высокоурожайных клонов плюсовых деревьев 99
Практические рекомендации 104
Список использованных
- Биологические особенности и внутривидовой полиморфизм сосны обыкновенной
- Анализ изменчивости роста, семеношения и смолопродуктивности клонов плюсовых деревьев сосны обыкновенной
- Генетическая дифференциация насаждений, лесосеменных плантаций и семян сосны обыкновенной
- Изменчивость клонов плюсовых деревьев по смолопродуктивности
Биологические особенности и внутривидовой полиморфизм сосны обыкновенной
Локус полиморфным называется, если в популяции существуют два или более аллеля этого локуса. Обычно локус определяется как полиморфный, если частота наиболее распространенного аллеля меньше 0,99 или равна 0,95. Это измерение обеспечивает критерий для демонстрации того, что ген проявляет изменчивость (Cavalli-Sforza, Bodmer, 1981).
Существуют и другие критерии изменчивости, и одним из наиболее простых способов измерения степени полиморфности в популяции является подсчет среднего соотношения полиморфных локусов путем деления их общего числа на суммарное число локусов в выборке (Левонтин, 1978). Этот критерий - не что иное, как процентное содержание изменчивых локусов в популяции, то есть доля полиморфных локусов. Конечно, такая мера в значительной степени зависит от числа изученных особей. Следует обратить внимание на то, что полиморфность лишь отчасти отражает генетическое разнообразие особей в популяции. В равной степени полиморфным оказывается локус с двумя и пятью аллелями. Богатство аллельных вариантов (А) относится к числу вариантов в образце, и уровень разнообразия равен (А - 1) вариантов потому, что внутри мономорфной популяции степень разнообразия равна нулю (А - 1 = 0). Для данного гена в образце это измерение говорит о том, сколько аллельных вариантов могут быть найдены. Оно реагирует на размер образца. Хотя распространение аллелей не имеет значения, максимальное число аллелей следует учитывать. Измерение может быть применено только с кодоминантными маркерами.
Число аллелей на локус - это такой параметр, используемый для оценки генетического разнообразия по маркерам, имеющим более двух описанных аллельных состояний. Среднее число аллелей на локус - это сумма всех обнаруженных аллелей во всех локусах, разделенное на общее число локусов. Среднее число аллелей на локус предоставляет дополнительную информацию к информации о полиморфизме. Оно требует только подсчета числа аллелей в каждом локусе и затем расчета среднего значения.
Среднее эффективное число аллелей на локус или число аллелей, одновременно присутствующих в популяции, говорит о числе аллелей, которое можно предположить в локусе каждой популяции. Оно вычисляется путем инвертирования (переворачивания) измерения гомозиготности в локусе (Kimura, Crow, 1964).
Следующий параметр генетического разнообразия, который показывает, какую долю в популяции составляют особи, гетерозиготные по изучаемым маркерам является средняя гетерозиготность. Средняя ожидаемая гетерозиготность является более точным показателем генетической вариабельности внутри популяции. Данная величина в меньшей степени подвержена влиянию эффектов, связанных с ошибкой выборки и может быть получена непосредственно из генных частот. Наблюдаемую гетерозиготность вычисляли путем деления числа гетерозиготных деревьев на общее число проанализированных по данному локусу деревьев (Wright, 1946).
Генетическое расстояние - это мера генетического дивергенции между видами, подвидами или популяциями одного вида. Малое генетическое расстояние означает генетическое сходство, большее генетическое расстояние означает меньшее генетическое сходство. Одним из способов измерения генетического расстояния, основанном на предположении, что генетическая разница возникает за счет мутаций и генетического дрейфа, является стандартное генетическое расстояние Нея, метод был предложен Масатоши Неем в 1972 году (Nei,1972).
Значения генетического сходства могут варьировать от 0 (между популяциями нет общих аллелей) до 1 (частоты аллелей в популяции одинаковые), соответственно генетическая дистанция варьирует от 1 до 0.
Если же генетическое расстояние между двумя популяциями составляет 1, то все гены этих популяций имеют аллели, принадлежащие только к одному из них. Такое расстояние соответствует завершению постепенной дивергенции популяции исходного вида и окончательному отделению нового вида. Степень генетического различия между двумя подвидами, относящимися к одному виду, соответствует генетическому расстоянию, равному 0,17 - 0,22. Генетическое расстояние между двумя видами-двойниками составляет 0,50 - 0,60, то есть популяциями, которые не отличаются по морфологическим признакам, но лишаются способности к скрещиванию.
В настоящее время существует множество методов и индексов биологического разнообразия, таких как индексы Симпсона, Шелдона, Животовского, Шеннона. Но оценку генетического разнообразия внутри и между популяциями часто проводят с использованием индекса биоразнообразия Шеннона (Schannon, Weaver, 1949), который традиционно применяется при молекуляно-генетическом анализе (Артюкова и др., 2001). Биологический смысл данного индекса заключается в количественном выражении выравненности видового обилия. Требования аддитивности информации о разнообразии различных уровней сообщества выдвигает функцию Шеннона на первый план в качестве меры биологического разнообразия сообщества. Из всех наиболее часто применяемых показателей лишь она обладает свойством аддитивности и может быть использована в сравнительном анализе иерархического строения разных систем.
Анализ изменчивости роста, семеношения и смолопродуктивности клонов плюсовых деревьев сосны обыкновенной
Изучение морфологического полиморфизма клонов плюсовых деревьев сосны обыкновенной проводилось на коллекционно-маточном участке в Республике Марий Эл. КМУ (коллекционно-маточный участок) сосны обыкновенной заложен в 1994 году на площади 6,0 га на территории Бушковского лесничества Сернурского лесхоза. Архив был создан путем посадки привитых саженцев плюсовых деревьев. Основным назначением участка является концентрация в одном пункте и сбережение в виде вегетативного потомства плюсовых деревьев данного региона. Каждое плюсовое дерево на клоновом участке представлено тридцатью прививками с размещением 5x5 м.
При закладке КМУ в качестве подвоя использовались растения, выращенные из семян местного происхождения, а также подвой, выращенный из семян растений, с которых были взяты черенки в качестве привоя. При выборе подвоя предпочтение отдавалось хорошо развитым растениям, имеющим нормально сформированный стволик, сочное по окраске охвоение и высоту стволика выше среднего. Для удобства при селекционной работе и быстрого нахождения необходимого клона принята схема размещения привитых растений рядами, с проставлением между клонами в ряду столба с номером клона.
Для анализа генетической структуры лесосеменных плантаций были проведены исследования трех клоновых ЛСП: 1. ЛСП в Бушковском лесничестве Приволжского лесосеменного района подрайона Марийский. ЛСП расположено в 41 квартале Бушковского участкового лесничества Сернурского лесхоза. ЛСП заложена 2001 году, способ закладки - посадка привитых сеянцев. Площадь плантации 6,0 га. 2. ЛСП в Ибресинском лесничестве Приволжского лесосеменного района Мордовско-Чувашского подрайона. ЛСП находится в 98 квартале Кошлаушского участкового лесничества Ибресинского лесничества. Плантация заложена по проекту «Союзгипролесхоза», общая площадь 100 га, продуцирующая - 91,1 га. Для анализа взято 6 поле, заложенное прививкой на подвойные культуры в 1989 году, площадь поля 6,1 га. 3. ЛСП в Чаадаевском лесничестве Средне-Волжского лесосеменного района Пензенско-Ульяновского подрайона. Лесосеменная плантация находится в 93 квартале в 9 выделе Чаадаевского лесничества. ЛСП была заложена в 2007 году, способ создания - посадка привитых сеянцев с размещением 8x10 м. Площадь плантации 10,0 га.
Оценка уровня генетической изменчивости лесосеменных плантаций проводилась путем сравнения показателей с параметрами насаждений сосны обыкновенной в тех же лесосеменных районах и подрайонах: 1. Насаждение сосны обыкновенной в Нежнурском участковом лесничестве Килемарского лесничества Приволжского лесосеменного района подрайона Марийский. Насаждение находится в 11 выделе 107 квартала, состав 4С4С2Б, возраст 85 лет. 2. Насаждение сосны обыкновенной в Кошлаушском участковом лесничестве Ибресинского лесничества Приволжского лесосеменного района Мордовско-Чувашского подрайона. Насаждение находится в 50 квартале, состав ЮС, полнота 0,8, возраст 80 лет. 3. Насаждение сосны обыкновенной в Ахунском участковом лесничестве Ахунско-Ленинского лесничества Средне-Волжского лесосеменного района Пензенско-Ульяновского подрайона. Насаждение находится в 8 выделе 117 квартала, площадь 29,0 га, состав 10С+Б, возраст 70 лет.
Для анализа генетической изменчивости семян различных селекционных категорий для эксперимента взяты следующие семена: 1) семена нормальной селекционной категории; 2) семена улучшенной селекционной категории. Разделение на вышеперечисленные категории семян предусмотрены «Указанием по лесному семеноводству в Российской Федерации» (2000). В Приволжском лесосеменном районе Мордовско-Чувашском подрайоне семена для исследования были собраны на следующих объектах: 1. ПЛСУ сосны обыкновенной в Порецком лесничестве (семена нормальной селекционной категории); 2. ЛСП сосны обыкновенной в Ибресинском лесничестве (1 поле) (семена улучшенной селекционной категории); 3. ЛСП сосны обыкновенной в Ибресинском лесничестве (2 поле) (семена улучшенной селекционной категории). В Средне-Волжском лесосеменном районе Пензенско-Ульяновском подрайоне семена для исследования были собраны на следующих объектах: 1. ЛСП сосны обыкновенной в Кузнецком лесничестве (семена улучшенной категории); 2. ПЛСУ сосны обыкновенной в Ахунском лесничестве (семена нормальной селекционной категории); В Приволжском лесосеменном районе подрайоне Марийский семена для исследования были собраны на следующих объектах: 1. ЛСП сосны обыкновенной в Сернурском лесничестве кв. 40 (семена улучшенной селекционной категории); 2. ПЛСУ сосны обыкновенной в Сернурском лесничестве кв. 76, выд. 9. (семена нормальной селекционной категории).
Были также проанализированы генетические показатели двухлетних сеянцев сосны обыкновенной, выращенных на питомнике из улучшенных семян с ЛСП 1 порядка Ибресинского лесничества Мордовско-Чувашского подрайона.
Анализ изменчивости роста, семеношения и смолопродуктивности клонов плюсовых деревьев сосны обыкновенной Исследования морфологической изменчивости клонов плюсовых деревьев на коллекционно-маточном участке Сернурского лесничества были проведены в 2008 году. Всего на КМУ представлено 76 клонов, из которых было изучено 53. Получены данные по высоте, окружности ствола, ширине кроны в ряду и между рядами, урожайности, смолопродуктивности и морфометрическим параметрам шишек и семян. Высоту измеряли с помощью высотомера с точностью до 0,1 м. Одновременно с высотой измеряли окружность ствола на высоте 1,3 м мерной лентой с точностью до 1 мм. Замеры ширины кроны в ряду и между рядами проводили с помощью металлической рулетки с точностью до 1 см. Для определения урожайности на каждой рамете осуществлялся подсчет количества шишек.
Для изучения изменчивости клонов плюсовых деревьев по признакам репродуктивной сферы с 69 клонов на КМУ в Сернурском лесничестве было собрано по 30 шишек. Шишки с каждого клона взвешивали, затем у каждой шишки штангенциркулем были измерены длина и ширина. Далее шишки сушили при комнатной температуре, после раскрытия семенных чешуи из каждой шишки извлекали и подсчитывали семена, затем шишки досушивали в сушильном шкафу при температуре 50С, после чего выколачивали оставшиеся семена и подсчитывали их количество. Семена взвешивали для определения массы семян. Были рассчитаны масса 1000 штук семян и выход семян из шишек каждого клона.
Для определения смолопродуктивности использовали методику А. В. Чудного (1966). На деревья наносили специальные микроранения диаметром и глубиной по древесине 4-5 мм с помощью сверла. Выделившаяся живица накапливалась в шприц в течение 3 дней. Количество живицы оценивалось путем ее взвешивания.
Все полученные данные обрабатывались методами вариационной статистики в среде Microsoft Excel. Вычислялись следующие показатели: среднее значение признака, ошибка среднего, среднее квадратическое отклонение, минимальные и максимальные значения, коэффициент изменчивости, показатель точности опыта.
Генетическая дифференциация насаждений, лесосеменных плантаций и семян сосны обыкновенной
Для изучения изменчивости репродуктивной сферы клонов плюсовых деревьев измерены следующие показатели: длина и ширина шишек, общая масса шишек, масса одной шишки, количество семян из всех шишек, количество семян из одной шишки, общая масса извлеченных семян, масса 1000 штук семян, выход семян. Статистический анализ параметров показывает, что включенные в анализ клоны существенно различаются по признакам репродуктивной сферы (табл. 4.6).
Средняя длина шишек для изученных клонов составляет 4,47 см, при этом минимальное значение признака - 3,05 см, а максимальное - 5,24 см (прил. 5). Длина шишек - признак, который характеризуется значительной изменчивостью, о чем говорит коэффициент вариации 13,7%.
Средняя ширина шишек изученных клонов составляет 2,17 см при лимитах по клонам от 1,2 до 3,9 см (прил. 6). Межклоновая изменчивость также характеризуется как значительная, о чем говорит коэффициент вариации равный 16,3%.
Большая изменчивость наблюдается у исследованных клонов по таким характеризующим семенную продуктивность признакам, как общая масса шишек с одного дерева, масса одной шишки и масса 1000 штук семян (прил. 7). У вышеперечисленных признаков коэффициент межклоновой вариации варьирует от 24,2 до 37,3%. При этом средняя общая масса шишек с одного дерева для всех клонов составила 309,8 г при лимитах по клонам 55,3 и 583,8 г; масса одной шишки - 9,59 г при лимитах по клонам 3,7 - 14,4 г; масса 1000 шт. семян - 6,46 г при лимитах по клонам 0 и 9,6 г.
Очень большой уровень изменчивости установлен для общего количества семян, общей массы семян из всех шишек, количества семян из одной шишки и выхода семян, у которых межклоновый коэффициент вариации достигает 64,9 - 74,2%. Количество семян варьирует у разных клонов от 0 до 903 при среднем значении 308; общая масса семян - от 0 до 5,93 г при среднем значении 2,06 г; количество семян из одной шишки - от 0 до 22,7 при среднем значении 9,6; выход семян - от 0 до 1,51% при среднем значении 0,64%.
Таким образом, на КМУ растут клоны плюсовых деревьев, имеющие шишки с различными параметрами по ширине и длине, большую разницу по массе шишек, общему количеству семян и количеству семян в одной шишке, общей массе семян и массе 1000 штук семян, выходу семян из шишек. 4.3. Изменчивость клонов плюсовых деревьев по смолопродуктивности
Под смолопродуктивностью понимается генетически обусловленная способность деревьев хвойных пород синтезировать и при вскрытии смолоносной системы выделять определенное количество живицы. Смолопродуктивная способность деревьев проявляется на самых ранних этапах онтогенеза и наследуется ядерными генами по доминантному типу, при этом доминантные аллели ингибируют смоловыделение, а рецессивные в гомозиготном состоянии усиливают его (Высоцкий, 2002).
Различают следующие категории смолопродуктивности: очень низкую, низкую, среднюю, высокую и очень высокую (Высоцкий, 1978; Проказин, 1959; Чудный, 1966). Распределение клонов по указанным категориям приведено в таблице 4.9 и на рисунке 4.1. Таблица 4.9 Распределение клонов плюсовых деревьев по категориям смолопродуктивности
Корреляционный анализ не показал связи между массой смолы и биометрическими показателями ствола. Коэффициент корреляции между массой смолы и высотой равен -0,10, коэффициент корреляции между массой смолы и окружностью дерева составляет -0,17.
Для определения генетического полиморфизма по ISSR-участкам ДНК вегетативного потомства сосны обыкновенной для анализа было взято 36 деревьев с КМУ. ISSR-маркеры, как правило, являются высокополиморфными, и включенные в анализ растения будут характеризоваться уникальным генетическим портретом по данным участкам ДНК. Пример индивидуальной изменчивости клонов плюсовых деревьев по ISSR-праймеру (AG)8YT приведен на рисунке 4.2. (СибЭнзим, 100 bp + 3,0 kb) По результатам ISSR-анализа ДНК, выделенной из хвои клонов плюсовых деревьев сосны, установлено, что 6 ISSR-праймеров позволяют определить 170 амплифицированных ISSR-фрагментов ДНК, из которых 147 фрагментов полиморфны, что составляет 86,47% от общего их количества (табл. 4.10). Число амплифицированных фрагментов ДНК в выборке варьирует в зависимости от праймера от 22 ((AG)8T) до 36 ((AG)8YT). В среднем при ISSR-анализе у сосны обыкновенной один праймер инициирует синтез 28 фрагментов ДНК. Размеры ампликонов варьируют от 170 до 2130 пар нуклеотидов. Самая большая длина фрагментов ДНК обнаружена у праймера (CA)6AG, а самая маленькая - у праймера (AG)8T.
Изменчивость клонов плюсовых деревьев по смолопродуктивности
Таким образом, комплексная оценка клонов по показателям роста позволила выделить 13 (24,5%) перспективных клонов, которые достоверно отличаются лучшим ростом и могут быть рекомендованы для закладки ЛСП повышенной генетической ценности.
Сохранение генофонда лесов является одним из главных направлений деятельности по сохранению биологического разнообразия и отвечает международным обязательствам Российской Федерации, так как сужение генотипического разнообразия лесов ведет к снижению их устойчивости. В связи с этим весьма важным является проведение оценки изменения уровня генетической изменчивости отселектированных перспективных генотипов по сравнению со всеми клонами плюсовых деревьев.
Как показывает анализ изменчивости ISSR-фрагментов ДНК, отобранные по признакам роста клоны характеризуются самыми низкими показателями генетического разнообразия по сравнению с другими объектами (табл. 5.3
Полученные данные свидетельствуют о том, что 13 клонов не могут обеспечить сохранение генетического разнообразия обнаруженного в регионе исследования в целом, и в Приволжском лесосеменном районе подрайон Марийский в частности. Следовательно, необходимо провести дополнительные исследования для отбора ценных генотипов с целью использования их на ЛСП повышенной генетической ценности.
В ряде работ отмечается связь между смолопродуктивностью и устойчивостью к патогенам (Шульгин, 1973; Высоцкий, 2002; Павлов и др., 2011 и др.). При селекции сосны обыкновенной важно уделять внимание и данному направлению. При этом подчеркивается, что географическая изменчивость сосны обыкновенной по смолопродуктивности отсутствует, индивидуальный полиморфизм очень высокий, следовательно массовый отбор исходного материала по этому признаку бесперспективен, а высокий селекционный эффект дает индивидуальный отбор (Высоцкий, 2002).
Проведенные исследования показали, что клоны сильно различаются по смолопродуктивности. Это позволило все клоны сгруппировать в 5 категорий смолопродуктивности: очень низкая, низкая, средняя, высокая и очень высокая (см. раздел 4.3). Такая высокая индивидуальная изменчивость клонов создает предпосылки для выделения ценных высокосмолопродуктивных клонов. Установлено, что средняя масса смолы у групп клонов, отнесенных к разным категориям смолопродуктивности, варьирует от 0,18 до 3,12 г (табл. 5.4). Также определено, что среднее значение массы живицы у групп клонов, имеющих высокую и очень высокую смолопродуктивность, достоверно выше по сравнению со средним значением массы живицы у клонов других категорий, достоверность различия варьирует от 7,0 до 26,8, что позволяет данные клоны выделить в качестве перспективных.
Наибольший селекционный эффект наблюдается, когда в качестве перспективных выделяются только клоны, характеризующиеся очень высокой смолопродуктивностью. При ослаблении критериев отбора, когда в качестве перспективных также отбираются клоны из категории «высокая смолопродуктивность», селекционный эффект также достаточно высокий -301,2%.
Таким образом, в результате изучения смолопродуктивности клонов плюсовых деревьев было выделено 17 высокосмолопродуктивных клонов сосны обыкновенной: 171/11, 272/2, 157/2, 173/4, 154/5, 210/6, 191/6, 148/9, 198/8, 230/1, 172/7, 229/2, 181/2, 229/4, 184/7, 269/15, 175/3. Отобранные клоны могут быть рекомендованы для создания лесосырьевой базы повышенной биологической смолопродуктивности, что значительно повысит технико-экономические показатели на добыче живицы. С экономической точки зрения важно, также, что высокосмолопродуктивные деревья сосны обыкновенной более устойчивы к к паразитам и дереворазрушающим грибам (корневой губке), наносящей огромный вред лесному хозяйству, что является предпосылкой для эффективной селекции сосны по комплексу хозяйственно ценных признаков (Высоцкий, 2002). 5.3. Отбор высокоурожайных клонов плюсовых деревьев
Основная задача лесосеменных плантаций заключается в массовом получении улучшенных семян. Поэтому весьма важно, чтобы на ЛСП были представлены высокоурожайные клоны.
