Содержание к диссертации
Введение
1 Введение. 9
2 Обзор литературы: 18
2.1. Современные представления о молекулярных механизмах действия стероидных гормонов. 18
2.2. Лизосомы, особенности их строения и функционирования. 27
2.3. Свободнорадикальное окисление в норме и при патологии. 40
2.4. Липиды кожи. 42
2.5. Значение редокс-системы глутатиона для организма. 45
2.6. Современное состояние вопроса о возможном патогенезе псориаза 52
3 Материалы и методы исследования. 56
3.1. Подготовка тканей и клеток кожи для исследования. 56
3.2. Изучение проникновения 3Н-гидрокортизона, 3Н-эстрадиола, 3Н-прогестерона и 3Н-тестостерона через гематодермальный барьер. 57
3.2.1. Жидкостная сіщнтилляционная радиометрия. - 58
3.2.2. Очистка радиоактивных препаратов от возможных примесей. 59
3.3. Получение фракции лизосом фибробластов.
3.3.1. Анализ чистоты фракции лизосом 60
3.4. Исследование функциональной активности лизосом. 62
3.4.1. Выбор методических условий для определения активности ферментов в коже. 62
3.4.2. Определение активности лизосомальных гликозидаз. 63
3.4.3. Определение активности кислой фосфатазы. 77
3.4.4. Определение активности катепсина Д. 78
3.4.5. Определение активности фосфолипазы А2. 80
3.5. Изучение интенсивности перекисного окисления липидов. 80
3.5.1. Метод хемилюминесценции. 80
3.5.2. Метод определения антиокислительной активности. 82
3.5.3. Определение содержания ТБК-зависимых продуктов. 82
3.5.4. Определение уровня диеновых конъюгатов. 82
3.6. Определение параметров специфического связыва ния меченных стероидных гормонов с плазматиче скими и лизосомальными мембранами фибробластов кожи. 82
3.6.1. Определение параметров связывания меченых гормонов с фибробластами. 82
3.6.2. Определение параметров связывания меченых гормонов с лизосомами фибробластов кожи. 83
3.7. Изучение качественного и количественного состава липидов в тканях кожи. 84
3.7.1 Экстракция липидов из тканей кожи 84
3.7.2. Разделение липидов методом тонкослойной хроматографии на пластинках "Silnfol V-254"/ 85
3.7.3. Идентификация и количественная оценка -различных классов липидов. 85
3.8. Определение уррвня внутриклеточного кальция с помощью зонда Fura-2. 86
3.8.1. Нагружение фибробластов зондом Fura - 2. 87
3.8.2. Расчет содержания ионов кальция в цитоплазме клеток 89
3.9. Определение активности компонентов редокссистемы глутатиона. 90
3.9.1. Определение содержания восстановленного глутатиона вдканях-кожи крыс. 90
3.9.2. Определение активности глутатион - перок-сидазы. 91
3.9.3. Определение активности глутатион-редуктазы. 92
3.10 Краткая характеристика синтетических шрмональных и антигормональных соединений. 93
3.11. Методы получения экспериментальных эндокринопатий. 94
3.12. Определение фаз эстрального цикла у самок крыс. 94
3.13. Определение белка 94
3.14. Статистическая обработка материата. 94
4 Результаты собственных исследований. 95
4.1. Влияние стероидных гормонов на параметры ряда физико-химических процессов в интактных тканях колеи. 95
4.1.1. Проницаемость гематодермального барьера для стероидных гормонов (гидрокортизо-на,эстрадиола, прогестерона и тестостерона). 95
4.1.2 Активность лизосомальных ферментов в тканях и фибробластах интактной кожи крыс. 98
4.12.1 Активность лизосомальных ферментов в тканях интактной кожи крыс' 98
4.1.2.2 Активность ферментов лизосом в фибробла стах интактной кожи крыс. 104
4.1.3. Влияние стероидных гормонов на активность лизосомальных ферментов тканей кожи крыс. 104
4.1.4 Интенсивность перекисного окисления липидов в тканях кожи интактных крыс. 115
4.1.5. Влияние стероидных гормонов на интенсивность перекисного окисления лииидов в коже крыс. 121
4.1.6. Состояние редокс-системы глутатиона в тканях кожи интактных крыс. 143
4.1.7. Влияние стероидных гормонов на состояние редокс-системы глутатиона в тканях кожи крыс. 144
4.1.8. Исследование параметров связывания стероидных гормонов с плазматическими и лизо-сомальными мембранами фибробластов кожи крыс. 157
4.1.9. Влияние стероидных гормонов на липидный спектр лизосомальных мембран фибробластов кожи крыс. 159
4.1.10 Активность фосфолипазы А2 в норме и при действии стероидных гормонов. 163
4.1.11 Исследование влияния стероидных гормонов на базальный уровень кальция в фибробластах. 167
4.2 Показатели исследуемых физико - химических процессов в патологически измененной коше. 170
4.2.1. Активность лизсюомальных ферментов в тканях кожи человека в норме. 170
4.2.2. Активность ферментов лизосом и интенсивность перекисного окисления липидов в дерме и эпидермисе кожи детей, страдающих псориазом. 175
4.2.3. Липидный спектр в тканях кожи больных псориазом 179
4.2.4. РІсследование параметров биологических процессов в коже крыс при эксперимен тальном дерматите и влияние на них стероидных гормонов. 187
4.3. Поиск зффективньїх терапевтических средств для лечения заболеваний кожи путем изучения влияния новых синтетических препаратов с гор мональной и антигормональной активностью на физико-химические процессы в тканях кажи. 193
5 Обсуждение результатов. 197
Выводы 213
- Лизосомы, особенности их строения и функционирования.
- Исследование функциональной активности лизосом.
- Определение уррвня внутриклеточного кальция с помощью зонда Fura-2.
- Интенсивность перекисного окисления липидов в тканях кожи интактных крыс.
Введение к работе
Актуальность исследования. В настоящее время для лечения дерматозов широко используются препараты на основе глюкокортикостероидов. Их противовоспалительная активность в основном обусловлена снижением активности фос-фолипазы A.-Y, что приводит к уменьшению синтеза медиаторов воспаления (лей-котриены, простагландины) из фосфолипидов мембран клеток, а также снижением активности лизосомальных ферментов, что уменьшает проницаемость сосудистой стенки и выраженность отека.
Несмотря на большую противовоспалительную, гипосенсибилизирующую и антитоксическую акіивность, их применение в дерматологической практике ограничено вследствие возможности развития побочных эффектов, во многих случаях носящих неприемлемый характер и/или возобновления заболевания при отмене препаратов [Скрипккн Ю.С. и др., 1997; и др.]. Решить проблему создания более безопасных стероидных препаратов, вероятно, невозможно без выяснения молекулярных механизмов действия стероидных гормонов на ткани кожи.
ЛизосомальныЁ аппарат клеток кожи, выполняющий специализированные функции (кератинизация, пигментация, рост волос, кожная секреция и Т.д.), вероятно, может принимать участие, как в возникновении ее заболеваний, так и в развитии побочных реакций при применении СГ в дерматологической практике. Известно, что активность лизосом изменяется при таких дерматозах как атопический дерматит, экзема, а также при старении кожи [Мушет Г.В., 1987; Diment S. et al, 1995; и др.]; Однако подобные сведения отрывочны и противоречивы.
Проблема чувствительности клеток к гормонам тесно связана с концепцией "узнающих систем" и/или рецепторов, согласно которой без взаимодействия с ними вещество не может действовать на клеточные структуры. Известно, что стероидные гормоны тропны к лизосомам [П.В.Сергеев и др., 1980-99; и др.], а также действуют на фибробласты, в том числе кожи [Hammami М.М., Stiteri Р.С., 1991; Радостина Н.Ю. и др., 1993; и др.]. Однако, несмотря на вышесказанное, а также несмотря на предположение Scego С. [1984] о наличии рецепторов к стероидным гормонам на мембранах лизосом. сведений об их существовании на мембранах
Лизосомы, особенности их строения и функционирования.
Строение лизосом. Лизосомы (Лс) представляют собой гетерогенную группу клеточных органелл, специализирутощихся на поддержании внутриклеточного гомеостаза путем расщепления различных веществ эндогенного и экзогенного происхождения [Альберте Б. и др., 1994]. Они содержат большой набор (более 65 протеаз, нуклеаз, липаз, фосфатаз, сульфатаз и т.д.) гидролитических ферментов, имеющих максимальную активность при кислых значениях рН и способных расщепить практически все существующие субстраты [Покровский А.А., Тутельян В .А., 1976]. Мембраны лизосом, помимо ферментов, содержат уникальные белки и липиды, принимающие участие в узнавании и специфическом слиянии Лс с другими органеллами клетки, защите ли-зосомальной мембраны от воздействия собственных гидролаз, локальном возникновении и поддержании кислых значений рН, а также специфическом транспорте низкомолекулярных веществ через лизосо-мальную мембрану [Топурия М.А., 1981; Тутельян В.А., Гуткин Д.В., 1992; и др.]. Лизосомальные белки, в частности ферменты, синтезируются на полисомах шероховатого ЭПР и имеют N-концевой гидрофобный сигнальный пептид, взаимодействующий с ll-S-рибонуклео-протеидной "узнающей частицей" с последующим перемещением в гладкий ЭПР через его мембрану. Здесь отщепляется N-концевой сигнальный пептид и 3 остатка глюкозы [Van der Spoel A. et al., 2000; и др.]. До этого момента судьба ферментов и белков мембран Лс, а также белков плазматических мембран одинакова. Далее происходящие с ними изменения идут по-разному, что достигается различиями в их последующей модификации и транспортировке. К олигосахаридной цепи мембранных белков присоединяются сиаловые кислоты, а в такой же цепи ферментов Лс фосфорилируются остатки маннозы [Conner G.E. et al., 1989] и (в аппарате Гольджи) формируются остатки маннозо-6-фосфата, связывающиеся затем в мембранах Лс с маннозо-6-фосфатными рецепторами. Последние являются трансмембранными белками, "узнающими" и связывающими только лизосомальные ферменты, выделяя их из дру- гих белков [Warren L., 1989]. К настоящему времени изучено два таких рецептора.
Первый - одноцепочечный гликопротеид, являющийся ка-тионнезависимым рецептором (КНР) [Chen H.J. et al., 1993]. Второй -гликопротеид с вдвое большей молекулярной массой, треб тощий для взаимодействия с: дизосомальными ферментами наличия Мп и 2+ Mg ,т.е. катионзависимый рецептор (КЗР). Дальнейшее преобразование первичных Ле сопровождается снижением рН среды, в которой фермент-рецепторный комплекс диссоциирует и освободившийся рецептор возвращается в аппарат Гольджи для дальнейшего участия в транспорте лизосомальных энзимов [Ludwig Т. et al., 1994],а высвободившийся фермент подвергается в Лс ограниченному протеолизу (например, на прокатепсин Д действует карбоксипептидаза V) и превращается в зрелый энзим [Delbruck R., 1994; Muno D. et al., 1993; Richo G.R., Conner G.E., 1994]. Белками, специфичными только для лизосомальной мембраны, являются гликопротеины с большим количеством N-связанных олиго-сахаридных цепей. Сразу после их синтеза, N-концевой сигнальный пептид связывается с узнающим рибонуклеопротёидом, транспортирующим его через мембрану ЭПР. В дальнейшем, после отщепления сигнального пептида, белки гликозилируются, присоединяют ацетил-нейраминовую кислоту и транспортируются в лизосомы (также как и ферменты с помощью маннозо-6-фосфатных рецепторов) [Honing S., 1995]. Кроме белков, в Лс содержатся различные липиды, играющие важную ст тст)рно-функциональную роль. Так, все лизосомальные мембраны построены по типу глобулярных мицелл, представляющих собой цепочку из отдельных шаровидных комплексов фосфолипидов" (ФЛ), чередующихся с глобулярными молекулами белков. Между ми-целлярным и глобулярным состоянием мембран существует динамическое равновесие, сдвигающееся в ту или иную сторону в зависимости от изменений условий обитания. При снижении проницаемости мембрана имеет глобулярное строение, а при повышении - мицеллярное. В соответствии с этим автор считает, что вещества - "лабилизаторы" вызывают мицеллярную перестройку мембран Лс с высвобождением из них ферментов. Липиды Лс, представлены гликолипидами, холестерином (Хс) и ФЛ (лизоФХ, ФХ, фосфатидиглицерин, Кл, ФЭА, ФИ, ФС) [Покровский А.И., Тутельян В.А., 1976; Крепе Е.М., 1981; и др.]. При этом на 1 молекулу Хс приходится 2 молекулы ФЛ. Насыщенность мембран Лс жирными кислотами с 16 - 18 углеродными атомами, видимо, способствует их большей "стабильности по сравнению с другими субклеточными мембранами [Владимиров Ю.М., 1997; Гуров В.А., 1994]. Липиды мембран лизосом проявляют наибольшее сходство (по сравнению с другими клеточными органеллами) с липидами ПМ.
Так, для обоих типов мембран характерно высокое содержание СФМ и Хс, а насыщенность жирных кислот (в основном пальмитиновой и стеариновой) индивидуальных ФЛ значительно выше, чем во фракциях митохондрий и микросом. Также сходным оказался и общий аминокислотный состав белковой части ПМ и ЛсМ. Однако отдельные белковые компоненты и ферменты в них существенно различаются друг от дру-га..Так, и ПМ и ЛсМ содержат 5-нуклеотидазу и лейцинаминопептида-зу, различающихся, однако, по своей субстратной специфичности, оп- тимальной рН (кислой для Лс и слабощелочной для ПМ) и отношению к различным ионам. Как известно, ЛсМ могут "встраиваться" в ПМ или, наоборот, "отшнуровываться" от них, однако этот процесс связан, по - видимому і с глубокими перестройками химического состава и эн-зиматических свойств мембран. Локализованные в Лс гликолипиды, представлений, в основном, ганглиозидами GMi, GM3 и GD!a, а также гликосфинголипидами в виде моно-, ди- и тригексозилцерамидов, находятся во внутреннем слое мембран. Основная часть их анионных группировок связана с сиало-выми кислотами и направлена в сторону матрикса, что, возможно, обуславливает их способность ингибировать ряд кислых гидролаз: р-галактозидазу, арилсульфатазу, кислую фосфатазу и др. [Gaffer LM, Smool К., 1996]. Функции лизосом. Первоначально лизосомам отводили роль орга-нелл, осуществляющих только внутриклеточный катаболизм различных эндогенных и экзогенных субстратов. Такие "физиологические" функции Лс в настоящее время подразделяют (в зависимости от природы объекта лизосомальной атаки) на гетеро- и аутофагоцитарные, что позволяет им осуществлять "защитную" (расщепление различных ксенобиотиков, в том числе микроорганизмов, вирусов и т.д.), "санитарную" (утилизация "отживших" клеточных структур) и "пищеварительную" (утилизация избытка аккумулированных в клетке пищевых веществ) функции. Позже было показано, что лизосомы участвуют не только в ката-болических, но и в анаболических клеточных процессах. С одной стороны, Лс, выполняя катаболическую роль, поставляют "строительный" материал для нового синтеза. С другой стороны, показано, что транслокация Лс к ядру лежит в основе усиления синтеза белка для физио- логической регенерации клетки, а также ее подготовки к митозу и пролиферации [Колпакова СЕ. и др., 1987; Rotbell G., 1995; и др.]. В настоящее время Лс признаны ключевым звеном в поддержании гомеостаза организма и его адаптации к изменению условий среды обитания [Панин Л.Е., Маянская Н.Н., 1987; и др.]. В этом аспекте Лс активно участвуют в энергетическом, антигенно-структурном и информационном гомеостазе. Разберем их более подробно. Субстратами образования АТФ могут быть углеводы или жирные кислоты. В первом случае АТФ образуется путем гликогенолиза, а во втором - путем Р-окисления свободных жирных кислот. Лизосомы играют первостепенную роль в энергетическом гомеостазе. В норме они участвуют в энергетическом обеспечении репара-тивных и других клеточных процессов. Например, они могут участвовать в гликолизе, активируя фосфофруктокиназу (за счет ее протеоли-за) [Колпакова СЕ. и др., 1987].
Исследование функциональной активности лизосом.
В настоящей работе определяли активность пяти лизосомальных ферментов: Р-глюкозидазы, р-галактозидазы, кислой фосфатазы, ка-тепсина Д и фосфолипазы А2 в гомогенатах дермы и эпидермиса кожи крыс (самцов и самок). Методы определения четырех первых ферментов основаны на спектрофотометрическом определении изменения количества продуктов реакции, катализируемой соответствующим энзимом. 3.4.1. Выбор методических условий для определения активности ферментов в коже. При отработке методов определения активности ферментов предварительно опытным путем были подобраны условия гомогенизации, время инкубации ферментного препарата с субстратом, детергент и его концентрация в пробе. При выборе условий гомогенизации была исследована зависимость активности ферментов от времени гомогенизации тканей (рис.2-4). Как видно из графиков, оптимум активности всех исследуемых энзимов лизосом в дерме выявляется при 3-х минутной гомогенизации ткани, а в эпидермисе - при 5-ти минутной гомогенизации ткани на РТ-2 (и в дерме и в эпидермисе режим работы РТ-2 = 3000 об/мин). На следующем этапе подбирали оптимальные время и температуру инкубации ферментных препаратов в гомогенате с субстратами. Зависимость активностей ферментов от этих параметров эксперимента приведена на рис. 2-11. При этом для р-глюко- и Р-галактозидаз и кислой фосфатазы оптимальными оказались 30 минут инкубации при температуре 37С, а для катепсина Д - 1 час при температуре 45С. Выбор детергента проводили из тритона XI00, додецила сульфата натрия, а также УЗ воздействия на гомогенат или трехкратного замораживания-оттаивания. Данные этого исследования представлены на рис. 12. В результате анализа полученных данных в качестве детергента был выбран тритон Х-100. Известно, что этот неионный детергент при определенных концентрациях способен угнетать активность гликозидаз. В связи с этим была изучена зависимость величин общей активности ферментов от концентрации тритона Х-100 в пробах. Результаты этих опытов представлены на рис. 13. В дальнейшем при проведении экспериментов по определению общей активности ферментов использовали конечную концентрацию детергента в пробе 0,1%. 3.4.2. Определение активности лизосомальных гликозидаз.
Активность гликозидаз определяли по методу Patel и Tappel (1969). В качестве субстратов брали р-нитрофенильные производные гликозидов. Экстинкцию р-нитрофенола, продукта, образующегося в процессе ферментативной реакции, определяли на СФ-46 при длине волны 420 нм. К природным субстратам, гидролизующимся р--глюкозидазой (КФ 3.2.1.21.) относятся р-глюкозиды гликопротеинов, мукополисаха-рид-белковые комплексы; последние соединения, а также р- галактози-ды гликопротеинов и гликолипидов, гидролизующиеся Р-галактозидазой (КФ 3.2.1.23.). Пробы инкубировали при 37 С в течение 30 минут. Затем в пробы добавляли по 0,5мл трихлоруксусной кислоты (ТХУ, 25%), встряхивали и помещали в ледяную баню на 10 минут для остановки реакции. От образовавшегося осадка избавлялись центрифугированием при 4000 об/мин в течение 10 минут. Затем к І мл надосадочной жидкости добавляли 1,5 мл 2М аммонийного буфера (рН=10,8). Оптическую плотность проб измеряли на спектрофотометре "Specord М 400 "(Герма- ния) при длине волны 420 нм против смеси цитрат-фосфатного и аммонийного буферов (1:1). Активность ферментов рассчитывали по формуле: А = где: К ТВ А - активность фермента в мкмоль / мин на 1 г белка; Е."- прирост экстинкции за счет ферментативного расщепления субстрата; К - коэффициент, равный экстинкции 1 мкмоля р-нитрофенола в пробе; Т - время инкубации в минутах; В - количество белка в пробе в мг. Для определения общей активности ферментов к пробам добавляли Тритон-Х 100 в конечной концентрации 0,1%. Кислая фосфатаза (КФ 3.1.3.2.) катализирует гидролитическое расщепление органического фосфорнокислого эфира [Баррет А. Дж. и др., 1980]. В норме в коже она обнаружена (гистохимически) в зернистом и нижних рядах рогового слоев эпидермиса, а также в дерме [Чернух A.M., 1982] и локализуется как в матриксе, так и в мембранах лизосом [Покровский А.А., Тутельян В.А., 1976). Активность фермента исследовали в гомогенатах тканей кожи крыс. Общую активность определяли в присутствии неионного детергента тритона Х-100 (изооктил-фенокси-полиэтокси-этанола), конечная концентрация которого в пробе составляла 0,1%. Свободную активность определяли в тех же условиях, но без добавления в пробы детергента. Пробы тщательно перемешивали и инкубировали при 37 С в течение 30 минут. Затем в пробы добавляли по 1 мл 10% ТХУ, встряхивали и помещали их в ледяную баню на 10 минут для остановки реакции. От образовавшегося осадка освобождались путем центрифугирования при 5000 об / мин в течение 10 минут. Далее к 1,5 мл центрифу-гата добавляли 1 мл 2,5% раствора молибдата аммония и 1 мл 1% аскорбиновой кислоты, приготовленной на 0,1 н растворе соляной кислоты. Оптическую плотность проб измеряли на "Specord М 400"(Германия) при длине волны 750 нм против дйстилированной воды. Активность фермента выражали в мкмолях освободившегося неорганического фосфата за 1 минуту на 1 мг белка. Содержание неорганического фосфата определяли по методу Lowry в модификации В.П. Скулачева (1962). 3.4.4. Определение активности катепсина Д (по методу Баррета А.Дж.идр..1980). Характеризуя субстратную специфичность действия катепсина Д следует подчеркнуть его незначительную активность к субстратам с низким молекулярным весом и высокую интенсивность гидролиза гемоглобина, который в кислой среде предварительно распадается на че- тыре субъеденицы [Баррет А.Дж. и др., 1980]. Максимальная активность этого фермента при гидролизе гемоглобина колеблется в пределах рН= 3,0-3,5.. Гистохимически в коже катепсин Д расположен диффузно в зернистом и, в меньшей степени, в базальном слое эпидермиса, в волосяных фолликулах, в сальных железах и в мезенхимальных клетках дермы [Чернух A.M., 1982].
Активность фермента определяется в гомогенатах тканей кожи крыс. Общую активность определяли в присутствии (а свободную -без) тритона Х-100, конечная концентрация которого в пробе составляла 0,1%. Пробы тщательно перемешивали и инкубировали при 45 С в течение 1 часа. Затем добавляли в пробы по 5 мл 3% ТХУ, встряхивали и помещали в ледяную баню на 10 минут для остановки реакции. От образовавшегося осадка избавлялись путем центрифугирования в течение 10 минут при 4000 об / мин. Далее отбирали супернатант и определяли оптическую плотность проб на "Specord М 400" (Германия) при длине волны 280 нм против дистиллированной воды. Активность фермента выражали в мкмолях расщепленного субстрата на мг белка. Метод основан на определении радиоактивных продуктов гидролиза фосфолипидов, которые в отличие от меченого субстрата способны растворяться в воде [Schwerts D.W. etal., 1984]. В качестве субстрата реакции использовали 1-ацил-2/1-,4С-арахноидил-глицеро-3-фосфохолин с удельной радиоактивностью 2,33 нСЇ/мкг фосфолипида. В инкубационную смесь входили 0,198 мкСі субстрата, трис-НС1 буфер (20мМ трис, рН = 8,4; 0,1 мМ СаСЦ). Реакцию запускали добавлением к инкубационной смеси 0,3 мл свежеприготовленного гомоге-ната. Затем смесь инкубировали в течение 40 минут при 37С. Реакцию останавливали добавлением смеси хлороформ: метанол (2:1 по объему). Липиды экстрагировали по Фолчу JTFolch J. etal., 1957] и хромото-графировали в тонком слое силикагеля. Свободную жирную кислоту с фрагментом фольги помещали в сцинтилляционную жидкость и ра-диометрировали на "Intertechnique SL-40 "(Франция). Кривые Fe -индуцированной Хл прописывались на специальной установке. Хемилюминесценцию гомогенатов дермы и эпидермиса регистрировали следующим образом. В термостатируемую кювету последовательно добавляли 4,5 мл фосфатного буфера (20 мМ К2НРО4, 105 мМКСІ, рН = 7,4), 0,5 мл гомогената, 1мл 2,7 мМ эозина. По истечении 2 минут инкубации смеси в систему вводили 1 мл 10 мм FeSO. . Регистрировали интенсивность свечения в течение 15 - 20 минут. 3.5.2. Метод определения антиокислительной активности (по Заглядскому В.П. с соавт.. 1982: Кухтиной Е.Н. с соавт.. 1983). Для предварительного тестирования всех исследуемых стероидных гормонов на наличие антиокислительной активности (АОА) и определения ее в гомогенатах тканей кожи (а также в их водной фазе) использовали модельную систему, в качестве которой была взята суспензия липопротеинов желтка куриного яйца.
Определение уррвня внутриклеточного кальция с помощью зонда Fura-2.
Зонд FURA-2 относится к семейству флуоресцентных зондов, способных регистрировать концентрацию кальция в клетках. Он содержит 4 карбонильные группы, связывающие ионы кальция координационными связями по типу ЭДТА, и хромофорные группы, изме-няющие свои свойства при образовании комплексов с ионами Са .. В виде тетра-ацетоксиметилового эфира, который обозначается как FURA-2 / 2АМ, в силу своей гидрофобности, флуоресцентный индикатор проникает через плазматическую мембрану в цитоплазму, где гид-ролизуется до тетракислоты внутриклеточными эстеразами. Преимуществом этого зонда является высокое абсолютное значение квантового выхода при существенном влиянии кальция на положение максимумов спектра возбуждения флуоресценции. Влияние на спектр флуорес- ценции при этом незначительно [Aimers W. et al., 1992; Takeshinge К. et al., 1981]. Параметры зонда FURA-2 / AM представлены на рис. 16. Для нагрузки клеток флуоресцентным индикатором к культуре фибробластов добавляют на 5 млн клеток 50 мкл 0,1 М раствора FURA-2 в диметилсульфоксиде и инкубировали при 37С в течение 40 минут. Оптимальное время инкубации было подобрано в предварительных экспериментах. Далее клетки снимали с поверхности стекла 0,25 % раствором трипсина, который инактивировали, смывая клетки 5-Ю мл HEPES - буфера. Затем внеклеточный флуоресцентный индикатор тщательно отмывали HEPES - буфером. Промывка производилась осаждением в центрифуге при 1500 оборотах в течение 2 минут. Супернатант отбрасывали, ресуспендирование проводилось встряхиванием в несколько меньшем объеме HEPES - буфера. Затем 2 мл суспензии (кон-центрация 500 тыс. клеток / мл ) помещали в ячейку спектрофлуори-метра Hitachi MPF-3, термостатируемую при 37С. Длина оптического пути составляет 1 см, ширина щели 8 - 10 нм. Длины волн возбуждения 340 нм и 380 нм, регистрации 500 нм. Концентрация Са2+ пропорциональна отношению концентраций связанной и свободной форм зонда. Изменение мутности среды, общей концентрации зонда в в рабочем объеме и другие факторы, вызывающие пропорциональное изменение составляющих спектра, не влияют на конечный результат. Внутриклеточную концентрацию кальция рассчитывали на основании измерений при двух длинах волн возбуждения (Fi и F2), используя следующий прием.
В общем виде значения интенсивностей, соответствующие этим двум длинам волн можно выразить как где Ср и Q, - концентрации свободного индикатора и его комплекса с кальцием соответственно, a S - фактор, зависящий от коэффициента поглощения, интенсивности возбуждающего света, длины оптического пути в кювете, квантового выхода. Вводя параметр R = F1/F2 и применив уравнение закона действующих масс для реакций первого порядка Сь = Ср[Са ]/Kd можно перейти к выражению: (Spl + Sb Ca /Kd) (Sp2 + SbiiC /Yi,) = R и, решая его относительно R, получаем: [Са2+] = Kd(R - Rffli„))/(Rmax - R)/(Sp2/Sb2), где при Ср = 0, т.е. Rmax = Sbi/Sb2. Конечная формула принимает вид: [Ca2+] = Kd(R- Для определения параметров R и Rmin необходимо соблюсти условия, когда практически весь зонд находится в связанном и свободном состоянии соответственно. F - регистрируемый уровень флуоресценции. Kd =225 пМ при рН = 7,35. Для определения Rmax плазматическую мембрану фибробластов, содержащихся в среде с насыщающей для FURA концентрацией Са (более 1000 КД разрушали 40 мкМ ди-гитонином (детергент, разрушающий мембрану с высоким содержанием холестерина, которой является плазматическая мембрана клетки в отличие от мембран внутриклеточных органелл). R n определяли, до-бавляя после этого 5 мМ МпСІг, который вытесняет Са из комплекса с красителем. В нашем случае Fi - интенсивность флуоресценции, регистрируемая при 500 нм, длина волны возбуждения 340 нм, F2 - интенсивность флуоресценции, регистрируемая при 500 нм, длина волны возбуждения 380 нм [Орлов С.Н. с соавт. 1989; Aimers W. et ah, 1992]. 3.9. Определение активности компонентов редокс-системы глутатиона. 3.9.[.Определение содержания восстановленного глутатиона (GSH) в тканях кожи крыс (по модифицированному методу Sedlak S.J 968). Принцип метода основан на спектрофотометрическом измерении количества продуктов реакции GSH с дитионитробензойной кислотой (DTNB), быстро восстанавливающей сульфгидрильные группы при реакции с донорами водорода с образованием устойчивого аниона желтого цвета. Ход определения. К 5 мл гомогената добавляют 4 мл дистиллированной воды и 1 мл 40% раствора ТХУ. Пробы встряхивали и центрифугировали в течение 15 минут при 3000 g. Отбирали по 2 мл супернатанта и добавляли к ним по 4 мл трис-HCL буфера (0,4 М, рН=8,9) и по 0,1 DTNB (0,01М). Пробы встряхивали. Оптическую плотность полученных проб определяли на спектрофотометре при длине волны 400 нм против контроля. В контрольных пробах вместо гомогената использовали трис - HCL буфер в том же объеме. Содержание GSH в ткани рассчитывали по калибровочному графику. 3.9.2. Определение активности глутатион - пероксидазы (по методу Beutler Е.. 1975).. Принцип метода основан на реакции окисления GSH, катализируемой глутатионпероксидазой до образования окисленной формы глутатиона (GSSG): где ROOH - пероксид.
Для количественного определения активности данного фермента самым подходящим субстратом, как показано , является Т - бутил гид-ропероксид. Скорость образования GSSG при этом определяется интенсивностью его расходования в реакции: Активность фермента измеряется за счет степени окисления NADPH, о чем судят по изменению оптической плотности проб, определяемой на спектрофотометре при длине волны 340 нм. Ход определения. К 100 мкл трис-HCL буфера (1М, с добавлением - в конечной концентрации - 5 мМ трилона В, рН = 8) последовательно добавляют 20 мкл GSH (ОДМ), 100 мкл GSH-Red (10 U/мл), ЮОмкл NADPH (2мМ), 10 мкл гомогената и 660 мкл дист.воды. Содержимое проб встряхивают и инкубируют при 37С в течение 10 минут. После инкубации к пробам добавляли по 10 мкл Т-бутил-гидропероксида (1:1000 v/v) и измеряли оптическую плотность проб при длине волны 340 нм против контроля, содержащего все те же компоненты за исключением субстрата. Активность фермента рассчитывали по формуле: AOD - разность оптических плотностей в контроле и образце; Сб - концентрация белка в пробе (мг/мл); Vc - общий объем пробы; VH - объем гомогената в пробе; 6,22 - коэффициент экстинкции ( DD 1М NADPH при X = 340 нм). 3.9.3. Определение активности глутатион-редуктазы (по методу Ferrone S. et al.. 1970). Принцип метода основан на измерении окрашенного продукта реакции, катализируемой данным ферментом: GSSG + NADPH + ІҐ- 2 GSH + NADP+. Ход определения. К 2,3 мл трис-HCL буфера добавляли 0,2 мл раствора ЭДТА (под-титрованного до рН. буфера), 0,2 мл NADPH (0,14 мМ на буфере), 0,2 мл GSSG (1,08 на буфере). Реакцию "запускали" добавлением 0,1 мл гомогената и на спектрофотометре замеряли "падение" оптической плотности (А== 340 нм). 3.10. Краткая характеристика синтетических гормональных и антигормональных соединений. Из синтетических гормональных и антигормональных соединений в настоящей работе использовали следующие: - эстроген - нистранол, - гестаген - мецигестон, - глюкокортикоид - ацетиландрозол, -антиэстрогены - тамоксифен-цитрат, кломифен-цитрат, КЛИ-418 и КЛИ-423. Ацетиландрозол и мецигестон синтезированы А.В. Камерницким с сотрудниками в институте органической химии им. Н.Л.Зелинского на основе 17-3-оксопентарана. Оба препарата обладают специфической гормональной активностью. Нистранол синтезирован в ЭНЦ РАМН (в лаборатории В.М. Ржезникова). Препарат является производным этинилэстрадиола и обладает специфическим эстрогенным эффектом, превосходящим все известные эстрогены. Все антиэстрогены синтезированы во ВНИХФИ им. С. Орджоникидзе Г.С. Гриненко с сотрудниками и относятся к производным три-фенилэтилена. 3.11.Методы получения экспериментальных эндокринопатий. Адреналэктомию, овариэктомию (самок) и орхидэктомию (самцов) крыс проводили по общепринятым методикам, описанным Кир-шенблат Я.Д. [1969].
Интенсивность перекисного окисления липидов в тканях кожи интактных крыс.
В опытах in vitro в концентрациях меньше 10 3М тестостерон вызывал снижение активностей ферментов и их соотношений, за исключением общей активности гликозидаз в тканях кожи самцов, где они, наоборот, повышались. В концентрации 10 3М гормон оказывал действие сходное с действием тестостерона in vivo в дозе 10 мг/кг. У орхидэктомированных животных наблюдали повышение активностей гликозидаз (в среднем на 5-12%) и снижение высвобождения из Лс катепсина Д (в 1,2 раза) и кислой фосфатазы (в среднем на 8%). Заместительная терапия тестостероном возвращала величины активностей ферментов к исходным значениям. Таким образом, на основании приведенных, в данной главе результатов, можно заключить, что все исследованные стероидные гормоны изменяют функциональную активность Лс тканей кожи. При этом половые стероиды, в отличие от гидрокортизона, в большей степени влияют на активность гликозидаз и, следовательно, на катаболизм гликозаминогликанов и гликопротеидов. Гидрокортизон больше действует на активность катепсина Д и, соответственно; расщепление катеп-син Д-зависимых протеинов. В дерме и эпидермисе кожи интактных крыс были изучены следующие параметры уровня перекисного окисления липидов: амплитуда "медленной вспышки" железоиндуцированной хемилюминесценции -Нмв, а также содержание промежуточных (диеновых конъюгатов) и конечных (ТБК-активные) продуктов ПОЛ. Их значения определяются как скоростью образования свободных радикалов, так и антиокисли тельной активностью ткани со способностью их липидов к свободно-радикальному окислению. Величины всех исследованных параметров ПОЛ, как оказалось, превалировали в тканях кожи самцов по сравнению с кожей самок; их-значения были выше в дерме, чем в эпидермисе (табл. 8). Однако эта разница не носила статистически достоверного характера. При исследовании активности водорастворимых антиоксидантов тканей кожи, наоборот, регистрировали более высокие значения АОА у самок по сравнению с самцами. Кроме того антиокислительная активность превалировала в дерме по отношению к эпидермису. Изучение зависимости интенсивности ПОЛ от эстрального цикла у самок статистически достоверной разницы значений исследуемых показателей не выявило.
Для выявления геронтологических особенностей переокисления липидов в тканях кожи были проведены эксперименты с использованием трех возрастных групп крыс, а именно: неполовозрелых крысят (2 -3 недели), молодых половозрелых (4-6 недель) и старых (более 6 месяцев) крыс. Значения параметров интенсивности ПОЛ (амплитуда "медленной вспышки" ХЛ и содержание продуктов ПОЛ) в тканях кожи крыс оказались наиболее высокими в третьей возрастной группе животных, а наименее высокими - во второй группе (табл. 9). Антиокислительная активность тканей кожи с возрастом животных снижалась (рис. 21). Таким образом, интенсивность ПОЛ и уровень АОА в тканях кожи крыс так же, как и активность ферментов Лс, зависит от пола и воз- раста животных, вида исследуемой ткани и практически не зависит от эстрального цикла. Предварительно перед изучением действия СГ на параметры ПОЛ в тканях кожи крыс на модельной системе была исследована АОА самих гормонов. Оказалось, что из используемых СГ только гидрокортизон и эстрадиол являются прямыми антиоксидантами, т.е. понижают амплитуду и угол наклона кинетической кривой "медленной вспышки" ХЛ (снижают количество свободных радикалов - рис. 22). В экспериментах in vitro гидрокортизон и эстрадиол дозозависи-мо уменьшали амплитуду "медленной вспышки" (табл. 10-13) в дерме и эпидермисе, начиная уже в концентрации 10 7 М. Эстрадиол при этом снижал также в тканях кожи и содержание ТБК-активных продуктов ПОЛ. Аналогичное действие прогестерона и тестостерона регистрировали лишь начиная с концентрации 10"5М (табл. 14-20). В опытах in vivo подкожное введение гормонов в дозе 1 мг/кг (5 мг/кг для прогестерона) вызывало следующие изменения интенсивности ПОЛ тканей кожи. Гидрокортизон и эстрадиол (табл.21, 22) снижали образование свободных радикалов (уменьшение Нмв ХЛ) приблизительно на 30% в зависимости от гормона и ткани; эстрадиол, кроме того, уменьшал содержание конечных продуктов ПОЛ (табл.. 22). Прогестерон и тестостерон статистически достоверных изменений уровня липопероксида-ции в дерме и эпидермисе кожи крыс обоего пола не вызывали (табл. 23-28). При десятикратном увеличении дозы СГ (трехкратном увеличении для прогестерона) (табл. 21-28) отмечали статистически достоверное снижение уровня ПОЛ, зависящее от исследуемого гормона. Так, эстрадиол и прогестерон уменьшали интенсивность ПОЛ по всем исследуемым показателям в обеих тканях кожи самцов и в дерме самок, а гидрокортизон вдвое (по сравнению с нормой) снижал образование свободных радикалов и содержание конечных продуктов ПОЛ в обеих тканях кожи независимо от пола крыс. Тестостерон, в отличие от других СГ, не вызывал статистически достоверных изменений параметров ПОЛ. При исследовании влияния СГ (в дозе 10 мг/кг и для прогестерона 15мг/кг) на интенсивность ПОЛ в дерме и эпидермисе кожи крыс в зависимости от времени после введения гормонов оказалось, что максимум гормонобусловленного снижения интенсивности ПОЛ в коже регистрируется спустя 1 час с момента начала гормонального воздействия (для всех СГ). В дальнейшем прогестерон вызывал лишь статистически недостоверное повышение Нм.в. спустя 3 часа (в эпидермисе) и 6 часов (в дерме) после своего подкожного введения.
Эстрадиол, в отличие от остальных исследуемых СГ, обладает статистически достоверным двухфазным действием на интенсивность липопероксидации, а именно: 1) снижением уровня окисления липидов (с максимумом через 1 час после его подкожного введения), наиболее выраженное в эпидермисе (около 45% от контроля), 2) увеличением липопероксидации через 2 часа (при максимуме через 3 часа) после его инъекции, наиболее выраженныь в дерме (около 39% от контроля). К исходным значениям показатели интенсивности ПОЛ в коже крыс возвращались через 4-6 (тестостерон, гидрокортизон) и 12-18 часов (прогестерон и эстрадиол) после введения гормонов. Овариэктомия и адреналэктомия, но не орхидэктомия, повышают интенсивность процессов ПОЛ в тканях кожи крыс (табл. 29, 30). Эти изменения нивелировались эстрадиолом (но не прогестероном) и гидрокортизоном, соответственно. Таким образом, все исследованные стероидные гормоны (гидрокортизон, эстрадиол, прогестерон и тестостерон) обладают антиокислительным действием на структуры тканей кожи. Наиболее выраженным антиоксидантным эффектом обладает эстрадиол, а наиболее слабым - тестостерон. При этом эдействие СГ на кожу зависит от гормона, ткани, на которую он действует, и времени гормонального воздействия. 4.1.6. Состояние редокс-системы глутатиона в тканях кожи интактных крыс. Согласно литературным данным, антиперекисная система глутатиона присуща всем тканям в организме. Однако сведений об активности ее компонентов в тканях кожи в доступной литературе не встречается. В связи с этим в дерме и эпидермисе кожи крыс изучали параметры редокс-системы глутатиона (РСГ), а именно: содержание восстановленного глутатиона (GSH), активности глутатион-редуктазы (GSH-red) и глутатион-пероксидазы (GSH-per). Проведенные эксперименты показали наличие всех указанных параметров редокс - системы глутатиона в дерме и эпидермисе кожи крыс обоего пола. При этом более высокое содержание GSH отмечалось в коже самок по сравнению с самцами; уровень глутатиона отличался также более высокими значениями в дерме по сравнению с эпидермисом (табл. 31). Однако эта разница не носит статистически достоверного характера за исключением различия между содержанием глутатиона в дерме и эпидермисе самцов. При исследовании параметров редокс-системы глутатиона в дерме и эпидермисе кожи крыс в зависимости от их возраста (неполовозрелые, половозрелые молодые и старые) (табл.31) оказалось, что у половозрелых молодых крыс содержание GSH и активность исследуемых ферментов в обеих тканях выше, чем в коже крыс других возрастных групп, и превалирует в эпидермисе.
![Медико-социальное исследование рака кожи (распространенность, факторы риска, совершенствование специализированной помощи) [Электронный ресурс]](/i/i/4368/203290.png "Медико-социальное исследование рака кожи (распространенность, факторы риска, совершенствование специализированной помощи) [Электронный ресурс] Нефедов Олег Николаевич")
