Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы. 12
1.1. Этиопатогенез инсульта. Моделирование цереброваскулярной патологии in vivo 12
1 1.1 Распространенность и этиология инсульта 12
1.12. Классификация инсультов в клинике Формирование патологического очага 16
1.1.3. Экспериментальные модели инсульта in vivo... 18
1.1.4. Механизмы вторичных повреждений мозга при ишемии 25
1.1.5. Экспериментальное воспроизведение механизмов инсульта 33
1.2. Принципы комплексной терапии инсультов 36
1.2.1. Нефармакологические способы коррекции 36
1.2.2. Фармакологические препараты, применяемые для лечения инсультов 37
1.2.2.1. Реперфузионная терапия 39
1.2.2.2. Первичные нейропротекторы 39
1.2.2.3. Вторичные нейропротекторы 42
1.2.2.4. Восстановительная терапия 44
1.2.3. Применение пептидов в качестве нейропротекторов. Ноопепт-дипептидиый препарате ноотропной и нейропротектнвной активностью 46
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования материалы 53
2.1. Исследование ноотропной активности 53
2.1.1 Тест условного рефлекса пассивного избегания (УРПИ) 54
2.1.2. Тест условного рефлекса активного избегания (УРАИ) 56
2.1.3. Модель гнпобарическон гипоксии в барокамере .58
2.2. Изучение эффекта на различных моделях инсульта 58
2.2.1. Исследование ноотропной активности
2.2.1.1. Модель локального фотохимического повреждения префронтальной коры головного мозга крыс 59
2.2.1.2. Методика интрацеребральной посттрааматической гематомы..63
2.2.2. Исследование нейропротективной активности
2.2.2.1. Модель локального фотохимического повреждения префронтальной коры головного мозга крыс 67
2.2.2.2. Методика дисталыюй окклюзии задней ветви средней мозговой артерии (ОЗВСМА) 68
2.3. Изучение механизмов нейропротективного действия 72
2.3.1 Методика высвобождение глутамата срезами коры головного мозга крыс 72
2.3.2. Модель Рег-индуцированной хемилюминссценции липопротеинов сыворотки крови человека 77
2.4 Фармакокинетические исследования 79
ГЛАВА 3. Результаты исследования 80
3.1 Изучение ноотронной активности инъекционной формы ноопепта 80
3.1.1. Оценка влияния ноопепта на обучаемость в тесте условного рефлекса пассивного избегания (УРПИ) 80
3.1.2. Влияние ноопепта на обучаемость в тесте условного рефлекса активного избегания (УРАИ) 87
3.1.3. Исследование антигипоксического действия ноопепта 89
3.2. Активность ноопепта на различных моделях инсульта 89
3.2.1. Изучение ноотропного эффекта ноопепта - 90
3.2.1.1. Анализ активности ноопепта на модели локального фотохимическою повреждения префронтальной коры головного мозга крыс 90
3.2.1.2. Исследование эффекга ноопепта на модели интрацеребральной посттравматической гематомы 92
3.2.2. Исследование нейропротективного эффекта ноопепта 101
3.2.2.1. Изучение действия ноопепта на модели локального фотохимического повреждения префронтальной коры головной о мозга крыс 101
3.2.2.2. Исследование эффекта ноопепта на модели дистальной окклюзии задней ветви средней мозговой артерии (ОЗВСМА) 102
3.3. Изучение механизмов иейропротективного действия ноопепта 105
3.3.1. Анализ влияния ноопепта на высвобождение лутамата срезами коры головного мозга крыс 105
3.3.2. Оценка активности ноопепта на модели Fe2+-индуцированной хемилюминесценции липоиротеинов сыворотки крови человека 109
3 4 Фармакокинетическис исследования ноопепта 113
Заключение 117
Выводы 133
Список литературы 134
- Классификация инсультов в клинике Формирование патологического очага
- Применение пептидов в качестве нейропротекторов. Ноопепт-дипептидиый препарате ноотропной и нейропротектнвной активностью
- Методика дисталыюй окклюзии задней ветви средней мозговой артерии (ОЗВСМА)
- Исследование эффекта ноопепта на модели дистальной окклюзии задней ветви средней мозговой артерии (ОЗВСМА)
Введение к работе
Актуальность исследовании.
Разработка веществ с нейрон роте ктивноЙ активностью является одной из самых актуальных задач современной фармакологии. Действие препаратов данного класса направлено на защиту клеток головного мозга в условиях развивающихся метаболических нарущений. которые имеют место при нейродегенеративных расстройствах (болезнь Альшеймера. Паркинсона). травме мозга, инсультах. Хотя для каждого из этих заболеваний имеются свои специфические механизмы, существуют и общие патогенетические звенья указанных состояний: метаболическая триада (увеличение высвобождения глутамата во внеклеточное пространство, усиление входа кальция в нейроны и гимерпродукция свободных радикалов), накопление про воспалительных цитокинов. дефицит различных факторов роста (Dumuis A. et al 1998, Qureshi A.l. el al 2003, Mayer S.A. el al 2005). Общими являются и отсроченные проявления данных заболеваний - развитие неврологического дефицита, когнитивных и двигательных нарушений. Исходя из универсальности механизмов этих неврологических заболеваний, нейропротсктивиые препараты могут иметь широкий спектр применения. Внедрение в клиническую практику новых нейропротекторов позволит снизить процент смертности и степень тяжести развивающихся осложнений патологий.
Наиболее распространенной формой острого нейродегенеративного состояния является инсульт (Moosmann В. et al 2002). Согласно статистическим данным, это заболевание занимает третье место в структуре общей смертности населения, уступая сердечно-сосудистым и онкологическим заболеваниям. Ежегодная смертность в мире от инсульта составляет 4.7 млн. человек (Верещагин Н.В. и соавт. 2001, Гусев Е.И.. Скворцова ВИ. 2001. Welch К. el al 2004, Reiler R.G. el al 2005). В настоящее время разработан и применяется ряд препаратов для лечения инсульта Однако, показав себя в качестве эффективных средств на стадии экспериментального воспроизведения ишемии in vivo и in vilro. значительная часть этих препаратов не выявила положительного эффекта при клинических испытаниях (Knapp A et al 1997, Calzada J. et al 2002, Wardlaw J.M. el al 2003, Sharma M. et al 2005). Это связано с тем, что большинство нейропротекторов действуют преимущественно на одно из звеньев указанного патобиохимического каскада. Существенным недостатком большинства нейропротекторов является и то. что они оказываются малоэффективны относительно снижения когнитивного дефицита, а порой и
вовсе его усугубляют; кроме того, многие препараты имеют ряд побочных эффектов (Виленский Б.С., 1995: Гусев Е.И.. Скворцова ВИ. 2001; Baskys A. et а! 2005).
Недостаточная эффективность существующих в настоящее время средств коррекции последствий инсультов побуждает исследователей к разработке новых препаратов. При поиске веществ с многокомпонентным типом действия привлекают внимание пептиды как многофакторные регуляторы (Апімарин И.П. 1988). Применение сложных по структуре пептидов в качестве препаратов встречает некоторые трудности из-за их низкой биологической устойчивости и плохой проницаемости для них гематоэнцсфалического барьера. Имеются определенные успехи в использовании олигопептидных препаратов, характеризующихся достаточно высокой специфической биологической доступностью для мозга. Была выявлена эффективность аналогов вазоинтестипального пептида (VIP) и тиротропин-высвобождающего гормона (Gozes I. et al 2003, Faden A. el al 2004) Продемонстрирован защитный эффект тетрапентида тафцина (Каменский А.А. и соавт. 1989). Аналог адрснокортикотропного гормона, гептапетид семакс. в интраназальной форме продемонстрировал эффективность при инсульте (Ашмарин И.П., Каменский А.А. и соавт. 1997: Мясоедов Н.Ф. и соавт 1999. Гривенников И.А. 2006). Особое место занимает класс дипептидов, для которого показана высокая биологическая устойчивость и наличие специфических систем транспорта через клеточные барьеры, в том числе АТФ-зависимой системы транспорта щеточной каймы энтероцитов кишечника (Fricker G el al 1996). В частности, продемонстрирован нейропротективный эффект днпептидного препарата карнозин в экспериментах с ишемией мозга (Федорова Т.Н. 2003).
Оригинальный подход, развиваемый в ГУ НИИ фармакологии, может быть охарактеризован как попытка дизайна пептида на основании имитации структуры непептидного нейротропного средства с заданным видом активности. Гудашевой Т.А. и соавт. (1985) была выдвинута гипотеза о пептидергическом механизме действия родоначальника класса ноотроной пираиетама. исходя из ЭТОГО предположения был создан ряд N-ацильных производных пролина (Seredenin SB. et al 1995, Gudasheva J. д. et al 1996) Из ттой серии на основании наиболее чёткого антиамнестичеекого эффекта и высокой биодоступности для мозга был выбран ноопепт (этиловый эфир М-фенилацетил-L-пролинглицина. ГВС-111) . имеющий структурное сходство как с пирацетамом, так и N-концевым фрагментом основного метаболита вазопрессипа, АВП до Ноопепт превосходил пирацетам по уровню эффективных доз (в 1000 раз) и но спектру мнемотропной активности (Ostrovskaya R.U. et al 1994; Островская Р. У, и соавт. 2002). Была выявлена
нсйропротективная активность субстанции ноопспта на различных молелях ишемии (Назаренко И. В.. Каменский А. А. и соавт. 1998, Ostrovskaya R.U. et а! 1У99; Романова ГА. 2003). В отличие от большинства известных нейропротекторов. действующих изолированно на один из компонентов метаболическою каскада, ноопепт проявляет многокомпонентный нейропротективный эффект Он повышает выживаемость нейронов, подвергшихся действию глутамата в нейротоксичекой концентрации (Андреева Н.А. и соавт. 2000), блокирует потенциал-зависимые кальциевые каналы (Solnlseva Е el al 1997) и кальций-зависимые калиевые каналы (Bukanova Ju el al 2002). В опытах in vivo и in vitro был выявлен широкий спектр аитиоксидантной активности ноопепта (Лысенко А. В. и соавт 1997. Менджерицкий А. М. и соавт. 2003. Peaisman A. et al 2003). Ноопепт проявляет также антикоагулянтную и фибриполитическую активность (Островская Р.У.. Лянина Л.А. и соавт. 2002) и выраженный противовоспалительный эффект (Коваленко Л.П.. Мирамедова М.Г. и соавт. 2002).
Выявленная в эксперименте эффективность ноопспта в сочетании с достаточно высокой биодоступностью для мозга при введении препарата внутрь, подтвержденной фармакокинетическими исследованиями (Бойко С.С. и соавт. 2004), определила целесообразность создания лекарственной формы препарата в виде таблеток для клинических испытаний ноопепта. При проведении клинических испытаний у больных с психоорганическими расстройствами сосудистого и травматичного генеза было установлено, что препарат, начиная с 10-14 дня курсовой терапии, демонстрирует способность ослаблять когнитивные расстройства (нарушения внимания, памяти), оказывать анксиолитическое действие (снимать тревогу, повышенную раздражительность), ослаблять выраженность нарушений ночного сна (Teleshova E.S. et al 2005). В настоящее время завершена 111 фаза клинических испытаний ноопепта в качестве ноотропного средства; препарат выпускается в таблетках по 10 мг (регистрационный номер ЛС-001577 от 12.05.2006). Однако при остро развивающихся патологиях для быстро достижения эффекта необходимо назначать препараты в форме для парентерального применения. В связи с этим в настоящее время в Опытно-технологическом отделе ГУ НИИ фармакологии (зав. - проф.. д.ф.н. Пятин Б.М.) осуществляется разработка инъекционной формы ноопепта (заявка на выдачу патента РФ 2005.. Гусев А.В. и соавт. 2006). предназначенной для лечения больных с инсультами. Представляется необходимым экспериментальное исследование свойств ноопепта в новой, инъекционной форме
Цель работы. Оценка ноотропного и нейронротективного эффекта препарата ноопепт в
инъекционной форме, а также изучение основных механизмов его нейропротективного
действия.
Задачи исследования.
Оценка влияния ноопепта на обучаемость и дефицит памяти, вызванный блокадой холино-рецепторов
Исследование іюоїпрапііиго эффекта ноопепта в условиях дефицита памяти. вызванного фокальным ишемическим повреждением (фотоиидуцированный тромбоз сосудов префронтальной коры) и интрацеребральной посттравматической гематомы (модель геморрагическою инсульта).
Оценка нейропротек/пивной активности ноопепта на моделях локального ишемического инсульта - фотонндуцированного тромбоза сосудов префронтальной коры и окклюзии задней ветви средней мозговой артерии
Анализ влияния ноопепта на спонтанное и стимулированное высвобождение глутамита срезами коры головного мозга крыс
Количественная оценка антиоксидантного действия ноопепта на модели Fe2+-индуцированной хемилюминесценции липонротеинов сыворотки крови здоровых доноров
Изучение фарчакокинепшки инъекционной лекарственной формы препарата в сопоставлении с субстанцией.
Научная новизна.
В данном исследовании впервые изучен спектр ноотропной и нейронротективнон активности инъекционной формы препарата ноопепт (0.5 мг/кг). Препарат проявил выраженный когнитотропный эффект на модели УРПИ в трехкамерной модификации. Наиболее ярко эффект ноопепта выявился при отставленном тестировании, что свидетельствует о его положительном влиянии на извлечение памятного следа. Нейропроте ктивная активность инъекционной формы ноопепта была впервые продемонстрирована на модели массивного ишемического инсульта - кортикального повреждения, вызванного окклюзией средней мозговой артерии. В условиях моделирования посттравматической интрацеребральной гематомы (геморрагического инс\льта) впервые выявлен четкий протективный эффект препарата Ноопепт был эффективен при условии введения через 4 часа после экспериментального повреждения, что свидетельствует о
достаточной широте «терапевтического окна».
Впервые исследован новый компонент нейропротективного действия ноопепта -воздействие на высвобождение глутамата. В работе продемонстрирована способность препарата угнетать спонтанное и К*-стимулированное высвобождение глутамата. что является одной из причин выявленной ранее способности ноопепта ослаблять нейротоксические эффекты глутамата. В плане приближения к клинической ситуации впервые выполнено изучение эффекта ноопепта на оксидантный статус сыворотки крови здоровых доноров. Выявлена способность препарата способствовать сохранению эндогенного антиоксидантного потенциала и показана его более высокая эффективность по этому показателю, чем у препаратов сравнения: ноотропа пирацетама. ловушки свободных радикалов PBN и маниита. Впервые проведены фармакокипетические исследования инъекционной формы ноопепта в сравнении с субстанцией препарата.
научно-практическое значение.
Результаты данного исследования расширяют представления о веществах пептидной природы с ноотропным и нейрон ротективным типом действия и способствуют целенаправленному поиску новых препаратов с протективной активностью. Применяемые в настоящем исследовании модели экспериментального повреждения воспроизводят развитие ишемического и геморрагического инсульта в клинических условиях и являются адекватными для оценки активности фармакологических средств. Согласно современным представлениям, массивное высвобождение глутамата во внеклеточное пространство и активация перекисного окисления липидов являются ключевыми звеньями в патогенезе нейротоксического повреждения мозга не только при инсульте, но и таких состояниях как гипоксия, гипогликемия, травма мозга, нейродегенеративные расстройства (болезни Альцгеймера, Паркинсона). Полученные данные о способности ноопепта снижать высвобождение глутамата и сохранять эндогенный антиоксидантный потенциал способствуют лучшему пониманию механизмов, лежащих в основе положительного нейропротективного действия фармакологических препаратов. Результаты данной работы позволяют считать целесообразным клиническую оценку инъекционной формы ноопепта у больных с ишемнческим и геморрагическим повреждением мозга.
Настоящее исследование выполнено в соответствии с плановой тематикой ГУ НИИ фармакологии им ВВ. Закусова РАМН, фантами РФФИ (№ 03-04-49049 и № 06-04-48325) hINTAS(Ks0J-2065).
Апробация работы.
Основные результаты диссертационной работы были представлены на научной конференции нейрохимического общества "Нсйрохимия: фундаментальные и прикладные аспекты- (Москва, март 2005). на 8-ой Региональной конференции Европейской коллегии по нейропсихофармакологии FCNP (Москва, апрель 2005). на Всероссийской конференции молодых исследователей "Физиология и медицина» (Санкт-Петербург, апрель 2005). на международном симпозиуме "Biosensors and glulamate measurement" (Лунд. Швеция, июль 2005). на 4-ой международной конференции -Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным препаратам" (Москва, март 2006). на международном симпозиуме «Hippocampus and memory- (Путино, июнь 2006).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 работ, из них 5 статей и 5 тезисов в материалах российских и международных конференций.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 163 страницах машинописного текста и включает следующие разделы: введение, обзор литературы. материалы и методы исследования, описание полученных результатов, заключение и список литературы Библиографический список включает 77 отечественных и 273 иностранных источников. В работе содержится 9 таблиц и 32 рисунка.
Классификация инсультов в клинике Формирование патологического очага
Наиболее распространенной формой острого нейродегенеративного состояния является инсульт (Moosmann В. et al 2002). Согласно статистическим данным, это заболевание занимает третье место в структуре общей смертности населения, уступая сердечно-сосудистым и онкологическим заболеваниям. Ежегодная смертность в мире от инсульта составляет 4.7 млн. человек (Верещагин Н.В. и соавт. 2001, Гусев Е.И.. Скворцова ВИ. 2001. Welch К. el al 2004, Reiler R.G. el al 2005). В настоящее время разработан и применяется ряд препаратов для лечения инсульта Однако, показав себя в качестве эффективных средств на стадии экспериментального воспроизведения ишемии in vivo и in vilro. значительная часть этих препаратов не выявила положительного эффекта при клинических испытаниях (Knapp A et al 1997, Calzada J. et al 2002, Wardlaw J.M. el al 2003, Sharma M. et al 2005). Это связано с тем, что большинство нейропротекторов действуют преимущественно на одно из звеньев указанного патобиохимического каскада. Существенным недостатком большинства нейропротекторов является и то. что они оказываются малоэффективны относительно снижения когнитивного дефицита, а порой и вовсе его усугубляют; кроме того, многие препараты имеют ряд побочных эффектов (Виленский Б.С., 1995: Гусев Е.И.. Скворцова ВИ. 2001; Baskys A. et а! 2005).
Недостаточная эффективность существующих в настоящее время средств коррекции последствий инсультов побуждает исследователей к разработке новых препаратов. При поиске веществ с многокомпонентным типом действия привлекают внимание пептиды как многофакторные регуляторы (Апімарин И.П. 1988). Применение сложных по структуре пептидов в качестве препаратов встречает некоторые трудности из-за их низкой биологической устойчивости и плохой проницаемости для них гематоэнцсфалического барьера. Имеются определенные успехи в использовании олигопептидных препаратов, характеризующихся достаточно высокой специфической биологической доступностью для мозга. Была выявлена эффективность аналогов вазоинтестипального пептида (VIP) и тиротропин-высвобождающего гормона (Gozes I. et al 2003, Faden A. el al 2004) Продемонстрирован защитный эффект тетрапентида тафцина (Каменский А.А. и соавт. 1989). Аналог адрснокортикотропного гормона, гептапетид семакс. в интраназальной форме продемонстрировал эффективность при инсульте (Ашмарин И.П., Каменский А.А. и соавт. 1997: Мясоедов Н.Ф. и соавт 1999. Гривенников И.А. 2006). Особое место занимает класс дипептидов, для которого показана высокая биологическая устойчивость и наличие специфических систем транспорта через клеточные барьеры, в том числе АТФ-зависимой системы транспорта щеточной каймы энтероцитов кишечника (Fricker G el al 1996). В частности, продемонстрирован нейропротективный эффект днпептидного препарата карнозин в экспериментах с ишемией мозга (Федорова Т.Н. 2003).
Оригинальный подход, развиваемый в ГУ НИИ фармакологии, может быть охарактеризован как попытка дизайна пептида на основании имитации структуры непептидного нейротропного средства с заданным видом активности. Гудашевой Т.А. и соавт. (1985) была выдвинута гипотеза о пептидергическом механизме действия родоначальника класса ноотроной пираиетама. исходя из ЭТОГО предположения был создан ряд N-ацильных производных пролина (Seredenin SB. et al 1995, Gudasheva J. д. et al 1996) Из ттой серии на основании наиболее чёткого антиамнестичеекого эффекта и высокой биодоступности для мозга был выбран ноопепт (этиловый эфир М-фенилацетил-L-пролинглицина. ГВС-111) . имеющий структурное сходство как с пирацетамом, так и N-концевым фрагментом основного метаболита вазопрессипа, АВП до Ноопепт превосходил пирацетам по уровню эффективных доз (в 1000 раз) и но спектру мнемотропной активности (Ostrovskaya R.U. et al 1994; Островская Р. У, и соавт. 2002). Была выявлена нсйропротективная активность субстанции ноопспта на различных молелях ишемии (Назаренко И. В.. Каменский А. А. и соавт. 1998, Ostrovskaya R.U. et а! 1У99; Романова ГА. 2003). В отличие от большинства известных нейропротекторов. действующих изолированно на один из компонентов метаболическою каскада, ноопепт проявляет многокомпонентный нейропротективный эффект Он повышает выживаемость нейронов, подвергшихся действию глутамата в нейротоксичекой концентрации (Андреева Н.А. и соавт. 2000), блокирует потенциал-зависимые кальциевые каналы (Solnlseva Е el al 1997) и кальций-зависимые калиевые каналы (Bukanova Ju el al 2002). В опытах in vivo и in vitro был выявлен широкий спектр аитиоксидантной активности ноопепта (Лысенко А. В. и соавт 1997. Менджерицкий А. М. и соавт. 2003. Peaisman A. et al 2003). Ноопепт проявляет также антикоагулянтную и фибриполитическую активность (Островская Р.У.. Лянина Л.А. и соавт. 2002) и выраженный противовоспалительный эффект (Коваленко Л.П.. Мирамедова М.Г. и соавт. 2002).
Выявленная в эксперименте эффективность ноопспта в сочетании с достаточно высокой биодоступностью для мозга при введении препарата внутрь, подтвержденной фармакокинетическими исследованиями (Бойко С.С. и соавт. 2004), определила целесообразность создания лекарственной формы препарата в виде таблеток для клинических испытаний ноопепта. При проведении клинических испытаний у больных с психоорганическими расстройствами сосудистого и травматичного генеза было установлено, что препарат, начиная с 10-14 дня курсовой терапии, демонстрирует способность ослаблять когнитивные расстройства (нарушения внимания, памяти), оказывать анксиолитическое действие (снимать тревогу, повышенную раздражительность), ослаблять выраженность нарушений ночного сна (Teleshova E.S. et al 2005). В настоящее время завершена 111 фаза клинических испытаний ноопепта в качестве ноотропного средства; препарат выпускается в таблетках по 10 мг (регистрационный номер ЛС-001577 от 12.05.2006). Однако при остро развивающихся патологиях для быстро достижения эффекта необходимо назначать препараты в форме для парентерального применения. В связи с этим в настоящее время в Опытно-технологическом отделе ГУ НИИ фармакологии (зав. - проф.. д.ф.н. Пятин Б.М.) осуществляется разработка инъекционной формы ноопепта (заявка на выдачу патента РФ 2005.. Гусев А.В. и соавт. 2006). предназначенной для лечения больных с инсультами. Представляется необходимым экспериментальное исследование свойств ноопепта в новой, инъекционной форме Цель работы. Оценка ноотропного и нейронротективного эффекта препарата ноопепт в инъекционной форме, а также изучение основных механизмов его нейропротективного действия. Задачи исследования. 1. Оценка влияния ноопепта на обучаемость и дефицит памяти, вызванный блокадой холино-рецепторов 2. Исследование іюоїпрапііиго эффекта ноопепта в условиях дефицита памяти. вызванного фокальным ишемическим повреждением (фотоиидуцированный тромбоз сосудов префронтальной коры) и интрацеребральной посттравматической гематомы (модель геморрагическою инсульта). 3. Оценка нейропротек/пивной активности ноопепта на моделях локального ишемического инсульта - фотонндуцированного тромбоза сосудов префронтальной коры и окклюзии задней ветви средней мозговой артерии 4. Анализ влияния ноопепта на спонтанное и стимулированное высвобождение глутамита срезами коры головного мозга крыс 5. Количественная оценка антиоксидантного действия ноопепта на модели Fe2+-индуцированной хемилюминесценции липонротеинов сыворотки крови здоровых доноров 6. Изучение фарчакокинепшки инъекционной лекарственной формы препарата в сопоставлении с субстанцией.
Применение пептидов в качестве нейропротекторов. Ноопепт-дипептидиый препарате ноотропной и нейропротектнвной активностью
Разработка эффскгивных нейронротекторов является одной из самых актуальных задач современной фармакологии. Внедрение в клиническую практику новых препаратов данного класса позволит снизить процент смертности и риск развития осложнений болезней ЦНС - неврологического дефицита, когнитивных нарушений Нейропротекторы защищают клетки головного мозга от распространения повреждения, развивающегося при многих неврологических заболеваниях: нейродегенеративных расстройствах (болезнь Альцгеймера, Паркинсона), травме мозга, инсультах. Хотя для каждого из этих заболеваний существуют специфические механизмы (уменьшение содержания дофамина в черной субстанции и базальных ядрах при болезни Паркинсона. повышение уровня мозгового В-амилойда при болезни Альцгеймера), существуют и общие патогенетические звенья указанных состояний: это метаболическая триада (увеличение высвобождения глутамата во внеклеточное пространство, усиление входа кальция в нейроны и ги пери роду кция свободных радикалов), накопление провоспалительных цитокинов, дефицит ростковых факторов (Dumuis A. el al 1998, Qureshi A.I. et al 2003, Mayer S.A. et al 2005). Исходя из универсальности механизмов этих неврологических заболеваний, нейропротективные препараты могут иметь широкий спектр применения.
Наиболее распространенной формой острого нейродегенеративного состояния является инсульт - заболевание, которое является одной из ведущих причин инвалидности и смертности населения (Roberlson G.S. et al 2000, Moosmann В. et al 2002). Согласно эпидемиологическим данным, это заболевание занимает третье место (9.5%) в структуре общей смертности населения, уступая болезням сердца и онкологическим заболеваниям. В мире ежегодная смертность от инсульта составляет 4.7 млн. человек (Murray CJ. et al 1997, Верещагин Н.В. и соавт. 2001, Bonita R. 2001; Гусев Е.И., Скворцова В.И. 2001; Welch К. el al 2004, Sharma М. et al 2005, Reiter R. el al 2005).
В России регистрируется 340.3 случая заболеваемости инсультом на 100.000 населения, а в США - 58.7 случаев на 100.000 населения в год. В Сибири самая высокая смертность наблюдается в Новосибирске - 123 случая на 100.000 населения (Feigin V. et al 1998). Достаточно высокий уровень смертности в странах Восточной Европы -Венгрии, Болгарии. Румынии, Чехии - 200-230 случаев на 100.000 населения (Bonita R. 1995). В США каждые 53 секунды у кого-то случается инсульт, а для россиян данный показатель составляет 1,5 мин (Гусев Е.И., Скворцова В.И. 2001; Sharma М. 2005). Интересным представляется тот факт, что в США частота заболевания инсультом у белых людей в 1 25 раза больше у мужчин, чем у женщин, среди афроамериканцев процент заболеваемости инсультом выше, чем у белого населения (Khaw К. 199ft). В следующие 2 десятилетия ожидается, что течение инсульта будет происходить в более тяжелой форме: это связано с тем. что в настоящее время во всем мире растет заболеваемость инсультом в группе пожилых людей, т.е. в популяции увеличивается средний возраст заболевших (Matchar D. et al 2000). Данное церебро-васкулярное заболевание является социально-экономическим - в 2002 году в США стоимость прямых и непрямых расходов в общей сложности составила 50 млрд ам. долларов (Hunter A.J. 1998, Sharma Metal 2002).
Известны две основные формы церебрального инсульта: ишемический и геморрагический Согласно статистическим данным, геморрагический инсульт связан с более высоким показателем смертности, нежели ишемический: 50% больных, перенесших геморрагический инсульт, умирают в течение месяца (Vermeer S. et al 2002). В целом, полугодовая смертность после инсульта составляет 25-60%; около половины пациентов, перенесших инсульт, умирают в течение последующих 8 лет, чаще всего от атеросклеротических сосудистых заболеваний (Sharma М. et al 2005). К примеру, у лиц с ишемическим инсультом в 2-3 раза возрастает риск перенести инфаркт миокарда и в 9 раз увеличивается вероятность повторного инсульта в сравнении с основной популяцией (Wilterdink J. et al 1992. Kannel W. 1994).
Инсульт является основной причиной инвалидизации населения: исследованиями последних лет установлена тесная положительная корреляция между возрастом и степенью инвалидности (Wolf P. el al 1992, Qureshi A. et а) 2001, Чехонин В.П. и соавт. 2004) Известно, что инвалидность является следствием тяжести неврологического дефицита (Ween J. et al 1996, Paotucci S. et al 1998, Jorgensen H. et at 1999). Восстановление нарушенного неврологического статуса и функциональной активности зависит от большого числа факторов, в том числе - 1)изначальная тяжесть инсульта, 2) температуры тела и уровня глюкозы в крови как в острую фазу инсульта, так и при прегрессировании заболевания и 3) лечения и реабилитации. Согласно статистическим данным 19% от всех инсультов носят очень тяжелый характер, 14% тяжелый, 26% -средней тяжести и 41% случаи с относительно легким течением заболевания. Тяжесть неврологических нарушений у выживших пациентов после полной реабилитации распределилась следующим образом: 11% пациентов с очень тяжелыми и тяжелыми нарушениями. 11% - средней тяжести. 47% - с легкими нарушениями, и 31% пациентов достигают уровня полного восстановления неврологических функций. У пациентов с легкими и средними нарушениями довольно хороший прогноз, они восстанавливаются через 2-3 месяца. В то же время у больных с тяжелым и очень тяжелым течением заболевания прогноз варьирует, а восстановление происходит через 4-5 месяцев. До трети пациентов из этой ірунпьі восстанавливаются до того же уровня, как и больные со средними нарушениями (Jorgensen Н. et al 1999). У пациентов с неполным восстановлением сохраняется очаговая неврологическая симптоматика, наблюдаются двигательные и когнитивные нарушения, снижается способность к анализу ситуаций (Warlow СР. et зі 1996, Sacco R. et al 1997, Hua Ya et al 2002; Гусев Е.И. и соавт. 2003; Чехонин В.П. и соавт. 2004; Welch К- el al 2004, Mayer S. el al 2005). Согласно статистическим данным, недостаточность мнестических функций сопровождает до 35% всех случаев инсульта. Среди выживших после инсульта больных в течение более 6 месяцев 12-18% имеют речевые, афатическис расстройства; в 32% случаев отмечается депрессия и социальные проблемы, 24-53% полностью или частично зависят от посторонней помощи - для одевания, передвижения по квартире и на улице Всё" это свидетельствует о низком уровне качества жизни выживших пациентов (Rockville М. 1995, Kauhanen М. et al 1999, Dennis М. el al 2000, Bath P. et al 2000).
Несмотря на выявленную статистически большую смертность после геморрагического инсульта, большинство исследователей полагают, что у выживших больных лучший прогноз в плане восстановления нарушенных неврологических функций (Chae S. et al 1996). Paolucci S. и соавт (2003) провели сравнительные клинические исследования для выявления различий в результатах реабилитации больных с геморрагическим и ишемическим инсультом. Оценивались следующие показатели; а) тяжесть течения инсульта по Канадской неврологической шкале (Coto R. el а! 1989); б) индекс подвижности по шкале Ривемел, которая позволяет оценивать 15 видов движений, используемых в повседневной деятельности, и имеет значения от 0 (полная невозможность) до 15-ти (Collen F. et al 1991. Antonucci G- et al 2002); в) эффективность лечения по индексу Бартел - шкале со значениями от 0 до 100 баллов, отражающей среднесуточное улучшение оценки (в баллах) на фоне лечения (Shah S. et al 1990). Результаты данного исследования свидетельствуют о достоверно более высоких оценках но перечисленным показателям у больных с геморрагическим инсультом в сравнении с пациентами, перенесшими ишемический инсульт.
Методика дисталыюй окклюзии задней ветви средней мозговой артерии (ОЗВСМА)
Согласно Sharma М et al (2005) инсульт можно определить как «быстроразвивающееся заболевание головного мозга с фокальным или глобальным очагом, характеризующееся симптомами нарушения основных мозговых функций. длящимися в течение 24 часов и либо более длительными симптомами, либо заканчивающиеся смертью, причиной которой является поражение сосудов». Основные клинические симптомы инсульта включают в себя: внезапное головокружение, потерю координации, слабость одной половины тела, кратковременную потерю зрения на один или оба глаза, сильную головную боль и проблемы с речью и пониманием.
По данным международных исследований, в 60-85% случаев развитие инсульта происходит по ишемическому типу - снижается кровоснабжение определенного участка мозга, чаще всего вследствие окклюзии определенной артерии (Верещагин N В 1997, Гусев Е.И 2001, Welch К. 2004, Reiter 2005). В остальных случаях (15-30%) развивается геморрагический инсульт, который является результатом разрыва сосуда и повреждения мозга из-за давления и токсического эффекта образовавшейся крови внутри закрытой поверхности черепа. Геморрагический инсульт, в свою очередь, подразделяется на 2 типа Первый тин - это кривоішияпие в мозг (intracerebral hemorrhage, ICH) Второй тин геморрагии - что кровотечение во внемозговое пространство; к нему относятся: субарахноидальные (sub-arachnoid hemorrhage, SAH) и субдуршъпыи (sub-dural hemorrhage). Дополнительно выделяют виутриже./уоочкивые кровоизлияния (intraventricular hemorrhage) (van G. I. et al 2001, Mayer S. et al 2005).
В клинической пракгике различают 2 типа церебральной ишемии: глобальную и фокальную (Ginsburg М. 1997, Upton Р. 1999, Reiter R. el al 2005). Глобальная ишемия наступает, когда происходит прекращение или резкое снижение поступления кислорода, к примеру, во время остановки сердца, при асфиксии или отравлении СО (Rosemary L. 1997, Гусев Ь.И.. Скворцова ВИ. 2001). В свою очередь фокальная (локальная) ишемия развивается, когда нарушен мозговой кровоток из-за разрыва сосуда (геморрагический инсульт), либо вследствие образования тромба (зачастую в сосудах, подвергнутых атеросклерозу). Геморрагический инсульт сопровождается кровотечением, которое наносит токсическое повреждение - гемоглобин является нейротоксином. К примеру, введение гемоглобина интракортикально вызывает хроническую снайк-активность и глиознс. Гемоглобин ингибирует Na/K АТФ-азу, активирует перикисное окисление липидов. и вызывет эксайтотоксическое повреждение в культуре кортикальных нейронов (Regan R 1996). Нередко разрыв сосуда в мозге ведет к сужению сосудов и вторичной ишемии (Lyden P. et al 1997, Qureshi A. et al 2003).
В норме кровоток в мозге человека составляет 50-60 мл/100 г/мин, что позволяет поддерживать кровоснабжение нейрональной ткани. Если кровоток снижается до !8 мл/100 г/мин и ниже, происходит ишемическое повреждение головного мозга (Mazziolta J. et al 1997, Lipton P. 1999, Мирзоян P.C. и соавт 2000). Наиболее чувствительными к недостатку кислорода при глобальной ишемии являются нейроны СА1 области гиипокампа, несколько в меньшей степени повреждению подвергаются нервные клетки 3, 5 и 6 слоев коры головного мозга, нейроны стриатума, гипоталамуса и мозжечка (Puhineili W. 1997, Lipton P. 1999).
В очаге инсульта начинается цепь патофизиологических процессов, при котором сначала наступают обратимые, а затем и необратимые метаболические реакции (Dirnagl U. et al 1999). Эти изменения включают в себя снижение рН, истощение уровня АТФ. увеличение уровня Na и деполяризацию мембраны как следствие потери АТФ-субстрата Na+-K помпой. В зону поражения начинается миграция полиморфноядерных лейкоцитов, а также происходит пролиферация астроцитов и клеток микроглии (Ncdergaard М. 1988, Lipton Р. 1999, Гусев НИ.и соавт. 2003). Все эти процессы ведут ко вторичным повреждениям в мозге. механизмы которых будут подробно описаны в пункте 1.1.4.
Область повреждения при локальной ишемии подразделяется на 2 зоны -центральную и демаркационную (Fisher М. el а! 1995, Reiler R. et al 2005). Lipton P. (1999) выделяет ещё 3-ю. пери инфарктную (extrapenumbral) зону, в которой наблюдается гибель некоторых нейронов. В центральной зоне ишемии («ядро» или umbra) очень быстро. через 5-6 минут после повреждения, кровоток снижается до 10 мл/100 г/мин, концентрация внеклеточного К достигает 70 мМ; в случае рсперфузии уровень К вновь снижается до базального (5 мМ) (Nebergaard М- 1988. Ginsberg М. 2003). Ядро ишемии образуется непосредственно в месте первичных повреждений мозга - травмы или инсульта; ядра клеток данной зоны гиперхромцы (Luer М. el а! 1996).
Вокруг ядерной зоны формируется так называемая «ишемическая полутень» или пенумбра (penumbra), в которой частично сохранен энергетический метаболизм (Astrup J el al 19&1). Согласно данным позитрошю-шисснонной томографии (ПЭТ), объем пенумбры составляет 30-50% конечного инфаркта, т.е. в некоторых случаях практически равен объему «ядра» (Marchal G. et al 1996, Belayaev L. et al 1997, Markus R. et al 2003). Кровоток в данной области составляет 15-20 мл/100 г/мин (Back Т. 1998), и этого недостаточно для поддержания нормальных нейрональных функций. Электрическая активность в пенумбре замедлена, и уровень ионов внеклеточного калия при таком уровне кровотока начинает нарастать (Astrup J. el al 1981. Hakim A 1987). Область пенумбры является пороговой - несмотря на то. что в ее клетках постепенно исчезает электрическая активность, мембранная функция сохраняется, и клетки остаются жизнеспособными Именно с областью пенумбры большинство исследователей связывают развитие вторичных повреждений мозга - последовательность отсроченных метаболических и биохимических изменений в нейронах. Конечный объем зоны ишемии зависит от скорости нарастания патобиохимических процессов. Для сохранения жизнеспособности нейронов с потенциально обратимым повреждением в области пенумбры. в первые часы после инсульта (период «терапевтического окна») применяют нейронротектииные средства (Astrup J. et al 1981, Fisher M. 1997, Touzani O. el al 2001; Гусев Е.И., 2001; Fisher M. et al 2005). Терапия инсульта, таким образом, направлена на прерывание метаболических вторичных повреждений (Fisher М. el al 1994).
Исследование эффекта ноопепта на модели дистальной окклюзии задней ветви средней мозговой артерии (ОЗВСМА)
Мозговой кровоток определяют с помощью меченых микросфер или радиоактивных инертных газов при их ингаляции (ксенон-133); локальный кровоток в отдельных структурах мозга оценивают полярографическим методом, а в коре головного мозга - с помощью лазерных доштлеровских флоуметров {Мирзоян PC и соавт 2000),
Для определения размеров очага ишемического и геморрагического инсульта и его локализации используют различные гистоморфологические подходы. К наиболее высокоинформативным методикам относят иммуногистохимический анализ с использованием антител к различным антигенам мозга - выявление клеток микроглии. нейронов, астроштов (Balduini W. et al 2000, Lema P. et al 2004, Karwacki Z. et al 2006, Yang S. et al 2006). Для морфоконтроля образовавшейся зоны инсульта используют серийные срезы, которые окрашивают различными красителями - фусцнном, гемотокенлииом и эозином, метиленовым синим, тионином по методу Ниссля. луксолом, крезил-фиолетовым Одной из наиболее информативных является методика с использованием 2.3,5 Трнфенилтетразолий-хлорида; этот метод основан на окрашивании в красный цвет клеток живой ткани (вследствие присутствия электронного транспорта в митохондриях), в то время как клетки в зоне повреждения остаются неокрашенными (Lipton Р 1999). После окраски объем инсульта в срезах определяется различными методами. Вычисление зоны инсульта при окклюзии средней мозговой артерии осуществляют планиметрически с помощью специальных компьютерных программ (Aucl, Photoshop); при фототромбозе сосудов коры применяют прибор для полуавтоматичекого анализа изображения ASM-Leutz.
Характеристика функционального состояния ЦНС при инсульте необходима для -эффективной терапии цереброваскулярных заболеваний (Balduini W. el al 2000). Основным требованием, предъявляемым к моделям инсульта с соответствующей неврологической симптоматикой, является воспроизводимость клинического течения церебро-васкулярного заболевания Нарушения высшей нервной деятельности и отклонения в двигательной сфере сопровождают как ишемический (Borlongan С. et al 1995, Aranowski J. el al 1996, Федорова Т.Н. 2004), так и геморрагический инсульты (Lyden P.D. et al 1997, Xua Ya et al 2002). Так, при моделировании ишемического инсульта методом фотохимического тромбоза префронтальной коры развивается избирательный когнитивный дефицит (Романова Г.А. 2003). Известно, что префронтальная кора участвует в процессе консолидации, играет ключевую роль в процессах, связанных с пространственной и долговременной памятью. Следует отметить. что в случае ишемичесхого инсульта неврологический дефицит сильнее у животных с глобальной, чем с фокальной ишемией Другими словами, имеется положительная корреляция между объемом очага поражения и степенью неврологических нарушений (Boriongan C.V. ct al 1995, Aronowski J. el al 1996) Наиболее информативными в плане проявления неврологической симптоматики считаются 1-ые. 3-й, 7-ые и 14-ые сутки. Интересно отметить, что ЭТИ же самые сутки после повреждения исследователи считают наиболее показательными для оценки количества выживших клеток глии и астроцитов (Karwacki Z. et al 2006). Помимо перечисленных дней после повреждения Hua Ya et al (2002) дополнительно выделяет еще 21-ые и 28-ые сутки для проведения поведенческих тестов. Обычно исследуют 3 основных показателя: 1) Неврологический статус оценивают с иомошью шкал Menzies, Hirakawa, McGrow (Чехонин В.П. и соавт. 2004). Шкала Menzies S- el al (1992) включает в себя оценку неврологических расстройств относительно контролатеральноЙ стороны тела. В модификации Stroke-index McGrow тяжесть состояния определяется по сумме соответствующих баллов: легкая симптоматика (вялость, птозы и полуптозы) оценивается до 2,5 баллов по шкале, а при наличии тяжелых проявлений (параличи и парезы конечностей) животным присваивается от 3 до 10 баллов (Ганушкина И.В. 1977) Применяют также сенсомоторные поведенческие тесты (Hua Yaetal 2002) 2) Состояние обучаемое! и и памяти оценивают по показателям условного рефлекса пассивного избегания (УРПИ). либо в водном лабиринте Морриса. УРПИ проводят в установке с ілектрофицированным иолом (Smith S.E. et al 1997, Иноземцев A.H. и соавт. 1998. Ostrovskaya R. el al 1999. Гарибова Т.И. и соавт. 2003). Данная методика основана на формировании рефлекса условного торможения при перемещении животного из светлого отсека в темный (метод «step-lhrough»): латентный период захода в темную (опасную) камеру увеличивается при нарушениях долговременной памяти Вторую методику, тест Морриса (круглый бассейн, заполненный водой и поделенный на сектора), применяют в основном при локальных повреждениях коры но ишемическому типу (Smith S.E. cl al 1997, Romanova G.A. et al 2006). Согласно данной методике, крыса должна отыскать скрытую под водой платформу (Banncrman D.M., Morris R.G. et al 1997; Block F. 1999). Увеличение времени достижения платформы свидетельствует о нарушениях долговременной памяти. Также оценивают состояние пространственной памяти - крысу помещают в бассейн с убранной платформой и фиксируют время достижения места, где раньше находилась платформа. Тест Морриса используется и для исследования нарушенной пространственной памяти. 3) Нарушения двигательной активности, координации движений и мышечного тонуса исследуют в тестах открытое поле, «вращающийся стержень» и «горизонтальная перекладина», соответственно (Borlongan C.V. et al 1995. Гарибова Т.Л и соавт. 2003). Помимо этого, используют Т-образный лабиринт для выявления моторной ассиметрии мозга (Романова ГА. и соавт 2006). Некоторые исследователи применяют методику вращающегося колеса и наїрузочньїй тест для оценки соскальзывания при движении но лестнице (Aronowski J. et al 1996). Кроме того, для выявления нарушений функций нейротрансмиттеров головного мозга используют различные методики с введением неселективных антагонистов различных подтипов глутаматных и дофаминовых рецепторов; в частности, применение находят кетамининдуциронанная вращательная ассиметрия (Вгеіег A. et al 1997) и галоперидолвызванная каталепсия (Borlongan C.V. et al 1995) у крыс с ишемией Таким образом, используя вышеупомянутые подходы, удается смоделировать инсульт в определенной области мозга экспериментального животного, адекватно воспроизводящий развитие данного цереброваскулярного заболевания у человека Изучение препаратов с определенными фармакологическими свойствами позволяет оценить их нейропротективный эффект в отношении снижения зоны поражения и выраженности развившихся неврологических и двигательных нарушений.
Похожие диссертации на Нейрофармакологическая характеристика и механизм нейропротективного действия инъекционной формы препарата нооцепт
