Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы
1.1. Некоторые аспекты функционально-метаболических нарушений в головном мозге при ишемии
1.2. Метаболические изменения в головном мозге при ишемии в зависимости от индивидуальной устойчивости к гипоксии
1.3. Возможности фармакологической коррекции постишемических нарушений головного мозга пептидными биорегуляторами
Глава 2. Материалы и методы исследования.
2.1. Материалы и структура экспериментов 45
2.1.1. Разделение животных по их устойчивости к острой гипоксии
2.1.2. Моделирование ишемии головного мозга 46
2.1.3. Оценка неврологического статуса животных 47
2.2. Методы изучения поведенческих реакций 48
2.2.1. Исследование поведения животных в «открытом поле» 49
2.2.2. Исследования поведения животных в приподнятом крестообразном лабиринте
2.2.3. Метод определения условной реакции пассивного избегания
2.2.4. Метод определения уровня депрессии у животных
2.3. Методы биохимических исследований.
2.3.1. Методы изучения продуктов перекисного окисления липидов
2.3.2. Методы определения активности антиоксидантных систем
2.4. Характеристика использованных фармакологических средств
2.5. Статистическая обработка результатов исследования
Глава 3. Результаты собственных исследований
3.1. Влияние пептидных препаратов на неврологический статус животных с различной индивидуальной устойчивостью к гипоксии после ишемии головного мозга
3.2. Влияние пептидных препаратов на поведенческие реакции различных по устойчивости к гипоксии животных после ишемии головного мозга
3.3. Влияние пептидных препаратов на метаболические изменения в головном мозге различных по устойчивости к гипоксии животных после ишемии головного мозга
Глава 4. Обсуждение результатов исследования 86
Выводы 107
Практические рекомендации 108
Список литературы 109
- Метаболические изменения в головном мозге при ишемии в зависимости от индивидуальной устойчивости к гипоксии
- Разделение животных по их устойчивости к острой гипоксии
- Исследования поведения животных в приподнятом крестообразном лабиринте
- Методы определения активности антиоксидантных систем
- Влияние пептидных препаратов на поведенческие реакции различных по устойчивости к гипоксии животных после ишемии головного мозга
Введение к работе
Хроническая ишемия мозга или дисциркуляторная энцефалопатия - это синдром прогрессирующего многоочагового или. диффузного поражения головного мозга, проявляющийся клинически неврологическими, нейропсихологическими и/или психическими нарушениями,: обусловленный хронической сосудистой мозговой недостаточностью и/или повторными эпизодами острых нарушений мозгового кровообращения: Патогенез поражения церебральных структур при хронической ишемии головного мозга заключается в последовательном нарастании комплекса патобиохимических расстройств, обусловленных снижением уровня кислорода артериальной крови и воздействием интермедиатов недоокисленного кислорода (ГГусев Е.И., Скворцова В.И:,,2001). При этом;окислительный стресс играет роль активного механизма деструкции^мембран и гибели нейронов (Suzuki Н., 1998; Hall E.D:, Andrus Р.К., Althaus J.S., von Voiglander P:E., 1993); что является основанием для дальнейшего поиска новых фармакологических средств, способных корректировать уровень свободнорадикальных метаболитов в; мозге при ишемических состояниях.
Несмотря на наличие универсальных закономерностей, процесс церебральной ишемии во многом индивидуален и особенности его течения определяются тяжестью предшествовавшей хронической ишемии головного мозга;, фоновым состоянием метаболизма мозга, статусом и реактивностью нейроиммуноэндокринной системы; Известно, что степень восстановления метаболизма и функций высшей нервной деятельности после экстремальных воздействий зависит, в частности, от индивидуальной устойчивости организма к острой гипоксии (Зарубина И.В., Шабанов П.Д., 2004). Различия в чувствительности к гипоксии выявляются в широком круге функционально-метаболических параметров и сохраняются на системном, тканевом, клеточном и субклеточном уровнях. Исследование функционально-метаболических особенностей индивидуальной устойчивости организма к
ишемии головного мозга следует рассматривать как важный и необходимый этап использования в практической медицине. В свою очередь это требует всестороннего изучения эффективности фармакологических препаратов, применяемых с лечебной целью при ишемии мозга, в зависимости от индивидуальной устойчивости организма к действию гипоксического фактора и ее повышения в постишемическом периоде.
Проблеме фармакотерапии последствий ишемии головного мозга на различных этапах постишемического периода посвящено множество экспериментальных и клинических исследований (Бойко А.Н. и соавт., 2004; Виленский Б.С. и соавт., 1997; Гусев Е.И., Скворцова В.И., 2001; Смирнов А.В. и соавт., 2000; Миронова О.П., 1999). Однако работы, рассматривающие вопросы индивидуальной чувствительности больных к назначаемой им терапии, практически отсутствуют. В то же время существенной проблемой лечения расстройств мозга после ишемии являются различия между людьми в лекарственном ответе и нежелательные эффекты препаратов. В связи с этим лекарственная терапия должна проводиться с учетом индивидуальной чувствительности пациентов к фармакологическим препаратам, а также индивидуальной резистентности к воздействиям внешней среды, в том числе к кислородной недостаточности (Roses A.D., 2000).
Учитывая сложность патогенетических механизмов хронической ишемии головного мозга, выбор терапевтического воздействия не представляется возможным свести до какого-либо единственного лекарственного препарата, поскольку в процессе лечения необходимо достичь нормализации системного и мозгового кровообращения, скорректировать нарушения различных видов обмена мозговой ткани, состояние гемореологии и гемокоагуляции (Табеева Г.Р., 2006). Лечение хронической ишемии мозга включает воздействия, направленные на основное заболевание, на фоне которого развивается дисциркуляторная энцефалопатия (атеросклероз, артериальная гипертония, васкулиты и др.), коррекцию основных синдромов,
воздействие на церебральную гемодинамику, метаболическую терапию (Виленский Б. С. и соавт., 2002).
Вместе с тем многие существенные проблемы, касающиеся разработки эффективных способов предупреждения развития и замедления темпов прогрессирования хронической ишемии мозга, остаются далекими от полного разрешения (Верещагин Н.В., 1997; Неретин В.Я. и др., 1997; Martyn С, 1996; Schellinger P.D., 1997; Masuhr F., 1998). В настоящее время, механизмы вторичного повреждения мозга рассматриваются как потенциально обратимые (Зозуля Ю.А., Барабой В.А., Сутковой Д.А., 2000). Здесь на первый план выходит вторичная нейропротекция, направленная на уменьшение степени выраженности отдаленных последствий ишемии (Гусев Е.И., Скворцова В.И., 2001). Перспективное направление терапии последствий ишемии мозга также связано с применением нейроспецифических пептидов. Фармакологические средства пептидной структуры обладают высокой биодоступностью для тканей мозга и проявляют широкий спектр когнитивных и неиропротективных эффектов (Рихирева Г.Т., Соколова И.С, Рылова А.В., и соавт., 1995; Островская Р.У., Гудашева Т.А., Воронина Т.А., Середенин СБ., 2002). Широкий спектр действия новых пептидных препаратов кортексина, кортагена и ноопепта, а именно их ноотропное и нейропротективное, позволяет ожидать высокий лечебный эффект при хронической ишемии головного мозга у особей с различной устойчивостью к гипоксии. В то же время в литературе отсутствуют работы, посвященные исследованию эффективности этих препаратов у типизированных по признаку генетически детерминированной устойчивости к гипоксии особей. Важное значение в патогенезе хронической ишемии головного мозга индивидуальной резистентности к недостатку кислорода послужило основанием для исследования в настоящей работе эффективности нейропротекции с помощью пептидных препаратов при хронической ишемии головного мозга у животных с различной индивидуальной устойчивостью к гипоксии.
Целью настоящей работы явилось изучение фармакологической коррекции кортексином, кортагеном и ноопептом функционально-метаболических нарушений головного мозга у высоко- и низкоустойчивых к гипоксии животных при хронической ишемии головного мозга.
Задачи исследования:
Оценить динамику неврологического дефицита при использовании кортексина, кортагена и ноопепта у различных по устойчивости к гипоксии животных после окклюзии общих сонных артерий.
Изучить влияние кортексина, кортагена и ноопепта на поведенческие реакции различных по устойчивости к гипоксии крыс после окклюзии общих сонных артерий по данным фармакологических тестов.
Изучить эффективность кортексина, кортагена и ноопепта для коррекции процессов перекисного окисления липидов и активности антиоксидантных систем у различных по устойчивости к гипоксии крыс после окклюзии общих сонных артерий.
Научная новизна работы. Установлено, что при хронической ишемии функционально - метаболические изменения головного мозга и степень их восстановления зависят от индивидуальной устойчивости к острой гипоксии, что требует избирательной фармакологической коррекции.
Изучены особенности нейропротекторного действия пептидных препаратов (кортексина, кортагена и ноопепта) у высоко-и низкоустойчивых к гипоксии особей при хронической ишемии головного мозга.
Доказаны преимущества применения в постишемическом периоде кортагена при коррекции метаболических нарушений в головном мозге и ноопепта при коррекции поведенческих реакций различных по устойчивости к гипоксии животных.
Основные положения, выносимые на защиту:
Применение в эффективных минимальных дозах кортексина, кортагена и ноопепта в течение 7-й суток после окклюзии общих сонных артерий снижает
выраженность неврологических нарушений у высоко-и низкоустойчивых к гипоксии крыс и увеличивает их выживаемость в постишемическом периоде.
Введение кортексина, кортагена и ноопепта на протяжении 7-й суток постишемического периода предупреждает дезинтеграцию отдельных компонентов целостной поведенческой реакции и способствует восстановлению структуры индивидуального поведения у высоко-и низкоустойчивых к гипоксии особей.
Кортексин, кортаген и ноопепт препятствуют накоплению продуктов перекисного окисления липидов и угнетению антиоксидантных систем в головном мозге различных по устойчивости к гипоксии крыс после окклюзии общих сонных артерий.
Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты проведенного исследования обосновывают новые возможности вторичной нейропротекции хронической ишемии головного мозга пептидными препаратами.
Полученные данные позволяют рассматривать кортексин, кортаген и ноопепт в качестве средств репаративнои терапии, направленной на предупреждение развития и замедления темпов прогрессирования хронической ишемии мозга, уменьшение степени ' выраженности неврологического, когнитивного, мнестического дефицита и оптимизацию метаболизма головного мозга.
Реализация результатов работы. Диссертационная работа выполнена в рамках темы НИР Военно-медицинской академии им. СМ. Кирова № 4.08.152.П 12 «Изыскание новых эффективных лекарственных средств пептидной структуры для коррекции функционально-метаболических нарушений головного мозга в постишемическом периоде». Результаты работы реализованы в научно-исследовательской деятельности и учебном процессе кафедры фармакологии Военно-медицинской академии и Физиологическом отделе им. И.П. Павлова ГУНИИ экспериментальной медицины РАМН.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены на Международном семинаре «Новые технологии в медицине и экспериментальной биологии» (Паттайя, Таиланд, 2007); I междисциплинарном научном конгрессе «Человек и алкоголь», (Спб, 2007); VIII Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы клиники, диагностики и лечения больных в многопрофильном лечебном учреждении», (СПб, 2007); 10-th Jubilee Multidisciplinary International Conference of Biological Psychiatry «Stress and Behavior», (St-Petersburg, 2007); Юбилейной Российской научной конференции с международным участием, посвященной 175-летию со дня рождения С.П.Боткина, (СПб, 2007); III съезде фармакологов России «Фармакология - практическому здравоохранению» (СПб, 2007); V Всероссийской конференции с международным участием, посвященной 100-летию со дня рождения В.Н.Черниговского «Механизмы функционирования висцеральных систем» (СПб, 2007).
Апробация диссертации прошла на межкафедральном заседании кафедры фармакологии Военно-медицинской академии им. С.М.Кирова, отдела фармакологии и Физиологического отдела им. И.П. Павлова ГУНИИ экспериментальной медицины РАМН.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 научных работ, в том числе 2 статьи в журналах, рецензируемых ВАК.
Структура и объем работы. Материалы диссертации изложены на 125 страницах машинописного текста, иллюстрированы 26 таблицами, 10 рисунками. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, главы собственных исследований, главы с обсуждением результатов исследований, выводов, практических рекомендаций, списка использованной литературы. Библиографический указатель содержит 203 наименований, в том числе 147 отечественных и 56 иностранных.
Метаболические изменения в головном мозге при ишемии в зависимости от индивидуальной устойчивости к гипоксии
Многочисленные экспериментальные исследования убедительно доказали, что в формировании ишемического поражения головного мозга огромную роль играет сложный комплекс биохимических изменений, итогом которого; являются как немедленная, так и отсроченная гибель нейронов и глиальных клеток и формирование неврологического дефицита; (Formigli1 L, Papucci Ь, Tani A. et ah, 2000; Toyran N, Zorlu F, Donmez G;, 2004),
Головной мозг характеризуется высокой чувствительностью к недостатку кислорода, которая связана с недостаточностью энергоресурсов и аэробным типом обменных процессов; При; снижении уровня/мозгового кровотока до 55 мл на 100г в Гмин развивается первая реакция мозга в виде угнетения белкового синтеза, а при снижении кровотока до 35 мл на Л 00 г в 1 мин; — активация анаэробного гликолиза (Kogure. К., Scheinberg Pi, Reimnuth О.М; et all, 2000). При снижении этого показателя до 20 мл на 100 г в 1 мин формируется энергетическая недостаточность, наблюдается: дестабилизация мембран нейронов и выброс нейротрансмиттеров. Развивающиеся энергетический дефицит и лактат-ацидоз способствуют глиальной активации; при дальнейшем снижении кровотока формируется инфаркт мозга - некроз и апоптоз клеток в очаге ишемии (Гусев Е. И., Скворцова В.И., Коваленко А.В., Соколов М.А., 1999). В этих процессах также участвуют провоспалительные цитокины и некоторые, молекулы клеточной адгезии, которые индуцируют процессы воспаления в мозговой ткани, расстройства микроциркуляции, нарушения проницаемости: гематоэнцефалического барьера (MathieserrEBi, Waterloo К, Joakimsen О et al., 2004). В активации процессов, апоптоза участвуют также продукты оксидантного стресса, избыток ионов кальция, дисбаланс нейротрансмиттеров (Скворцова В.И., 2001). Считают, что важнейшим проявлением кислородной недостаточности является нарушение субстратного обеспечения мозга, снижение уровня макроэргов.
Церебральная ишемия вследствие быстро развивающегося дефицита кислорода и глюкозы приводит к нарушению работы ионных насосов, внутриклеточному накоплению ионов кальция и лактата. При этом важную патогенетическую роль играет выброс в синаптическую щель возбуждающих нейротрансмиттеров, в первую очередь глутамата и аспартата. Показано, что 30-минутная ишемия мозга вызывает значительное увеличение концентрации глутамата и аспартата, способствующее необратимым изменениям мозга (Sorrenti V., Di-Giacomo С, Ranis М. et al., 1994), а блокирование действия возбуждающих аминокислот предотвращает аноксическую гибель нейронов (RothmanS., 1984).
Деполяризация цитоплазматической мембраны нейронов под действием возбуждающих нейромедиаторов сопровождается нарушением ионного баланса, значительным повышением внутриклеточной концентрации кальция, что запускает ряд патобиохимических реакций, ведущих к так называемой «кальциевой смерти» части нейронов (Лукьянова Л.Д., 1997; Костюк П.Г., 1997).
Проявление специфики реакций энергетического обмена в мозге и развитие их несостоятельности при гипоксии и ишемии вызывает резкое падение энергообеспечения при повышении внеклеточной концентрации аспартата и глутамата. Их воздействие приводит к дальнейшему прогрессированию энергетического дефицита, изменению электрогенеза постсинаптических нейронов, запускает механизмы отсроченной гибели клеток (Гусев Е.И., Скворцова В.И., 2000). Указанный механизм, основные элементы которого расшифрованы за последние годы, получил название эксайтотоксичности. В условиях острой ишемии гибель мозгового вещества наступает в течение нескольких минут, так как ткань мозга не имеет запасов глюкозы.
Одним из ключевых механизмов повреждения клеток при ишемии является чрезмерная активация свободнорадикального окисления (Зозуля Ю.А., Барабой В.А., Сутковой Д.А, 2000). Сохранение рСЬ на уровне 1-4 мм рт. ст. в тканях мозга достаточно для протекания свободнорадикального окисления (Bellomo G., 1991; Ferrari R., 1991). В патогенезе ишемии мозга окислительный стресс, гиперпродукция свободных радикалов, продуктов ПОЛ играют роль необходимого звена процесса, активного механизма деструкции мембран и гибели нейронов (Horakova L., Lukovic L., Uraz V., Stole S., 1990).
Повышенная продукция свободных радикалов при ишемии является одной из причин длительного спазма сосудов, расположенных перифокально (Pasgulin А., 1998). В возникновении ишемического вазоспазма принимает участие супероксидный анион-радикал Oi (Kamii Н., Kato 1., Kinouchi Н. et. al., 1999). Другим фактором спазма гладких мышц сосудов мозга при ишемии является нарушение баланса между протеинкиназой С, с одной стороны, и NO/cGMP протеинкиназой G, с другой. При ишемии увеличение внутриклеточного диаци л глицерина (одного из вторичных мессенджеров) активирует протеинкиназу С, обусловливает генерацию свободных радикалов; уровень cGMP при этом относительно снижен из-за инактивации гуанилатциклазы (Asaho Т., Matsui Т., 1998). В итоге формируется длительный спазм сосудов, препятствующий быстрой ликвидации последствий ишемии.
Таким образом, именно свободные радикалы ( ОН, 02«) воздействуют на гладкомышечные клетки сосудистой стенки, обусловливая формирование длительного вазоспазма (Caner Н., 1991). Активация протеинкиназы С может служить маркером ранних этапов ишемии мозга и гибели нейронов, наряду с малоновым диальдегидом (Скороход А.А., 2002; Федорова Т.Н., Болдырев А.А., Ганнушкина И.В., 1999; Lazzarino G., 1995). Особенностями состава вещества мозга являются наиболее высокое в организме человека содержание фосфолипидов, полиненасыщенных жирных кислот, Fe2+ и низкое содержание витамина А, низкая плотность глутатионпероксидазы, ничтожно малая активность каталазы (Биленко М.В., 1989). Основные факторы антиоксидантной защиты мозга содержатся не в его веществе, а в крови. При этом ткань головного мозга отличается высоким потреблением кислорода. Вследствие этого головной мозг весьма чувствителен к окислительному стрессу. При прочих равных условиях (продувание in vitro чистого кислорода в течение 3 ч при температуре 37С) накопление малонового диальдегида в гомогенатах мозга крыс в 20 раз выше, чем в гомогенатах печени (Болдырев А.А., 1995).
Таким образом, в результате нарушения при кислородном голодании регуляции метаболизма в клетке образуется достаточное количество субстратов и ферментов, продуцирующих активные формы кислорода с интенсификацией липопероксидации (Барабой В.А., Брехман И.И., Голотин В.Г., 1992). Патогенетическое значение интенсивности процессов перекисного окисления липидов и снижения антиоксидантной активности у больных с ишемическими нарушениями мозгового кровообращения продемонстрировано в ряде клинико-биохимических исследований. Показано, что у больных ишемическим инсультом на фоне общепринятой терапии на протяжении всего курса лечения сохранялась высокая активность процессов перекисного окисления липидов (Суслина З.А., Федорова Т.Н., Кистенев Б.А. исоавт., 1999). Хроническая ишемия мозга сопровождается активацией генов раннего реагирования, продукты экспрессии которых принимают участие в инициации механизмов отсроченной гибели клеток - апоптоза. В этих процессах также участвуют провоспалительные цитокины и некоторые молекулы клеточной адгезии, которые индуцируют процессы воспаления в мозговой ткани, расстройства микроциркуляции, нарушения проницаемости гематоэнцефалического барьера (Mathiesen ЕВ, Waterloo К, Joakimsen О et al., 2004). В активации процессов апоптоза участвуют также продукты оксидантного стресса, избыток ионов кальция, дисбаланс нейротрансмиттеров (Young R, Hernandez MJ; Yagel SK., 1982). Считается, что процессы апоптоза запускаются в той ситуации, когда вредоносное воздействие, каковым является ишемия, недостаточно сильно, чтобы вызвать некроз.
Разделение животных по их устойчивости к острой гипоксии
Для разделения крыс по устойчивости к острой гипоксии их поднимали в барокамере на высоту 11 000 м со скоростью 50 м/с и экспозицией на высоте до возникновения атонального дыхания (Березовский В.А., 1985). Животные, выдерживающие воздействие гипоксии в течение 5-10 мин, считались низкоустойчивыми, более 10 мин - высокоустойчивыми.
Ишемию головного мозга моделировали у различных по устойчивости к гипоксии крыс пережатием общих сонных артерий. Крыс под легким эфирным наркозом фиксировали на специальном станке, производили разрез кожи по передней поверхности шеи, лигировали обе сонные артерии и перевязывали их. Затем кожу зашивали шелком и обрабатывали антисептиком. Эту модель использовали при изучении влияния препаратов на выживаемость крыс, неврологический статус, поведенческие реакции, процессы перекисного окисления липидов и активность антиоксидантных систем в мозге на разных сроках ишемии (3-й и 7-е сутки). Контроль представлял группу ложнооперированных животных.
Неврологический статус у крыс после окклюзии общих сонных артерий оценивали по шкале stroke-index McGrow в модификации И.В. Ганнушкиной (1996); Тяжесть состояния оценивалась по сумме соответствующих баллов (табл. 2). Отмечалось количество крыс: с легкой симптоматикой (до 2,5 баллов по шкале stroke-index) - вялость движений, слабость конечностей, односторонний полуптоз, тремор, манежные движения; с тяжелыми проявлениями неврологических нарушений (от 3 до 10 баллов) - парезы и параличи конечностей, а также боковое положение.
Для регистрации мышечного тонуса использовали тест подтягивания на горизонтальной перекладине (Воронина Т.А., Середенин СБ., 2000). В этом тесте крысы подвешиваются передними лапами на проволоку, натянутую на высоте 20-30 см от поверхности стола. Интактные крысы с ненарушенным мышечным тонусом быстро подтягиваются и удерживаются на перекладине четырьмя лапами. Невыполнение этого рефлекса животными опытной группы свидетельствует о нарушении мышечного тонуса и неврологическом дефиците.
Динамику развития нарушений, вызванных окклюзией общих сонных артерий, и влияние пептидных препаратов на поведение крыс наблюдали в течение 7-й суток с регистрацией поведения и состояния животных на 3- и 7-е сутки после операции. Оценивали влияние пептидных препаратов на выживаемость крыс, регистрируя гибель животных в течение 7-й дней после операции (Воронина Т.А., Островская Р.У., 2000).
Целостность физиологической реакции крыс в постишемическом периоде, различающихся устойчивостью к острой гипоксии, оценивали в тесте «открытого поля» и «приподнятого крестообразного лабиринта» с учетом ориентировочно-исследовательского эмоционального, стереотипного и двигательного компонентов по поведенческому атласу для грызунов (Семенова Т.П., Ли О.Н., 1982; Мельников А.В. и соавт., 2004; Михеев В.В., Шабанов П.Д., 2007).
Свободную двигательную активность животных исследовали в тесте «открытого поля» (Hall C.S., 1934), представляющего собой круглую площадку диаметром 80 см, ограниченную по окружности непрозрачными бортами высотой 30 см. По всей площади открытого поля равномерно расположены 16 отверстий (норок), диаметром 3 см каждая, предназначенных для выявления видоспецифического компонента исследовательской активности у грызунов (норковый рефлекс). Освещенность открытого ПОЛЯ равнялась 100 лк. Во время опыта экспериментальный вольер находился в специальной звукоизолированной комнате. Продолжительность одного опыта составляла 4 минуты. На основании поведенческого атласа для грызунов (Пошивалов В.П., 1978) выбирался ряд элементарных двигательных актов и поз, совокупность которых характеризует целостное поведение в «открытом поле». Исходя из требований регистрации и математической обработки, каждому отдельному элементарному акту присваивался определенный номер (код): 0 - «локомоция» (поступательное движение тела в горизонтальной плоскости); 1 - «обнюхивание» (принюхивание и повороты головы без существенных изменений координат корпуса в горизонтальной и вертикальной плоскостях).
Этот акт может осуществляться в позах «сидя», «стоя», которые трудно различимы без потери его основного биологического значения, поэтому при регистрации не разделялся в зависимости от позы, в которой он появлялся; 2 — «вертикальная стойка» (стойка на задних лапах в центре открытого поля); 3 — груминг (все разновидности этой реакции); 4 - «неподвижность» (покой, сидение, визуально определяемая неподвижность животного обычно в позе «сидя» с подогнутыми конечностями и сгорбленной спиной); 5 - «движение на месте» (изменение координат головы и корпуса в пределах условной окружности, центром которой являются задние конечности животного, координаты которых существенно не меняются (достигается переступанием передних конечностей при опоре на задние); б — «заглядывание в норку» (норковый рефлекс); 7 — «стойка на стенку» (вертикальная стойка на задних лапах с упором передними на стенку вольера). Регистрация актов производилась нажатием клавиши, соответствующей определенному поведенческому акту, на клавишном устройстве, аналогично способу, предложенному В.П.Пошиваловым (1978).
Исследования поведения животных в приподнятом крестообразном лабиринте
Тест «приподнятый крестообразный лабиринт» предложен в лаборатории S. Е. FiUe (Perllow S. et al., 1985). Он основан на инстинктивном предпочтении грызунами закрытых пространств и страхе высоты. Время, проводимое животными в открытом рукаве, и число реакций свешивания обратно пропорционально уровню тревожности (Widgiz S.L.M., Beck С.KM., 1991).
Исследовали поведение крыс в приподнятом крестообразном лабиринте, который состоял из двух открытых рукавов 50x10 см и двух закрытых рукавов 50x10 см с отрытым верхом, расположенных перпендикулярно относительно друг друга. Высота над полом 1 м. Животное помещали в центр лабиринта. Путем нажатия соответствующей клавиши этографа, фиксировали время пребывания в закрытых и открытых рукавах, время свешивания в отрытых рукавах и выглядывания из закрытых рукавов. Продолжительность теста составляла 5 минут. По тестам в приподнятом крестообразном лабиринте оценивали уровень тревожности животных.
Оценку когнитивных функций проводили на 7-е сутки после операции в камере, состоящей из двух отсеков - светлого и темного (Шабанов П.Д. и соавт., 1989). Для выработки условной реакции пассивного избегания (УРПИ) крысу помещали на 3 мин в центр отсека, освещенного на расстоянии 1 м лампой мощностью 100 Вт. Дверцу в темный отсек при этом не закрывали. Животное в силу своих биологических особенностей предпочитает темную часть установки, поэтому заходит в темный отсек, в котором, как правило, остается. При обучении регистрировали латентный период первого захождения в темный отсек, число захождений в него и время нахождения в светлой и темной частях камеры. По истечении 3 мин, когда крыса находилась в темном отсеке, дверцу, соединяющую светлый и темный отсеки камеры, закрывали, и на металлический пол камеры подавали переменный электрический ток 0,6 мА, 50 Гц в течение 5 с. После этой процедуры УРПИ считалась выработанной в одной пробе.
Проверку сохранения УРПИ проводили на 2-е и 4-е сутки после ее выработки помещением крысы в светлый отсек установки на 3 мин, дверцу в темный отсек при этом не закрывали, и ток на пол не подавали. Регистрировали латентный период первого захождения в темный отсек, число захождений в него и время нахождения в светлой и темной частях установки. Увеличение латентного периода захождения в темный отсек и времени пребывания животного в освещенном отсеке квалифицировали как улучшение памяти на ситуацию, а уменьшение данных параметров - как ухудшение памяти (амнезию).
Антидепрессивные эффекты пептидных препаратов оценивали спустя сутки после изучения УРПИ в тесте «поведенческого отчаяния» (Porsolt et al., 2002). Для выполнения теста крыс помещали в сосуд 30-40 см в диаметре и глубиной 60 см, заполненный водой с температурой 25 ± 2С. Животные, попадая в воду, старались выбраться из сосуда. Убедившись в тщетности своих попыток, крысы оставляли их и зависали в воде в характерной позе. Показателем выраженности депрессивноподобного состояния по данному тесту является длительность неподвижности, которую оценивали визуально в течение 5 мин регистрировали время неподвижности.
В больших полушариях мозга, замороженных в жидком азоте, определяли содержание первичных (диеновые и кетотриевоые конъюгаты ненасыщенных жирных кислот) и вторичных (малоновый диальдегид) продуктов перекисного окисления липидов.
Содержание ТБК-связывающих продуктов в пересчете на концентрацию малонового диальдегида определяли после приготовления 10% гомогенатов больших полушарий мозга в 25 мМ Трис-HCl с 175 мМ КО буфере (рН 7,4) и осаждения в них белка (Путилина Ф.Е. и соавт., 2006).
Метод определения малонового диальдегида основан на образовании в результате реакции тиобарбитуровой кислоты с малоновым диальдегидом при высокой температуре в кислой среде окрашенного триметинового комплекса с максимумом поглощения при длине волны 532 нм. Количество комплекса, определяемого спектрофотометрически, пропорционально концентрации малонового диальдегида в пробе.
Концентрации диеновых конъюгатов и кетотриеновых конъюгатов определяли, используя методы И.Д. Стальной и А.А. Шведовой, Н.Б. Полянского (1977) в модификации О.И.Мироновой (1998). Принцип метода основан на свойствах сопряженных двойных и тройных связей в молекулах полиненасыщенных жирных кислот в ходе перекисного окисления на стадии образования свободных радикалов интенсивно поглощать в ультрафиолетовой области с характерными максимумами. Диеновые конъюгаты экстрагировали из навески ткани мозга массой 100 мг смесью гептана и изопропанола в соотношении 1:1 в объеме 2 мл. После добавления 0,2 мл воды и расслоения фаз, отбирали 0,5 мл верхнего гептанового слоя, к которому добавляли 2 мл 95% этанола. Затем пробы фотометрировали. Поглощение при длине волны 233 нм обусловлено содержанием диеновых конъюгатов, при длине волны 275 нм - кетотриеновых конъюгатов.
Для оценки состояния антиоксидантных систем в больших полушариях мозга, крыс, замороженных в жидком- азоте, определяли активность супероксиддисмутазы, содержание восстановленного глутатиона, SH-rpynn белков и жирорастворимых антиоксидантов.
Активность супероксиддисмутазы оценивали по степени ингибирования восстановления нитросинего тетразолия в присутствии феназинметасульфата и НАДН по методу Е.Е. Дубининой и соавторов (1983). Изменения оптической плотности проб регистрировали при длине волны 535 нм. Активность супероксиддисмутазы относили к содержанию белка в пробах. Белок определяли унифицированным методом по биуретовой реакции, регистрируя оптическую плотность проб при длине волны 760 нм (Lowry О.Н., 1951).
Содержание восстановленного глутатиона определяли по методу Ф.Е. Путилиной (2006). Принцип метода основан на реакции глутатиона с избытком аллоксана с образованием соединения с максимумом поглощения при длине волны 305 нм. Концентрация этого соединения прямо пропорциональна концентрации восстановленного глутатиона в пробе.
Содержание жирорастворимых антиоксидантов определяли по Глевинду (Зенков Н.К., Ланкин В.З., Меньшикова Е.Б., 2001). Принцип метода состоит в том, что стабильный свободный радикал D-дифенил-О-пикрилгидразил восстанавливается в. реакции с антиоксидантом, при этом снижается оптическая плотность его раствора при 517 нм. В качестве стандарта использовали раствор гидрохинона.
Методы определения активности антиоксидантных систем
Зоосоциальное поведение животных отражает функционально-метаболические изменения в головном мозге после перенесенной ишемии. Интактные фенотипически разнородные по устойчивости к гипоксии крысы проявляли различные поведенческие реакции. При тестировании в «открытом поле» и приподнятом крестообразном лабиринте высокоустойчивые животные характеризовались уравновешенным типом поведения. У низкоустойчивых животных наблюдалась более выраженная локомоторная, поисковая активность и тревожность. Характер поведенческих реакций у ложнооперированных животных был сходным с интактными животными:
В постишемическом периоде у крыс обеих групп снижалась спонтанная, двигательная активность. В тесте «открытое поле» наблюдалось уменьшение горизонтальных движений (по числу пересеченных квадратов) на 3-й сутки у высокоустойчивых животных на 51%, у низкоустойчивых - на 81%, а на 7-е сутки - на 63% и 85% соответственно (табл. 6). Снижалась и вертикальная активность, регистрируемая по числу стоек животных. Так, на 3-й сутки после ишемии головного мозга число вертикальных стоек у высокоустойчивых крыс снижалось на 96%, у низкоустойчивых — на 92%, на 7-е сутки после ишемии — на 70% и 87% соответственно (табл. 7). Тем не менее, после ишемии головного мозга высокоустойчивые и низкоустойчивые животные демонстрировали неодинаковое стереотипное поведение. Низкоустойчивые крысы были заторможены и утрачивали способность к исследовательской активности, что свидетельствует о дезинтеграции отдельных компонентов целостной поведенческой реакции. Высокоустойчивые животные сохраняли такие элементы поведения, как «обнюхивание», «движение на месте», «выходы в центр поля». После ишемии мозга высокоустойчивые и низкоустойчивые животные проявляли неодинаковые паттерны эмоционального поведения. У низкоустойчивых крыс снижались вегетативные проявления эмоциональности, что проявлялось в уменьшении числа актов груминга и их продолжительности, снижении числа болюсов дефекации. У высокоустойчивых животных, напротив, данные показатели увеличивались, что свидетельствовало о возрастании эмоциональности. С эмоциональным статусом животных согласуются и параметры тревожности. Животные обеих групп в постишемическом периоде на протяжении всего периода наблюдений проявляли высокую степень тревоги, что выражалось в уменьшении времени нахождения в открытых рукавах лабиринта, выглядываний из закрытых рукавов, выходов в центр и свешиваний с краев лабиринта. В установке «приподнятый лабиринт» крысы выполняли единичные неполные выходы из рукавов с демонстрацией так называемой «оценки риска» в виде вытянутой позы со свешиванием с края лабиринта. Изменение показателей тревожности в постишемическом периоде было более выраженным у низкоустойчивых животных. У высокоустойчивых и, особенно у низкоустойчивых к гипоксии животных увеличивалось время неподвижности на фоне снижения активного плавания, регистрируемые в тесте Порсолта, что указывает на формирование у них депрессивного состояния.
На фоне действия кортексина число пересеченных квадратов «открытого поля» на 3-й сутки возрастало по сравнению с нелеченными крысами у высокоустойчивых особей на 23%, у низкоустойчивых - на 31 %, на 7-е сутки пересечение квадратов увеличивалось у высокоустойчивых на 45%, у низкоустойчивых- на 107% (табл. 6). Кортаген оказывал сходное с кортексином действие, увеличивая число пересеченных квадратов «открытого поля» на 3-й сутки у высокоустойчивых особей на 25%, у низкоустойчивых — на 35%, а на 7-е сутки - на 53% и 119% соответственно (р 0,05). Введение крысам в постишемическом периоде ноопепта сопровождалось увеличением числа пересеченных квадратов «открытого поля» на 3 сутки у высокоустойчивых животных на 41%, у низкоустойчивых - на 65%, а на 7-е сутки — на 125% и 205%) соответственно (р 0,05). Вертикальная активность на фоне действия кортексина возрастала на 3 -и сутки у высокоустойчивых крыс на 47%, у низкоустойчивых - на 138%, а на 7-е сутки - на 55% и 125% соответственно (табл. 7).
В большей степени на изменение вертикальной активности животных влиял ноопепт, увеличивая ее на 3-й сутки после ишемии у высокоустойчивых крыс на 246%, у низкоустойчивых - в 6,5 раз, а на 7-е сутки после ишемии - на 177% и в 6 раз соответственно (р 0,05). Анализ изменений на фоне действия пептидных препаратов поисковой активности показал, что на 3-й сутки после ишемии кортексин увеличивал число выходов в центр «открытого поля» у высокоустойчивых животных на 62%, у низкоустойчивых - на 38%, а на 7-е сутки - на 155% и 78% соответственно (табл. 8). Примечание: а - достоверные различия (р 0,05) по сравнению с ложнооперированньтми животными, б - по сравнению с ишемией. На фоне действия кортагена в течение всего периода наблюдений количество выходов в центр «открытого поля» у высокоустойчивых и низкоустойчивых крыс имели тенденцию к увеличению, но достоверно не изменялись по сравнению с нелеченными животными. В большей степени количество выходов в центр «открытого поля» увеличивалось при введении ноопепта. Так, на 3-й сутки после ишемии у высокоустойчивых крыс этот показатель увеличивался на 223%, у низкоустойчивых - на 175%, а на 7-е сутки - на 215% и 278% соответственно (р 0,05). На фоне применения пептидных препаратов в постишемическом периоде у животных изменялись и показатели исследовательской активности, регистрируемые по числу заглядываний животными в отверстия- норки «поля». Животные с высокой устойчивостью к гипоксии, получавшие кортексин, на 3-й сутки после ишемии заглядывали в норки в раза больше, а низкоустойчивые - па 91%, чем крысы без препарата (табл. 9).
На 7-е сутки после ишемии число заглядывании в норки увеличивалось у высокоустойчивых животных на 167%, у низкоустойчивых — на 113%. На фоне действия кортагена в течение всего периода наблюдений количество заглядывании в отверстия «открытого поля» у высокоустойчивых и низкоустойчивых крыс имели тенденцию к увеличению, но достоверно не изменялись по сравнению с нелеченными животными. Применение ноопепта более выражено увеличивало поисковую активность крыс. На 3-й сутки после ишемии у высокоустойчивых животных число заглядывании в норки возрастало на 260%, у низкоустойчивых на 273%, а на 7-е сутки - на 278% и 437% соответственно (р 0,05). Кортексин и кортаген в разной степени корригировали паттерны эмоциональной компоненты поведенческих реакций высокоустойчивых и / низкоустойчивых крыс. Применение кортексина на 3-й сутки после ишемии у высокоустойчивых животных достоверно не изменяло число актов груминга, их продолжительность и число болюсов дефекации, хотя и наблюдалась тенденция к снижению этих показателей (табл. 10, 11, 12). В группе низкоустойчивых крыс на фоне действия кортексина число актов груминга увеличивалось на 60%, их продолжительность возрастала на 33%, а число болюсов дефекации - на 88% (р 0,05). При введении крысам кортагена в группе высокоустойчивых крыс на 3-й сутки число актов груминга снижалось на 32%, их продолжительность на 25%, а число болюсов дефекации - на 32%. У низкоустойчивых крыс на фоне действия кортагена показатели эмоциональной активности имели тенденцию к увеличению, однако по отношению к нелеченным животным достоверно не изменялись. На 7-е сутки после ишемии сходная динамика показателей эмоциональной активности различных по устойчивости к гипоксии животных на фоне кортексина и кортагена сохранялась. На фоне действия ноопепта изменения эмоциональной активности крыс было более значимым. На 3-й сутки после ишемии у высокоустойчивых животных число актов груминга уменьшалось на 46%, их продолжительность на 37% и число болюсов на 34%. В группе низкоустойчивых крыс на фоне действия ноопепта число актов груминга увеличивалось на 140%, их продолжительность возрастала в 2 раза, а число болюсов дефекации - в 8 раз.
Методы определения активности антиоксидантных систем
Способность к обучению животных в постишемическом периоде и возможность коррекции мнестических функций пептидными препаратами оценивали по выработке условного рефлекса пассивного избегания (УРГТИ) спустя 7 суток после окклюзии общих сонных артерий. Пептидные препараты вводили в течение 7-й дней после ишемии мозга и во время обучения животных в тесте УРПИ.
При воспроизведении УРПИ через 24 ч после обучения (получение болевого раздражения в темном отсеке камеры) 80% интактных высоко- и низкоустойчивых к гипоксии-крыс помнили об ударе током и.не заходили в темную «опасную» камеру в течение всего времени наблюдения. Остальные 20% крыс заходили в темный отсек с большим латентным периодом. У ложнооперированных животных достоверных изменений этого показателя в те же сроки не наблюдалось. После двусторонней окклюзии общих сонных артерий у высокоустойчивых и у низкоустойчивых к гипоксии животных нарушалась способность к обучению, что выражалось в достоверном снижении латентного периода условного рефлекса пассивного избегания (125 ± 16 с у ВУ и 114 ± 11 су НУ крыс) по сравнению с его уровнем у ложнооперированных животных (165 ±19 с у ВУ и 152 ± 17 с у НУ). Причем нарушение мнестических функций в большей степени было выражено у низкоустойчивых к гипоксии животных (табл. 18).
Введение кортексина в течение 7-й суток после окклюзии общих сонных артерий способствовало сохранению УРПИ в обеих группах различных по устойчивости к гипоксии животных по сравнению с ишемизированными крысами. Латентный период пассивного избегания на 2-ой день обучения у высокоустойчивых крыс составил 144 ±15 с, у низкоустойчивых - 132 ±12 с. На 3-й день тестирования латентный период у высокоустойчивых крыс составлял 156 ±14 с, у низкоустойчивых— 144 ±15 с.
Введение кортагена в течение 7-й дней" животным с ишемическим повреждением головного мозга также облегчало выработку УРНИ по сравнению с нелеченными крысами. Так, при воспроизведении УРНИ через сутки после обучения высокоустойчивые крысы заходили в темный опасный отсек через 152 ±14 с, а низкоустойчивые - через 138 ±12 с. На 3-й день тестирования-латентный период у высокоустойчивых крыс составлял 162+13 с, у низкоустойчивых- 148+15 с.
Через 7 суток после введения ноопепта ишемизированные животные хорошо помнили о получении болевого раздражения в темном отсеке камеры и выполняли УРПИ. По сравнению с нелеченными крысами латентное время захода в темную опасную камеру через день после обучения у высокоустойчивых крыс возрастал до 157 ±17 с, у низкоустойчивых - 148 ±15 с. На 3-й день тестирования латентный период у высокоустойчивых крыс составлял 168 ±15 с, у низкоустойчивых — 154 ±16 с. Количество выходов животных на всех этапах выполнения УРПИ коррелировало с латентным периодом захода в опасную камеру установки.
Таким образом, окклюзия общих сонных артерий приводит к значительному уменьшению латентного периода УРПИ у высокоустойчивых крыс и, особенно у низкоустойчивых к гипоксии животных, что свидетельствует о нарушении способности к обучению и памяти животных. Введение в течение 7-й суток ишемизированным крысам пептидных препаратов облегчает выработку УРПИ по сравнению с нелеченными животными и способствует повышению обучаемости, утраченной вследствие ишемии мозга, и сохранению памятного следа. При этом действие ноопепта оказалось более эффективным, чем кортексина и кортагсна.
Результаты исследования условно-рефлекторной деятельности у животных после окклюзии общих сонных артерий свидетельствуют о значимости индивидуальной устойчивости организма к острой гипоксии в постишемическом периоде и возможности коррекции пептидными препаратами поведенческих реакций у высоко-и низкоустойчивых крыс. Спустя 7 суток после окклюзии общих сонных артерий время активного плавания в тесте Порсолта у высокоустойчивых к гипоксии крыс снижалось на 40%, у низкоустойчивых - на 46% (табл. 19). При этом возрастало время неподвижности на 36%) и 40% соответственно (р 0,05). На фоне действия кортексина в обеих группах животных достоверных изменений показателей, определяемых в тесте Порсолта, не наблюдалось, что свидетельствует об отсутствии у кортексина антидепрессивных эффектов.
При введении высокоустойчивым животным кортагена время плавания и неподвижности достоверно не отличалось от ложнооперированных крыс. В группе низкоустойчивых крыс, получавших кортаген, по сравнению с нелеченными животными время активного плавания увеличивалось на 35%, пассивного плавания снижалось на 37% и неподвижности животных уменьшалась на 48%. Однако эти показатели не достигали значений в группе интактных низкоустойчивых животных. Применение ноопепта оказывало выраженное антидепрессивное действие у высоко- и низкоустойчивых животных, восстанавливая значения времени плавания и неподвижности до уровня ложноопериованных животных. 3.3. Влияние пептидных препаратов на метаболические изменения в головном мозге различных по устойчивости к гипоксии животных после ишемии головного мозга
![Фармакологическая коррекция метаболизма миокарда у больных ревматическими пороками сердца в послеоперационном периоде [Электронный ресурс]](/i/i/4393/212097.png "Фармакологическая коррекция метаболизма миокарда у больных ревматическими пороками сердца в послеоперационном периоде [Электронный ресурс] Пешехонов Владимир Иванович")
![Влияние гепатопротекторов и регуляторов энергетического обмена на биоэнергетику головного мозга при нарушении [В]-окисления жирных кислот](/i/i/4422/313245.png "Влияние гепатопротекторов и регуляторов энергетического обмена на биоэнергетику головного мозга при нарушении [В]-окисления жирных кислот Слепичев Владимир Анатольевич")
