Содержание к диссертации
Введение
1. Введение 4
2. Обзор литературы 10
3. Обсуждение результатов 46
3.1 Взаимодействие гидразидов и ароматических карбоновых кислот, и 8-алкил-№-фенилдитиокарбазатов с оксалилхлоридом 46
3.1.1 Синтез АН-1,3,4-окса(тиа)диазин-5,6-дионов 46
3.1.2 Строение 2-алкилсульфанил- и 2-арил-4Д"-1,3,4-окса(тиа)диазин-5,6 дионов 47
3.1.3. Реакции 2-арил(гетерил)-4#-1,3,4-оксадиазин-5,6-дионов с О-и N-нуклеофильными реагентами 60
3.1.4. Реакции 2-алкилсульфанил- и 2-арил-4і7(фенил)-1,3,4-тиадиазин-5,6-дионов с 0-и iV-нуклеофильными реагентами 64
3.1.5. Квантово-химическое изучение реакционной способности 2 алкилсульфанил- и 2-арил-4//-1,3,4-окса(тиа)диазин-5,6-дионов
в реакциях с нуклеофильными реагентами 64
3.2. Взаимодействие гидразидов ароматических карбоновых кислот с мало-нилдихлоридами 67
3.3. Реакции тиогидразидов ароматических карбоновых кислот с малонилди-хлоридами. Строение продуктов реакций 72
3.4. Реакции N - фенилгидразидов ароматических тионокарбоновых кислот с малонилдихлоридами. Строение продуктов реакций 79
3.5. Взаимодействие S-метил N -фенилдитиокарбазатов с малонилдихлоридами. Строение продуктов реакций 86
3.6. Квантово-химическое изучение реакционной способности гидразидов, тиогидразидов и дитиокарбазатов в реакциях с малонилдихлоридами 91
3.7. Некоторые виды биологической активности полученных соединений 92
3.7.1. Антимикробная активность 92
3.7.2. Острая токсичность
3.7.3. Противовирусная активность 2-бензилсульфанил-4-фенил-4і/-1,3,4 тиадиазин-5,6-диона и 1-тиобензоил-4,4-диэтилпиразолидин-3,5-диона 97
3.7.4. Изучение влияния 2-бензилсульфанил-4-фенил-4і/-1,3,4-тиадиазин-5,6-диона и 1-тиобензоил-4,4-диэтилпиразолидин-3,5-диона на функциональную активность нейтрофилов крови крыс in vitro 98
3.7.5. Изучение цитопротекторной активности 2-бензилсульфанил-4 фенил-4Н-1,3,4-тиадиазин-5,6-диона и 1 -тиобензоил-4,4-диэтилпиразолидин-3,5-диона 1 4. Выводы 107
5. Экспериментальная часть 109
6. Список литературы
- Строение 2-алкилсульфанил- и 2-арил-4Д"-1,3,4-окса(тиа)диазин-5,6 дионов
- Реакции 2-алкилсульфанил- и 2-арил-4і7(фенил)-1,3,4-тиадиазин-5,6-дионов с 0-и iV-нуклеофильными реагентами
- Реакции N - фенилгидразидов ароматических тионокарбоновых кислот с малонилдихлоридами. Строение продуктов реакций
- Изучение влияния 2-бензилсульфанил-4-фенил-4і/-1,3,4-тиадиазин-5,6-диона и 1-тиобензоил-4,4-диэтилпиразолидин-3,5-диона на функциональную активность нейтрофилов крови крыс in vitro
Введение к работе
Актуальность темы. Гидразиды и тиогидразиды широко используются в получении различных гетероциклических соединений. Они служат источниками различных оксопиразолинов, окса- и тиадиазолов и -диазинов, и их бен-зо(гетеро)конденсированпых аналогов.
Известно, что представители этой группы гетероциклических соединений обладают разными видами биологической активности. Известны вещества с кардиотоническим, антибактериальным, фунгицидным, противовирусным, про-тивопаразитарным, противоопухолевым действием, имеются ингибиторы мо-поамшюоксидаз. Многие 4#-1,3,4-окса(тиа)диазины используются в качестве исходных соединений для получения разнообразных ациклических и гетероциклических систем, синтез которых другими методами невозможен или многостадиен. Сами тиогидразиды, дитиокарбазаты и их комплексы с ионами металлов обладают антибактериальным и фунгицидным действием, однако они не нашли применения в медицине по причине невысокой избирательности действия и высокой системной токсичности, что вызывает необходимость их химической модификации. Уместно заметить, что среди соединений, имеющих фрагмент NH-NH-C=0(S), тиогидразиды распространены значительно меньше в отличие от тиосемикарбазидов. В литературе отсутствуют упоминания и о взаимодействии гидразидов, тиогидразидов и дитиокарбазатов с малонилди-хлоридами, а о реакциях гидразидов и тиогидразидов с оксалилхлоридом, приводящих к получению некоторых производных 1,3,4-окса(тиа)диазинов в лите-іатурс имеются лишь единичные упоминания.
Поэтому реакции ацилирования гидразидов и тиогидразидов этими реагентами представляют несомненный интерес как с точки зрения теоретической и синтетической органической химии, так и с точки зрения поиска новых эффективных и малотоксичных лекарственных субстанций.
Цель работы заключалась в разработке удобных методов синтеза новых биологически активных производных 1,3,4-гетеродиазинов и (гетеро)диазолов а основе взаимодействия гидразидов и тиогидразидов карбонових кислот с оксалил- и малонилдихлоридами. Задачи работы включали:
Комплексное изучение закономерности процессов гетероциклизации гидразидов, тиогидразидов и дитиокарбазатов с оксалил- и малонилдихлоридами.
Исследование взаимодействия 1,3,4-гетеродиазинов с некоторыми нук-леофильными реагентами.
Доказательство строения полученных соединений.
Квантово-химическая интерпретация экспериментальных результатов, определение возможностей и границ применения статических индексов реакционной способности в прогнозировании синтеза новых 1,3,4-гетеродиазинов и (гетеро)диазолов с заданным строением и свойствами.
Исследование антимикробной и некоторых других видов биологической активности и их связи со строением исследуемых веществ.
Научная новизна. Настоящая работа является первым целенаправленным исследованием реакций гидразидов и тиогидразидов ароматических и ге-тероароматических карбоновых кислот с оксалил- и малонилдихлоридами, в ходе которого было синтезировано около 50 ранее неизвестных гетероциклических и ациклических соединений, изучены их строение и свойства.
Впервые показано, что:
Взаимодействие N'-незамещенных гидразидов, тиогидразидов и дитио-карбазатов с оксалилхлоридом приводит к 4Н- 1,3,4-окса- и тиадиазин-5,6-дионам. Причем в кристаллическом состоянии, газовой фазе и в диметилсуль-фоксидном растворе окса- и тиадиазины существуют преимущественно в 5,6-диоксоформс;
при действии О- и Аг-нуклсофильных реагентов оксадиазины подвергаются расщеплению по связи Сб-0' с образованием оксо(2-бензоил-гидразинил)этановой кислоты, её эфира и амидов. В аналогичных условиях тиадиазины проявляют устойчивость к действию воды и спиртов, что хорошо согласуется с данными квантово-химических расчетов электронных структур этих соединений. /V-нуклеофилы разрушают тиадиазиновый цикл до диамидов щавелевой кислоты, исходных тиогидразидов(дитиокарбазатов) и продуктов их деградации;
Взаимодействие N'-незамещенных гидразидов с малонилдихлоридами, в зависимости от природы хлорангидридов, в среде малополярных инертных растворителей приводит к образованию 1-ароил-4,4-диалкилпиразолидин-3,5-дионов и ациклических 2,2-диалкил-Л^',іУ3-бис(ароил)пропандигидразидов;
Направление реакций тиобенгидразида с малонилдихлоридами существенно зависит от строения последних и природы растворителя. В зависимости от структуры малонилдихлоридов при взаимодействии с TNP-фенилтиобензгадразидом образуются хлориды 2-[(Е)-1-(3,5-дифенил-1,3,4-тиадиазол-2(ЗЯ)-илиден)алкил]-3,5-дифенил-1,3,4-тиадиазол-3-ия и 1-тиобензоил-2-фенилпиразолидин-3,5-дионы. В результате реакции 8-метил-М'-фепилдитиокарбазата с малонилдихлоридами образуются метил 3,5-диоксо-2-фенилпиразолидин-1-карбодитиоаты;
Полученные соединения проявляют умеренную антимикробную активность, однако хлорид 2-[(2)-1-(3,5-дифенил-1,3,4-тиадиазол-2(ЗЯ)-илиден)метил]-3,5-дифенил-1,3,4-тиадиазол-3-ия обладает высокой антибактериальной и фунгицидной активностью, причем минимальные ингибирующие концентрации находятся на уровне препаратов, использующихся в терапевтической практике (ванкомицин, линезолид, флуконазол). Подана заявка на изобретение;
1-тиобензоил-4,4-диэтил-пиразолидин-3,5-дион оказывает выраженное противовирусное действие в отношение штамма Виктория/35/72 A(H3N2) вируса гриппа А. 2-бензилсульфанил-4-фенил-4Я-1,3,4-тиадиазин-5,6-дион обладает иммунотропным и цитопротекторным действием, что было показано на модели панцитопении токсического генеза.
Практическая значимость. В ходе проведенных исследований разработаны препаративные методы синтеза новых 1,3,4-окса- и тиадиазин-5,6-дионов,
1-тиобензоил- и 1-(алкилсульфаішлтиокарбонил)пиразолидин-3,5-дионов, бис-
5-фснил-2-1,3,4-тиадиазолил)алканов, хлоридов 2-[(2)-1-(3,5-дифенил-1,3,4-
иадиазол-2(ЗЛ)-илиден)метил(этил)]-3,5-дифенил-1,3,4-тиадиазол-3-ия и
,2,3,3-тетра(5-фенил-1,3,4-тиадиазол-2-ил)бутана. Обнаружены новые классы нтибактериальных, фунгицистатических, противовирусных агентов, а также :ндукторов неспецифического иммунитета и цитопротекторов. По итогам ра-оты оформлены акты внедрения полученных результатов в учебный процесс 'ОУ ВПО СПХФА и в научно-исследовательскую работу ГУ НИИ Гриппа АМН.
Положения, выносимые на защиту.
Реакции гидразидов и тиогидразидов карболовых кислот с оксалил-лоридом - эффективный метод синтеза 1,3,4-окса(тиа)диазин-5,б-дионов.
При ацилировании гидразидов ароматических кислот малонилдихло-идами образуются 1-ароил-4,4-диалкилпиразолидин-3,5-дионы и 2,2-диалкил-л ,Л/10-бис(ароил)пропаидигидразиды. Взаимодействие N'-незамещенных тио-епзгидразидов с малонилдихлоридами - путь к получению новых бис(5-іенил-1,3,4-тиадиазол-2-ил)метанов и 1-тиоароилпиразолидин-3,5-дионов, об-адающих высокой противовирусной активностью.
Реакции N'-фенилтиобензгидразидов с моно- и незамещенным мало-илдихлоридами - удобные одностадийные методы получения хлоридов 2-[(Z)--(3,5-дифснил-1,3,4-тиадиазол-2(ЗЯ)-илиден)метил(алкил)]-3,5-дифенил-1,3,4-аадиазол-3-ия, обладающих высокой антимикробной активностью.
Квантово-химические методы DFT, МР2 и CBS-4M расчетов электрон-ой структуры и термохимических параметров исследуемых соединений для онимания и объяснения их реакционной способности.
Иммунотроиная, цитопротскторная и умеренная антибактериальная стивность 2-бензилсульфанил-4-фенил-4Я-1,3,4-тиадиазин-5,6-диоиа.
Диссертационная работа выполнена в соответствии с тематическим пла-ом научно-исследовательских работ ГОУ ВПО СПХФА "Исследование путей ;штеза, строения, физических и химических свойств, биологической активно-ги и связи между ними в ряду N-, О-, S-содержащих гетероциклических сочинений с целью поиска новых лекарственных средств" (№ государственной ггистрации 01200852357).
Апробация работы. Материалы диссертации прошли апробацию на ме-дународной конференции по органической химии «Органическая химия со эемен Бутлерова и Бейльштейна по настоящее время», Санкт-Петербург, 2006; а региональной научной конференции студентов и аспирантов СПХФА "Мо-эдыс ученые - практическому здравоохранению", Санкт-Петербург, 2007; на ежрегиональной конференции Пятигорской фармацевтической академии Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции", дтигорск, 2007; на международной научно-практической конференции «Стра-згические вопросы мировой науки 2007», Днепропетровск, 2007; на межрегио-альной конференции Пятигорской фармацевтической академии "Разработка, сследование и маркетинг новой фармацевтической продукции", Пяти-ірск,2008; на межрегиональной конференции СПХФА "Фармация из века в
век", Санкт-Петербург, 2008; на международной научно-практической конференции «Динамика научных исследований», София, 2008; на конференции «Фармация в XXI веке: эстафета поколений», Санкт-Петербург, 2009 г.
Публикации. По теме диссертации опубликованы 5 статей: две в Журнале Общей Химии, в журнале Butlerov Communications, в 62-м и 63-м сборниках трудов Пятигорской фармацевтической академии, тезисы 6 докладов. Подана заявка на изобретение (имеется регистрационный номер).
Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 153 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературных данных, обсуждения результатов собственных экспериментов, экспериментальной части и выводов, содержит 32 таблиц и 30 рисунков. Библиография включает 170 ссылок (из них 129 иностранных).
Строение 2-алкилсульфанил- и 2-арил-4Д"-1,3,4-окса(тиа)диазин-5,6 дионов
Полученные соединения проявляют умеренную антимикробную ак тивность, однако хлорид 2-[(г)-1-(3,5-дифенил-1,3,4-тиадиазол-2(ЗЯ) илиден)метил]-3,5-дифенил-1,3,4-тиадиазол-3-ия обладает высокой антибак териальной и фунгицидной активностью, причем минимальные ингибирую щие концентрации находятся на уровне препаратов, использующихся в тера певтической-практике (ванкомицин, линезолид, флуконазол). Подана заявка на изобретение; 1-тиобензоил-4,4-диэтил-пиразолидин-3,5-дион оказывает выраженное противовирусное действие в отношение штамма Виктория/35/72 A(H3N2) вируса гриппа А. 2-бензилсульфанил-4-фенил-1,3,4-тиадиазин-5,6-дион об ладает иммунотропным и цитопротекторным действием, что было показано на модели панцитопении токсического генеза.
Практическая значимость. В ходе проведенных исследований разработаны препаративные методы синтеза новых 1,3,4-окса- и тиадиазин-5,6-дионов, 1-тиобензоил- и 1-(алкилсульфанилтиокарбонил)пиразолидин-3,5-дионов, бис-(5-фенил-2-1,3,4-тиадиазолил)алканов и ранее не описанных хлоридов 2-[(г)-1-(3,5-дифенил-1 ,35,4-тиадиазол-2(ЗД)-илиден)метил(этил)]-3,5-дифенил-1,3,4-тиадиазол-3-ия и 2,2,3,3-тетра(5-фенил-1,3,4-тиадиазол-2-ил)бутана. Обнаружены новые классы антибактериальных, фунгицистатиче-ских, противовирусных агентов, а также индукторов неспецифического иммунитета и цитопротекторов. По итогам работы оформлены акты внедрения полученных результатов в учебный процесс ГОУ ВПО СПХФА и в научно-исследовательскую работу ГУ НИИ Гриппа РАМН:
Положения, выносимые на защиту. 1. Реакции гидразидов и тиогидразидов карбоновых кислот с оксалил-хлоридом - эффективный метод синтеза 1,3,4-окса(тиа)диазин-5,6-дионов. 2. При ацилировании гидразидов ароматических кислот малонилди-хлоридами образуются 1-ароил-4,4-диалкилпиразолидин-3,5-дионы и 2,2 1 -у диалкил- AT ,N -бис(ароил)пропандигидразиды. Взаимодействие N незамещенньгх тиобензгидразидов с малонилдихлоридами - путь к получе нию новых бис(5-фенил-1,3,4-тиадиазол-2-ил)метанов и 1 тиоароилпиразолидин-3,5-дионов, обладающих высокой противовирусной активностью. 3. Реакции N -фенилтиобензгидразидов с моно- и незамещенным ма лонилдихлоридами - удобные одностадийные методы получения хлоридов 2 [(Z)-1-(3,5-дифенил-1,3,4-тиадиазол-2(3 Л)-илиден)метил(алкил)]-3,5 дифенил-1,3,4-тиадиазол-3-ия, обладающих высокой антимикробной актив ностью. 4. Квантово-химические методы DFT, МР2 и GBS-4M расчетов электронной структуры и термохимических параметров исследуемых соединений для понимания и объяснения их реакционной способности. 5. Иммунотропная, цитопротекторная и умеренная антибактериальная активность 2-бензилсульфанил-4-фенил-4і7-1,3,4-тиадиазин-5,6-диона.
Диссертационная работа выполнена в соответствии с тематическим пла-ном научно-исследовательских работ ГОУ ВПО ЄПХФА "Исследование путей синтеза, строения, физических и химических свойств, биологической активно-сти и связи между ними в ряду N-, О-, S-содержащих гетероциклических со-единений с целью поиска новых лекарственных средств" (№ государственной регистрации 01200852357).
Апробация работы. Материалы диссертации прошли апробацию на международной конференции по органической химии «Органическая химия со времен Бутлерова и Бейльштейна по настоящее время», Санкт-Петербург, 2006; на региональной научной конференции, студентов и аспирантов СПХФА "Молодые ученые - практическому здравоохранению", Санкт-Петербург, 2007; на межрегиональной конференции" Пятигорской фармацевтической академии "Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции", Пятигорск, 2007; на международной научно-практической конференции «Стратегические вопросы мировой науки 2007», Днепропетровск, 2007; на межрегиональной конференции- Пятигорской фармацевтической академии "Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции", Пятигорск,2008; на межрегиональной конференции СПХФА "Фармация из века в век", Санкт-Петербург, 2008; на международной научно-практической конференции «Динамика научных исследований», София, 2008; на конференции «Фармация в XXI веке: эстафета поколений», Санкт-Петербург, 2009 г.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 статей: 2 в Журнале Общей Химии, в журнале Butlerov Communications, в 62-м и 63-м сборни ках трудов Пятигорской фармацевтической академии, тезисы 6 докладов. Подана заявка на изобретение (имеется регистрационный номер).
Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 153 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературных данных, обсуждения результатов собственных экспериментов, экспериментальной части и выводов, содержит 32 таблицы и 30 рисунков. Библиография включает 170 ссылок.
Реакции 2-алкилсульфанил- и 2-арил-4і7(фенил)-1,3,4-тиадиазин-5,6-дионов с 0-и iV-нуклеофильными реагентами
Из имеющихся в литературе сведений о биологической активности продуктов циклоконденсации гидразидов и тиогидразидов наиболее интересными являются оксопроизводные пиразолинов, 1,3,4-тиадиазолов и 1,3,4-гетеродиазинов. Ниже приводятся примеры различных фармакологических активностей этих соединений.
3,5-Ииразолидиндионы обладают широким спектром биологической активности (рисунок 61). 4-Гидрокси-оксифенбутазон (CXXXVI) обладает им-муносупрессорным действием, являясь мощным ингибитором продукции ци-токинов [159]. 1,2-Бис(4-хлорфенил)-5-гидрокси-3-оксо-2,3-дигидро-Ш-пиразол-4-карб-оксамиды (R=apnn, ароалкил) (CXXXVII) оказывают высокую антимикробную активность в отношении S. aureus, Е. faecalis, Е. coli и S. pneumoniae (МИК=0.12...64 мкг/мл), ингибируя УДФ-ЇЧ-ацетиленолпирувил-глюкозамин-редуктазу (МигВ) и тем самым блокируя биосинтез клеточной стенки [78]. Из структур общей формулы (CXXXVIII) известен ингибитор с-Src/Abl-тирозинкиназ (R Ph, R2=4-I-Ph), строение которых было выведено из молекулярно-динамических симуляций и фармакофорного моделирования [120], а также антиагрегант (R =Ph, R =2,3-Me-4-PrO-Ph), являющийся антагонистом АДФ-рецепторов тромбоцитов (IC5o=0,024 рМ) [17]. СХЬП
Примеры пиразолидин-3,5-дионов, обладающих различными фармакологическими активностями 4-Бутил-1 -(4-метилсульфонилфенил) -2-фенилпиразо лидин-3,5-дион (СХХХІХ) оказывает противовоспалительное действие, являясь селективным ингибитором циклооксигеназы-2 (1С5о=8,48 рМ) [146]. І-(І-Циклогексен) пи-разолидин-3,5-дионы (CXL) цитотоксичны в отношении различных культур опухолевых клеток (моноцитная лейкемия МНТ-1, карцинома легких А549, эпидермоидный рак кожи А431 и т.д.) [65].
Фенилбутазон (CXLI) и родственные ему структуры являются широко известными нестероидными противовоспалительными средствами [165]. Пи-разолидин-3,5-дионы (CXLII) (R!=Bu, Ben, Аг, 112=5-тетразолил, S02NH2) оказывают гипотензивное действие, являясь антагонистами ангиотензина II [59]. Было показано [83], что 4,4-диэтилпиразолидин-3,5-дионы (CXLIII) (R=H, ацил) являются цитотоксичными в отношении различных опухолей человека - лейкозов, остеосаркомы ТЕ418, кишечной аденокарциномы SW480, бронхо-генной миобластомы-9812 и др. В частности, активность против асцитной карциномы Эрлиха была на уровне 8 мг/кг/день (внутрибрюшинно, мыши). Пиразолидин-3,5-дионам также посвящены обзоры [72, 169].
Показано, что 1,3,4-оксадиазины (CXLIV-CXLVIII), в том числе их ок-сопроизводные (CXLV, CXLVII), обладают широким спектром фармакологической активности (рисунок 62) [144]. 2-(4-Урацилметилен)-4-бромфенил-6-гидрокси-2,3-дигидро-6Я-1,3,4-оксадиазин (CXLIV) (торговое название Оксадин) оказывает антибактериальное и противовирусное действие (в отношении вируса простого герпеса, HSV) [137]. К-[4-(2-Оксо(ЗЯ,6Я-1,3,4-оксадиазин-5-ил))гетарил]амиды (CXLV) (R!=H, Alk; R2=Het) могут быть использованы для лечения анемии [144]. Производные 3,6-дигидро-5-аминофенил-2Я-1,3,4-оксадиазин-2-она (R!=H, Alk; R2=Het, Аг) обладают кардиотонической активностью [144]. 5-Метил-6-фенилтетрагидро-1,3,4,-оксадиазин (CXLVI) является аноректиком и противовоспалительным агентом [79]. 2,4-Диарил-4Я-1,3,4-оксадиазин-5(6Я)-оны (CXLVII) также являются ингибиторами АМРА-рецепторов [144]. 2-Пиридил-4-метил-5,6,6-тризамещенные-5,6-дигидро-4Я-1,3,4-оксадиазины (CXLVIII) оказывают воздействие наЦНС [160, 161].
CXLVm 1,3,4-Тиадиазины (CIL-CLIV) и их оксопроизводные (CL, CLII, СЫН) также обладают весьма широким спектром биологической активности (рисунок 62). 2-(Трет-Бутиламино)-5,6-дифенил-6і7-1,3,4-тиадиазин (CIL) обладает антимикобактериальной активностью (МИК=12,5 мкг/мл для Mycobacterium tuberculosis) [144]. 5-(4-Гетариламинофенил)-2,3-дигидро-6#-1,3,4-тиадиазин-2-он (R1=H, Alkyl, R"=HetAr) (CL) оказывает кардиотоническое действие [149]. 2-Нитрозимино-3,6-дигидро-2//-1,3,4-тиадиазины (CLI) в концентрациях до 6,5 иМ обладают антиагрегационным действием [144]. Было показано, что 3-нитробензил-5-(3,4-диметоксифенил)-1,3,4-тиадиазин-2-он (CLII), являясь ингибитором фосфодиэстеразы IV, [144] может использоваться для лечения опухолей и синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД). 2-Оксо-1,3,4-тиадиазин (СЫН) также обладает кардиотонической активностью [144]. 6Я-1,3,4-Тиадиазин (CLIV) является весьма селективным ингибитором матричных металлопротеиназ [153].
Реакции N - фенилгидразидов ароматических тионокарбоновых кислот с малонилдихлоридами. Строение продуктов реакций
При проведении реакции N -фенилтиобензгидразида (1р) с малонилди хлоридами (Ха,.б) при-соотношении; 1:1: Bt среде3 кипящего бензола былишо лучены хлориды, 2-[(г)-1 (:Зї;5"-дифенил-1,3»4-тиадиазол-2(ЗЛ) илиден)метил(этил)]-3,5 дифенил-Г,3;4-тиадиазол-3 -ия; (XVa, б) с выходом
В отличие от моног и незамещенных малонилдихлоридов при кипяче-НИИЇ N -фенилтиобёнзгидразида в бензоле в течение 3-4 часов с 10% избытком щиметил- илшдиэтилмалонилдихлорида?(Хг, д) взаимодействие протекало в соотношении 1:1 ш были.; полученьь Г-тиобензоил-2-фенилпиразолидин-3,5-дионы (ХПд, е). Выходьисоставили 68-80%.
В спектрах ЯМЕ 1Ш полученных соединений» в СБЄІз присутствуют сигналы -протонов бензольных колец (5; 7.51-8.04 м. д.), протона метанового мостика»между 1?,3,4-тиадиазольными циклами (б 6.01 с, XVa)i и протоны метальной группы (552.481 с, XV6) с соотношением интегральных интенсивно-стей 20:1 и 20:3соответственно (таблица 17);
Спектры ЯМР С этих соединений характеризуются сигналами ядер углерода? бензольных колец (б 125;4-136:8? м. д.), тиадиазольных- циклов (б 162.9 - 172.1 м. д.), метинового мостика между 1 3,4-тиадиазольными циклами (б 79.26 - 83.88 м;д.); и метильной группы (XV6; 5 21.83 м.. д.) (таблица 18).
Гетероциклический скелет веществам (XVa) был однозначно установлен на основании данных рентгеноструктурного анализа. На рисунке 19 видно, что фрагмент, включающий оба тиадиазольных цикла с метановым мостиком и фенильные группы,в положениях 5 гетероциклов, почти планарен. Максимальные, значения двугранных углов в этом фрагменте достигают 5,9 град. Плоскости двух бензольных колец в положениях 3 тиадиазольных циклов повернуты на 76 и 45 градусов относительно плоскостей гетероциклов. Величины длин связей, валентных и торсионных углов представлены в таблицах 14-16 [14].
Строение полученных веществ также было подтверждено данными масс-спектрометрии. Рассчитанные молекулярные массы полностью совпали с экспериментально полученными (М+=525 и 539).
В ИК спектрах веществ (XV а, б) (таблетки КВг) (табл. 17) наиболее характеристическими являются область 2950 - 3100 см"1, где наблюдаются полосы поглощения, соответствующие валентным колебаниям связей С-Н бензольных колец (2970 - 3055 см"1), и область 1470-1550 см"1 , где присутствуют полосы поглощения, соответствующие валентным колебаниям связей C=N, С=С сопряженной системы.
В УФ спектрах соединений (XV а, б) в этанольном растворе (табл. 17) присутствуют четыре максимума поглощения, причем при замене атома водорода при метиновом мостике на метильную группу наблюдается бато-хромный сдвиг. Максимумы имеют значения длин волн 206.5, 248.5, 352.0, 433.0 и 207.5, 260.5, 362.0, 463.5 нм соответственно.
В ИК-спектрах веществ (ХПд, е) (таблетки КВг) (табл. 19) наиболее характеристической является область 1600 - 1800 см"1, где при 1790-1725 см"1 наблюдаются полосы поглощения, соответствующие валентным колебаниям связей С =0 и С =0 амидных карбонильных групп.
В УФ-спектрах соединений (XII д, е) в 96% этаноле (табл. 19) наблюдаются три полосы с максимумами поглощения при 205.0, 233.5, 328.0 нм и 208.0, 233.0, 329.5 нм. sseiassssssss
Взаимодействие S-метил-З-фенилдитиокарбазата (1т) с.моно-, ди ине-замещенными малонилдихлоридами (Ха-е): в среде кипящего бензола «во всех случаях приводит к образованию Г-метилсульфанилтиокарбонил-2-фенил-3,5-пиразолидиндионов (ХПж-м) (рисунок 21). Концентрации реагентов составляли 10-15%. В случае (Ха) они были уменьшены;до 3-5%, принимая во внимание склонность незамещенного малонилдихлорида к поликонденсации и, осмоленню, которые могли затруднить выделение и; очистку конечного продукта. Выходы составляли от 60%(ХПж) до 90%(Х11и, к).
В ЯМР Н-спектрах (таблица 19) пиразолидиндионов (ХПж-м) в- сильном поле присутствуют сигналы протонов, относящихся к алкильным заместителям в положении 4 (8 0.86-2112 м. д.), синглеты протонов MeSCS-группы (5 2.57-2.60 м. д.), и мультиплеты протонов фенильных заместителей при атомах N" и С (ХПм) (рисунок 22).
В спектрах ЯМР С характеристическими являются сигналы углеродов тиокарбонильных групп в очень слабом поле (8 195-205 м. д.) и карбониль-ных углеродов CJ и CJ (5 169-171 м. д.) (таблица 20). Н3СГ -NH ... О 80 С, 3...4Ч JSL /==0 YT + I — —НЗС-Y S Ph O XI S Ph IT Xa-e ХІІж-м Xa: R=R2=H; X6: R = H, R2=Me; Хв: RJ= H, R2=Bu; Xr: R=R2=Me; Хд: R!=R2=Et; Xe: R= H, R2=Ph. Рисунок 21 - Схема взаимодействия Б-метил-ЬГ-фенилдитиокарбазата с малонилдихлоридами В ИК-спектрах веществ (XII ж-м) (таблетки КВг) (табл. 19) наиболее характеристической является область 1600 - 1800 см"1, где при 1775-1730 см"1 наблюдаются полосы поглощения, соответствующие валентным колебаниям С =0 и С =0 амидных карбонильных групп.
Изучение влияния 2-бензилсульфанил-4-фенил-4і/-1,3,4-тиадиазин-5,6-диона и 1-тиобензоил-4,4-диэтилпиразолидин-3,5-диона на функциональную активность нейтрофилов крови крыс in vitro
Исследования проводили на кафедре микробиологии СПХФА, совместно, с доцентом, к. биол. Н;, Е. П. Ананьевой; Минимальные подавляющие концентрации (МЖК) определяли методом, серийных разведений» в: жидкой питательной среде -мясопептонном» бульоне (МПБ) или: среде Сабуро с последующим высевом на агаризованные среды. Исследуемые соединениям не растворяются в воде, поэтому в качестве растворителя ; использовали 20% водный раствор ДМСО, не подавляющий: рост ни одной из использованных» тест-культура В; концентрациях более 1000 мкг/мл. В; качестве тест-микроорганизмов были выбраны», грамположительные бактерии Staphylococcus aureus штамм Р209-И. грамотрицательные бактерии Escherichia coli АТСС 25922, а: также; дрожжи Candida albicans АТСС 885-653: Штаммы тест-организмов были, выбраны- в, соответствии с рекомендациями ЕФ ХІ [13]. Микробная; нагрузка составляла 1000 клеток/мл. Для; достижения? соответстующейі концентрации микробных клеток; готовили суспензию микроорганизмов-в физиологическом растворе в соответствии со стандартом мутности 10 ЕД (1= млрд., клеток/мл), затем через ряд последовательных разведений получали конечную концентрацию микробньгх клеток.. :
В ряд пробирок наливали по 1 мл МПБ или среды Сабуро, соответственно для бактерий и грибов. В первую пробирку вносили 1 мл раствора исследуемого соединения и проводили последовательные: разведения; в ряду пробирок, (перенося; по 1 мл из предыдущей в последующую), после чего в каждую пробирку ряда вносили по 0.1 мл микробной взвеси (10 клеток/мл),. пробирки культивировали при 37С для бактерий и при 24С для грибов 24 ч.
Из пробирки, где не наблюдали роста культуры (помутнения среды), делали высев в чашки Петри на мясопептонный агар (МПА) для стафилококка и кишечной палочки и на агаризованную среду Сабуро для С albicans. Чашки культивировали при 37С для бактерий и при 24С для грибов 24 ч.
Острую токсичность была исследована на? 300 белых нелинейных мышах-самцах массой 18-22 г, выращенных в питомнике Рапполово. Вещества вводили внутрибрюшинно в виде суспензии в физиологическом1 растворе (0,9% NaCl), стабилизированной твином-80. Контрольным животным вводили физиологический раствор с твином-80 в той же концентрации. Наблюдение за животными осуществляли в течение 72 часов. Расчет токсикометриче-ских показателей проводили по методу Миллера-Тейнтера.
Острую токсичность при пероральном (р.о.) введении исследуемых веществ крысам-самцам с массой тела 160-180 г оценивали на 40 крысах-самцах. Растворы и суспензии изучаемых соединений приготовляли на воде очищенной и вводили однократное помощью атравматического желудочного зонда. Гибель животных регистрировали в течение 14 дней от момента затравки. Токсикометрические показателю рассчитывали с помощью метода Миллера-Тейнтера. Опыты поставлены на 40 крысах-самцах, результаты отражены в таблице.
Исследование противовирусной активности Материалы и методы. Вирусы и клетки. Исследования проводились на первичной культуре клеток почек собаки (MDCK). Для оценки противовирусной активности препаратов использовали референс - вирус A(H3N2) А/Виктория/35/72. Данный штамм обладает достаточной гемагглю-тинирующей (1:128) и инфекционной активностью (6,5 lg ИД50/20мкл).
Изучение токсичности препаратов. Клетки MDCK сеяли в 96-луночные планшеты и культивировали при 37С в среде MEM с добавлением 10% сыворотки крупного рогатого скота до состояния монослоя. Из исследуемых препаратов готовили маточные растворы концентрации 10 мг/мл в диметилсульфоксиде, после чего готовили серию двукратных разведений препаратов в среде MEM от 500, до 1,92 мкг/мл. Растворённые препараты вносили в лунки планшетов и инкубировали 48 часов при 37С. Оценку степени повреждения клеточного монослоя проводили визуально.
На основании полученных данных определяли минимальную токсическую и рабочую дозу препаратов.
Оценка противовирусного действия препаратов. Определение противовирусной активности препаратов в отношении вируса гриппа А/Виктория/35/72 A(H3N2) проводили на клетках MDCK в 96-луночных планшетах для клеточных культур. Из исходной вируссодержащей алланто-иеной жидкости готовили серию десятикратных разведений от 10" до 10" и вносили в соответствующие лунки с клеточным монослоем. После часового контакта при 36-37 С в лунки добавляли препарат в рабочей концентрации. Результаты-учитывали через 48 часов по реакции гемагглютинации (ГА) со взвесью 0,5% куриных эритроцитов. Вирусингибирующее действие препарата оценивали по снижению титра вируса в опыте по сравнению с контролем.
Изучение влияния соединений (Шу) и (ХПг) на функциональную активность нейтрофилов крови крыс in vitro
Методика. К пробам крови крыс, взятой с антикоагулянтом ЭДТА дикалия, прибавляли 10% раствор желатина, приготовленный на фосфатно-солевом буфере с рН 7.4, и инкубировали в термостате при температуре 37"С в течение 1 часа. После инкубации слой плазмы-со значительным количеством лейкоцитов и лимфоцитов крови наслаивали в пробирках на систему фи-колл-гипак для разделения лейкоцитов и лимфоцитов в градиенте плотности и центрифугировали 40 минут при 2000 об/мин.
Интерфазу с содержащимися в ней лимфоцитами отделяли. Осадок лейкоцитов отмывали от незначительного количества эритроцитов и тромбоцитов с помощью 0.4% раствора аммония хлорида в физиологическом растворе с добавлением 25 ЕД гепарина. Осадки ресуспензировали в 5 мл физиологического раствора и исследовали. Цитохимические показатели лейкоцитов определяли с помощью рутинных методов, описанных в литературе [24].
Фосфатазная активность нейтрофилов (ФАН). Суспензию нейтрофилов крови крыс преинкубировали с растворами изучаемых соединений. Через 10 минут к пробам добавляли субстратную смесь. Перемешивали и инкубировали в термостате в течение 2 часов.
Пробы центрифугировали при 3000 об/мин 5 минут и осадки лизиро-вали 300 мкл чистого ДМСО с добавлением 20 мкл 10% гидроксида натрия. Измеряли абсорбцию проб при 570 нм на планшетном фотометре против контроля на реактивы (ДМСО и гидроксид натрия).
