Введение к работе
Актуальность темы. Витамины являются одними из важнейших биологически активных веществ. Физиологическая роль витаминов разнообразна. Большинство витаминов в результате биотрансформаций в организме человека переходят в форму коферментов – составных частей ферментов, участвующих в разнообразных биохимических реакциях организма человека.
Изменения физиологического состояния организма (повышенная психическая и физиологическая нагрузка, резкая смена климатических условий, периоды беременности, старение и др.), а также различные патологические состояния вызывают потребность одновременно в нескольких витаминах, вследствие чего возникают состояния полигиповитаминозов, которые усугубляются дефицитом некоторых аминокислот и ионов металлов. Подобного рода предпосылки явились основанием для создания ряда комплексных поливитаминных препаратов с микроэлементами и аминокислотами, которые используются как в профилактических, так и в лечебных целях. В настоящее время список поливитаминных препаратов дополняют биологически активные добавки (БАД) к пище, являющиеся источниками витаминов [Спиричев В.Б. и др., 2004 г.; В.И.Покровский, 2004 г.].
С каждым годом номенклатура поливитаминных препаратов (ПВП) увеличивается. Такое многообразие витаминных комплексов делает актуальным вопрос их стандартизации.
Для идентификации и количественного определения витаминов в ПВП и БАД к пище в нашей стране используются различные методы. Так наибольшее распространение получили титриметрические, спектрофотометрические, полярографические, флуориметрические, фотоэлектроколориметрические методы [ГФ XI, 1989 г.; ГФ XII, 2008 г.; British Pharmacopoeia, 2009 г.; European Pharmacopoeia 6.0, 2007 г.; The Japanese Pharmacopoeia 15, 2007 г.; United States Pharmacopeial 30, 2007 г.].
Подходы к определению водорастворимых витаминов в Государственной Фармакопее (ГФ) РФ, Британской Фармакопее (British Pharmacopoeia – BP), Европейской Фармакопее (European Pharmacopoeia – EP), Японской фармакопее (The Japanese Pharmacopoeia) и Фармакопее США (United States Pharmacopeial – USP) основаны на методах, направленных на исследование отдельного витамина, тогда как метод, позволяющий одновременно проанализировать несколько витаминов, встречается преимущественно в USP (высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) [United States Pharmacopeial 30, 2007г.].
На современном этапе развития подходов к анализу витаминов наиболее актуальным является вопрос о методе, позволяющем одновременно определить несколько витаминов, тем самым уменьшив затраты времени и средств. С этой целью наиболее часто помимо метода ВЭЖХ стали применять метод капиллярного электрофореза (КЭ). Метод КЭ основан на принципе разной скорости миграции заряженных частиц и молекул в постоянном электрическом поле и имеет ряд преимуществ по сравнению с ВЭЖХ: высокая эффективность разделения, экономичность и малый расход реактивов [Бёккер Ю., 2009г.].
Метод капиллярного электрофореза как фармакопейный метод анализа описан в BP 2009, EP 6.0, JP 15, USP 30. Общая фармакопейная статья (ОФС) «Капиллярный электрофорез» представлена для включения во 2-ой том ГФ XII.
Помимо ОФС, КЭ используется в ФС на глутатион (проводится анализ его чистоты методом капиллярного зонального электрофореза (КЗЭ), как один из вариантов анализа аминокислотного состава, в исследовании энантиомеров ропивакаина (КЗЭ), идентификации соматропина (КЗЭ), также широко КЭ применяется для составления трипсин-пептидных карт [British Pharmacopoeia, 2009 г.; European Pharmacopoeia 6.0, 2007 г.; The Japanese Pharmacopoeia 15, 2007 г.; United States Pharmacopeial 30, 2007 г.]. При помощи метода КЭ исследуют различные классы химических соединений, в том числе многие биологически активные соединения, включая витамины [Publication number 5990-3777 EN of Agilent Technologies Inc., 2009 г.].
Цель исследования
Разработать методику совместного качественного и количественного определения водорастворимых витаминов методом капиллярного электрофореза в витаминных ЛС и БАД к пище.
Задачи исследования:
изучить свойства и номенклатуру витаминных ЛС и БАД к пище, представленных на рынке РФ;
изучить существующие методы анализа водорастворимых витаминов;
подобрать условия электрофоретического разделения и количественного определения водорастворимых витаминов;
оптимизировать условия выделения водорастворимых витаминов из анализируемых объектов;
провести валидацию разработанной методики;
апробировать разработанную методику на витаминных ЛС и БАД к пище;
разработать проект фармакопейной статьи «Совместное определение водорастворимых витаминов методом мицеллярной электрокинетической хроматографии».
Научная новизна. Впервые разработана методика совместного определения водорастворимых витаминов в поливитаминных препаратах и БАД к пище методом капиллярного электрофореза.
Практическая значимость. Методика совместного определения водорастворимых витаминов методом мицеллярной электрокинетической хроматографии (МЭКХ) была использована для анализа состава витаминных комплексов, являющихся источниками водорастворимых витаминов, и витаминных и витаминно-минеральных премиксов, используемых в фармацевтической и пищевой промышленности. Разработанная методика успешно используется при гигиенической экспертизе образцов сырья для БАД к пище и БАД к пище, являющихся источником водорастворимых витаминов, в ФГБУ «НИИ питания» РАМН. Методика определения водорастворимых витаминов МЭКХ представлена в виде проекта фармакопейной статьи.
Апробация работы. Результаты исследований доложены на V Конференции молодых ученых России с международным участием: «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (г. Москва, 2008 г.), на XI, XII и XIII Всероссийском Конгрессе диетологов и нутрициологов «Питание и здоровье» (г. Москва, ноябрь-декабрь 2009 г., ноябрь-декабрь 2010 г., декабрь 2011 г.), на Всероссийской научно-методической конференции с международным участием «Пути и формы совершенствования фармацевтического образования. Создание новых физиологически активных веществ» (г. Воронеж, апрель 2010 г.), на XVIII Российском Национальном Конгрессе «ЧЕЛОВЕК И ЛЕКАРСТВО» (г. Москва, апрель 2011 г.), на научно-практической конференции «Аспирантские и докторские чтения: дерзания нового времени – поиск инноваций» (г. Москва, февраль 2012 г.).
Апробация работы проведена на межлабораторной конференции кафедры фармацевтической и токсикологической химии фармацевтического факультета ФГБУ ВПО Первый МГМУ им. И. М. Сеченова (11 апреля 2012 г.).
Личный вклад автора. Автору принадлежит ведущая роль в разработке методики, анализе и обобщении полученных результатов. В работах, выполненных в соавторстве, применялась методика, разработанная автором, проводилась аналитическая и статистическая обработка результатов. Вклад автора является определяющим и заключается в непосредственном участии на всех этапах исследования: от постановки задач, их экспериментально - теоретической реализации до обсуждения результатов в научных публикациях, докладах и внедрения в практику. Установлены научно обоснованные подходы к этапам исследования поливитаминных препаратов методом капиллярного электрофореза, разработан проект ФС.
Соответствие диссертации паспорту научной специальности. Научные положения диссертации соответствуют формуле специальности 14.04.02 – фармацевтическая химия, фармакогнозия. Результаты проведенного исследования соответствуют области исследования специальности, конкретно пунктам 2 и 3 паспорта специальности фармацевтическая химия, фармакогнозия.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ, в том числе 3 статьи в изданиях, рекомендуемых ВАК России.
Связь темы исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в рамках комплексной темы кафедры фармацевтической и токсикологической химии Первого МГМУ имени И.М. Сеченова «Разработка современных технологий подготовки специалистов с высшим медицинским и фармацевтическим образованием на основе достижений медико-биологических исследований». Номер государственной регистрации: 01.2.006 06352.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Методика идентификации и количественного определения водорастворимых витаминов методом мицеллярной электрокинетической хроматографии на коротком конце капилляра: тиамина, рибофлавина, никотиновой кислоты и никотинамида, пантотеновой кислоты, пиридоксина гидрохлорида, фолиевой кислоты, аскорбиновой кислоты, биотина в поливитаминных препаратах и БАД к пище - источника водорастворимых витаминов;
-
Проект фармакопейной статьи «Определение водорастворимых витаминов в поливитаминных препаратах методом мицеллярной электрокинетической хроматографии».
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 157 стр. машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, результатов исследования и их обсуждения, выводов, библиографического указателя, включающего 129 источника, и 5 приложений. Работа иллюстрирована 32 рисунками и 39 таблицами.
