Содержание к диссертации
Введение
Глава I Обзор литературы 10
1.1. История создания и общая характеристика фторхинолонов 10
1.2 Физико-химические свойства фторхинолонов 12
1.3 Использование химических и физических методов для идентификации и определения степени чистоты фторхинолонов 14
1.4 Использование физико-химических методов для количественого определения фторхинолонов в лекарственых формах 16
1.4.1 Применение хроматографическпх методов при оценке степени чистоты фторхинолонов 20
1.5 Использование ВЭЖХ для количественного определения ФХ в биологических жидкостях 22
1.6 Лекарственные формы, антибактериальная активность и применение фторхинолонов в медицинской практике 27
Глава 2 Разработка методик идентификации, количественного определения и оценки степени чистоты ципрофлоксацина гидрохлорида в субстанции и в лекарственных формах 33
2.1 Изучение возможности использования фотометрических и хроматографическпх методов для идентификации ципрофлоксацина гидрохлорида в лекарственных формах 33
2.1.1 Спектрофотометрический анализ ципрофлоксацина гидрохлорида 33
2.1.2 Изучение возможности использования ТСХ для идентификации ципрофлоксацина гидрохлорида 37
2.1.3 Выбор условий ВЭЖХ для качественного анализа ципрофлоксацина гидро хлорида 39
2.1.4 Разработка методики определения посторонних примесей хроматографическими методами 50
2.2 Разработка методик количественного определения ципрофлоксацина гидрохлорида в лекарственных формах 52
2.2.1 Использование УФ - спектрофотометрии для количественного определения ципрофлоксацина в лекарственных формах 52
2.2.2 Валидационная оценка методик количественного определения ципрофлоксацина гидрохлорида 54
2.2.3 Сравнительная оценка методик количественного определения ципрофлоксацина гидрохлорида 63
Глава III Обоснование состава и стандартизация лекарственной формы ципрофлоксацина гидрохлорида для инфузий 66
3.1 Получение раствора ципрофлоксацина гидрохлорида для инфузий 66
3.1.1 Обоснование способа стерилизации инфузионного раствора..66
3.1.2 Выбор оптимального состава раствора ципрофлоксацина гидрохлорида для инфузий 69
3.1.3 Определение времени растворения компонентов инфузионного раствора 72
3.1.4 Определение теоретической осмолярности раствора ципрофлоксацина гидрохлорида 73
3.2 Стандартизация инфузионного раствора ципрофлоксацина гидрохлорида 78
3.2.1 Описание 79
3.2.2 Подлинность 79
3.2.3 Прозрачность раствора и цветность 80
3.2.4 Потенциометрическое определение раствора (рН) 86
3.2.5 Механические включения и тяжёлые металлы 86
3.2.6 Номинальный объем 90
3.2.7 Бактериальные эндотоксины и пирогенность 90
3.2.8 Токсичность 93
3.2.9 Стерильность 93
3.2.10 Содержание гемолитически действующих веществ 96
3.2.11 Посторонние примеси 102
3.2.12 Количественное определение 102
3.2.13 Определение срока годности инфузионного раствора ципрофлоксацина гидрохлорида 0,2% 104
Глава IV Обоснование состава и стандартизация мази ципрофлоксацина гидрохлорида для наружного применения 107
4.1 Получение и обоснование состава мази ципрофлоксацина 0,5%, для наружного применения 107
4.1.1 Обоснование состава мази ципрофлоксацина 0,5% 107
4.1.2 Определение фармакокинетической активности мази методом in vitro 109
4.1.3 Изучение антимикробной активности 116
4.1.4 Исследование и сравнительная оценка антимикробной активности мази ципрофлоксацина гидрохлорида (безводного основания 0,5%), в сравнении с другими мазями содержащими антибиотики 123
4.2 Стандартизация мази ципрофлоксацина 0,5% 126
4.2.1 Описание 126
4.2.2 рН водного извлечения 126
4.2.3 Подлинность 127
4.2.4 Количественное определение мази ципрофлоксацина 0,5% 131
4.2.5 Микробиологическая чистота 135
4.2.6 Определение срока годности мази ципрофлоксацина гидрохлорида 0,5% 140
Общие выводы 144
Список литературы 146
- Физико-химические свойства фторхинолонов
- Разработка методик количественного определения ципрофлоксацина гидрохлорида в лекарственных формах
- Стандартизация инфузионного раствора ципрофлоксацина гидрохлорида
- Стандартизация мази ципрофлоксацина 0,5%
Введение к работе
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы: В современном арсенале антимикробных
химиотерапевтических средств важное место принадлежит синтетическим лекарственным препаратам фторхинолонового ряда. Чрезвычайно высокая активность и широкий спектр действия фторхинолонов поддерживают постоянный интерес к работам, имеющим своей целью модификацию структуры фторхинолонов или синтез новых хинолоновых производных, способных ингибировать ДНК-гиразу.
С 1983 года в Англии издаётся журнал Quinolones Bulletin, в котором постоянно публикуются результаты исследований только этой группы антимикробных средств.
В настоящее время более 30 производных фторхинолонов либо освоены промышленностью, либо находятся на одной из стадий клинических испытаний. Однако наиболее часто применяемым лекарственным препаратом является цинрофлоксацин, вошедший в число мировых "блокбастеров", объём продаж которого превысил сумму в 1 миллиард долларов.
При этом в литературе имеются данные, что у ципрофлоксацина наиболее эффективно выражена антибактериальная активность по отношению к грамположительным и грамотрицательным штаммам, чем у остальных фторхинолонов (норфлоксацина, перфлоксацина, ломефлоксацина, офлоксацина, дифлоксацина, флерофлоксацина, грепафлоксацина, гатифлоксацина, моксифлоксацина, клинафлоксацина, левофлоксацина, руфлоксацина, эноксацина, спарфлоксацина), а также бактерицидный характер действия, который более продолжительный, по сравнению с другими антимикробными препаратами. Выражено замедление бактериального роста при субингибирующих концентрациях, а также потенцирование фагоцитоза и внутриклеточного разрушения бактерий лейкоцитами человека.
Благодаря высокой антибактериальной активности ципрофлоксацин
выпускается за рубежом в виде различных лекарственных форм, таких как
растворы для инфузий 0,2%, таблетки, капсулы, капли для
офтальмологического применения О,
Д%-глазида-илДики,, однако в России т РОС НАЦИОНАЛЬНАЯГ
БИБЛИОТЕКА СПті OS
только в виде таблеток. Проведённый литературный поиск показал, что клиническому изучению ципрофлоксацина посвящено значительное количество работ, в то время как сведения о методах анализа крайне ограничены и не систематизированы.
Поэтому актуальным является создание новых лекарственных форм с ципрофлоксацином и их стандартизация.
Цель и задачи исследования. Разработка методик анализа лекарственных препаратов содержащих ципрофлоксацина гидрохлорид, их стандартизация, установление сроков хранения, оценка антимикробной эффективности, а также оптимизация состава раствора для инфузий и мази для обеспечения максимальной стабильности.
Для реализации поставленной цели необходимо решить следующие задачи:
Разработать методики идентификации, количественного определения ципрофлоксацина гидрохлорида и посторонних примесей в лекарственных формах для инфузий:
Разработать методику количественного определения ципрофлоксацина гидрохлорида! в мази, в присутствии консервантов и других вспомогательных веществ.
Изучить стабильность, ципрофлоксацина в лекарственных формах для инфузий и осуществить выбор эффективных стабилизаторов и буферных веществ для обеспечения стабильности растворов в полимерной и стеклянной упаковке.
Разработать методику определения гемолитически активных веществ и бактериальных эндотоксинов в растворе ципрофлоксацина гидрохлорида для инфузий.
Обосновать оптимальный состав мазевой основы для выбора композиции, обеспечивающей максимальную антимикробную активность и стабильность ципрофлоксацина гидрохлорида в мази.
Провести сравнительную оценку антимикробной активности новых лекарственных форм, в сравнении с прототипами.
5 Научная новизна. Изучено хроматографическое поведение ципрофлоксацина гидрохлорида методом ВЭЖХ на различных типах хроматографов. Проведён выбор оптимальных условий хроматографирования для работы в режимах микроколоночной и стандартной ВЭЖХ. Установлено, что для уменьшения ошибки определения целесообразно проводить одну аппроксимационную обработку хроматограммы.
В ходе изучения стабильности инфузионного раствора ципрофлоксацина гидрохлорида установлено, что определение цветности путём визуального сравнения с различными эталонами не отражает качества препарата. С этой целью впервые применено вычисление "условной площади" под спектральной кривой лекарственного препарата в видимой области спектра. Данная методика может широко применяться для оценки качества новых растворов для инфузий.
Выявлены факторы влияющие на течение реакции взаимодействия гемолитически активных веществ и эритроцитов крови. Установлено, что для выполнения данного определения требуется тщательная отмывка эритроцитарной массы, доведение реакционной смеси до нейтральной реакции и добавление буфера.
Практическая значимость. Впервые предложена лекарственная форма ципрофлоксацина гидрохлорида для инфузионного применения, мазь для наружного применения, разработаны способы идентификации, количественного определения действующих веществ и оценки степени чистоты, изучена стабильность, определены сроки годности в разных упаковках при различных значениях рН. Впервые изучено влияние упаковочных материалов, концентрации буферных растворов, рН, изотонирующих добавок на стабильность инфузионного раствора ципрофлоксацина гидрохлорида. Для стандартизации раствора ципрофлоксацина гидрохлорида использованы биологические методы анализа: определение бактериальных эндотоксинов и содержание гемолитически активных веществ в растворе лекарственного препарата, выпускаемого в пластиковой упаковке.
Изучена антимикробная активность мази с ципрофлоксацина гидрохлоридом.
Предложена унифицированная спектрофотометрическая методика определения цветности. Модифицирована методика определения препарата в лекарственных формах методом ВЭЖХ с использованием микроколоночных хроматографов. Получено положительное решение на выдачу патента на раствор ципрофлоксацина гидрохлорида для инфузий.
Внедрение результатов исследования в практику совместно с ЗАО "Рестер". г. Ижевск. Подготовлен проект ФСП на раствор ципрофлоксацина гидрохлорида для инфузий 0,2%, находящийся на регистрации в Министерстве здравоохранения РФ. Разработка состава проведена совместно с химико-фармацевтическим предприятием ЗАО Тестер" (г. Ижевск).
Апробация и публикация результатов исследования. Основные положения диссертационной работы докладывались и обсуждались на региональных конференциях по фармации, фармакологии и подготовке кадров (г. Пятигорск, 2001 - 2004 гг.).
По теме диссертации опубликовано три статьи в центральной печати и четыре публикации на региональном уровне.
Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно -исследовательских работ ПятГФА (номер государственной регистрации 01.20.0013407) в рамках проблемы "Фармация" секции № 38 Учёного совета МЗРФ.
Объём и структура диссертации. Работа изложена на 159 страницах машинописного текста, состоит из "Введения", "Обзора литературы" и 3-х глав собственных исследований, общих выводов, списка литературы и приложения. Работа проиллюстрирована 26 рисунками и 63 таблицами. Библиография имеет 156 наименований, из которых 105 на иностранных языках.
В первой главе диссертации обобщены данные литературы по способу получения и физико-химическим свойствам фторхинолонов, а также представлены сведения об их фармакологической активности. Описаны современные методики анализа лекарственных препаратов фторхинолонового ряда с использованием физико - химических методов, а также применение
7 хроматографических методов для количественного определения и оценки степени чистоты этих соединений.
Во второй главе приведены результаты исследований по разработке методик ВЭЖХ для качественного и количественного определения ципрофлоксацина гидрохлорида на различных типах хроматографов, методика определения посторонних примесей, а также проведена валидационная оценка разработанных методик.
Третья глава посвящена получению инфузионного раствора ципрофлоксацина гидрохлорида 0,2%, разработке методик анализа и его стандартизации. Изложены данные об установлении срока годности методом ускоренного хранения при 40С.
Четвёртая глава содержит результаты исследования по разработке новой лекарственной формы "Мазь ципрофлоксацина гидрохлорида 0,5%", обосновании её состава, разработке методик анализа и стандартизации. Положения, выдвигаемые на защиту:
Разработка методики идентификации и количественного определения ципрофлоксацина гидрохлорида и его посторонних примесей в лекарственных препаратах, методом ВЭЖХ.
Результаты исследований по оптимизации состава раствора и мази ципрофлоксацина гидрохлорида для инфузий.
3. Унифицированная методика определения гемолитической активности
инфузионных растворов в полимерной упаковке, основанная на тщательной
подготовке эритроцитарной массы, установление необходимого значения
рН реакционной смеси и её поддержании на всём протекании испытания.
4. Методика определения цветности растворов, основанная на определении
"условной площади под спектральной кривой".
5. Способ стабилизации раствора ципрофлоксацина гидрохлорида для
инфузий.
Физико-химические свойства фторхинолонов
Все фторхинолоны обладают амфотерными свойствами, которые обусловлены наличием карбоксильной группы в положении 3-хинолонового ядра и замещённым или незамещённым атомом азота пиперазинильной группы, и азота в хинолоновом цикле.
Константа диссоциации у карбоксильной группы связана с количеством атомов фтора, а константа диссоциации протонированного пиперази пильного азота - с наличием или отсутствием заместителя при этом атоме азота. Значение рК (константы ионизации) пиперазинильной группы составляет около 6,0 а карбоксильной группы около 8,0 [13, 14, 15].
Фторхинолоны не имеют чёткой температуры плавления. Большинство фторхинолонов плавятся при температуре около 200С, а ципрофлоксацин имеет температуру плавления от +306С до 308С [16, 17].
Авторами [18] проведены исследования по выделению кристаллической и амфотерной форм ципрофлоксацина гидрохлорида, которые изучены методами ИК - спектроскопии, дифференциального термического анализа, термогравиметрии и УФ спектрофотометрии. Установлено, что препарат из растворов может быть выделен в форме гидратов, которые наиболее стабильны, имеют максимальную растворимость в воде и наиболее высокую биодоступность.
Важным вопросом для практики является устойчивость фторхинолонов к воздействию света. Известно, что они имеют тенденцию распадаться при ультрафиолетовом облучении. Видимый свет на фторхинолоны оказывает негативное, хотя и менее выраженное действие [19].
Основания фторхинолонов мало растворимы в воде, в то время как его соли хорошо растворимы в воде, причём с повышением температуры, согласно правилу Вант - Гоффа и Хильдербрандта, растворимость увеличивается [20].
Кроме того, растворимость зависит от величины рН. В минеральных кислотах (рН=3), ципрофлоксацин значительно более растворим, чем нор-флоксацин, а при рН выше 6 наблюдается обратная картина [21, 22].
Таким образом, анализ литературных данных свидетельствует о том, что все известные препараты фторхинолонового ряда обладают амфотерны-ми свойствами, котороые обусловливают их физические и химические свойства.
Согласно НД на лекарственные формы, содержащие вещества фтор-хинолонового ряда, для идентификации используют физико-химические методы: УФ - и ИК - спектроскопию, ТСХ и ВЭЖХ [НД-42-11163-00, НД 42-6364-98, НД 42-2914-94, НД 42-3452-00, НД 42-3234-94].
Наличие у препаратов фторхинолонового ряда системы сопряжённых связей способствует интенсивному поглощению света в УФ области. Все вещества этой группы имеют максимумы светопоглощения в области 276-289 нм [17], что позволяет использовать для их идентификации фотометрические методы. Максимумы светопоглощения некоторых фторхииолонов с удельным показателем светопоглощения приведены в таблице 2.
При идентификации норфлоксацина Европейская и Британская фармакопеи рекомендуют использовать ИК - спектроскопию по сравнению со стандартным образцом [23, 24]. Фармакопея США 26 издания дополнительно применяет СФ - метод, применяя в качестве растворителя 0,1 М раствор натрия гидроксида. При этом максимум светопоглощения норфлоксацина находится при 273 нм [25].
Подлинность пефлоксацина устанавливают методами ИК - спектроскопии и ТСХ, в соответсвии с Европейской фармакопеей. Проявителем служит раствор бромкрезолового пурпурного в 50% спирте [24].
Для определения подлинности офлоксацина фармакопея Британии и США, а также Европейская фармакопея предлагают ИК - спектроскопию и УФ - спектрофотометрию растворов препаратов в 0,1 М растворе кислоты хлороводородной. Наличие асимметрических атомов углерода позволяет использовать для идентификации офлоксацина поляриметрический метод. При этом оптическое вращение 1% раствора офлоксацина в хлороформе должно быть в пределах от 1 до -1[23 - 25].
Для установления подлинности норфлоксацнна, используют хрома-тофлюориметрический метод, интенсивность флуоресценции определяют денсиометрически [26].
Для идентификации пефлоксацина в субстанции и таблетках используют спектрофотометрию в ультрафиолетовой области. Раствор препарата в 0,1 М растворе кислоты серной должен иметь максимум светопоглощения при 276 нм. Предел обнаружения составляет 1,2 мкг/мл. Данную методику можно использовать также для определения степени чистоты вещества, используя отношения максимумов оптических плотностей [17].
В ряде работ для идентификации фторхинолонов (ципрофлоксацина и норфлоксацнна) в лекарственных формах используют реакцию образования окрашенных комплексов с ионами тяжёлых металлов. Так, определение подлинности ципрофлоксацина и норфлоксацнна проводят на основе реакции с железа нитратом (III) в присутствии 1 % азотной кислоты. Продукт реакции окрашен в жёлтый цвет. Образующийся комплекс поглощает электромагнитное излучение с максимумом при 435 нм [27 - 29].
Разработка методик количественного определения ципрофлоксацина гидрохлорида в лекарственных формах
В производственных условиях при приготовлении раствора ципрофлоксацнна гидрохлорида, при постадийном контроле необходимы экспресс -методы количественного определения, позволяющие с достаточной точностью, воспроизводимостью и небольшой затратой времени определить основное действующее вещество. К таким методам относят УФ - спектрофото-метрию, который был использован нами как альтернативный.
Спектр поглощения ципрофлоксацнна гидрохлорида в УФ - области имеет три максимума, в качестве аналитической длины волны была выбрана 278 ±2 нм, так как интенсивность светопоглощения раствора в этой области наибольшая.
Методика количественного определения заключалась в следующем. 1мл раствора модельной смеси, (содержащей 0,2345 г (точная навеска) ципрофлоксацина гидрохлорида и 0,900 г натрия хлорида в 100 мл воды) переносили в мерную колбу вместимостью 500 мл и доводили объём колбы до метки 0,1 М раствором кислоты хлористоводородной, перемешивали. Оптическую плотность полученного раствора измеряли при 278 нм в кварцевых кюветах с толщиной слоя 1 см. В качестве раствора сравнения использовали 0,1 М раствор кислоты хлористоводородной. Параллельно в тех же условиях измеряли оптическую плотность раствора РСО ципрофлоксацина гидрохлорида.
Методика приготовления раствора РСО. Около 0,2 г ципрофлоксацина гидрохлорида (точная навеска), переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл, перемешивают в течение 10 минут до полного растворения и доводят объём раствора до метки 0,1 М раствором кислоты хлороводородной и далее поступают как указано выше.
Содержание ципрофлоксацина основания в растворе (%), в процентах вычисляли по формуле:
Аст - оптическая плотность раствора РСО; Ах- оптическая плотность анализируемого раствора; аст - навеска РСО ципрофлоксацина гидрохлорида, г; W- содержание воды в РСО ципрофлоксацина гидрохлорида, %; Ma - молярная масса ципрофлоксацина г.х. (367,85); М0 - молярная масса ципрофлоксацина основания (331,35). Результаты количественного определения ципрофлоксацина гидрохлорида представлены в таблице 9.
Разработанная методика хроматографического определения (раздел 2.1.) ципрофлоксацина гидрохлорида удобна тем, что позволяет одновременно проводить идентификацию, количественное определение и оценивать степень чистоты, поэтому она была подвергнута валидационной оценке в соответствии с требованиями предъявляемыми к анализу [139].
Валидация - это подтверждение обоснованности выбора метода определения показателей и норм качества фармацевтической продукции по каждому разделу НД. Валидация аналитического метода предполагает его оценку по следующим характеристикам: специфичность, линейность результатов, аналитическая область методики, правильность, воспроизводимость, предел обнаружения.
Линейная зависимость устанавливается на основании результатов испытаний, которые пропорциональны концентрации анализируемого вещества в образце в пределах аналитической методики.
Аналитическая область методики, в пределах которой соблюдается линейная зависимость, охватывает интервал между верхним и нижним пределами анализируемого вещества, в пределах которых данная методика обеспечивает его определение с требуемыми воспроизводимостью и точностью.
Правильность (точность) аналитического метода характеризует близость результатов испытаний, полученных данным методом, к истинному значению.
Воспроизводимость аналитического метода характеризует степень совпадения результатов индивидуальных испытаний при многократном его использовании. Она выражается величиной стандартного отклонения, коэффициентом вариации и доверительным интервалом.
Предел обнаружения выражается минимальным содержанием анализируемого вещества в образце, которое может быть обнаружено с помощью данной методики.
Предел количественного определения - это минимальное содержание анализируемого вещества, которое может быть количественно определено с приемлемой точностью и воспроизводимостью.
Стандартизация инфузионного раствора ципрофлоксацина гидрохлорида
Для стандартизации инфузионного раствора ципрофлоксацина гидрохлорида согласно ОСТ 42-91500.05.001 - 00 нами были выбраны следующие показатели: описание, подлинность, прозрачность, цветность, рН, механические включения, тяжёлые металлы, номинальный объём, бактериальные эндотоксины или пирогенность, токсичность, стерильность содержание гемо-литически действующих веществ, посторонние примеси, количественное определение и срок годности инфузионного раствора ципрофлоксацина гидрохлорида 0,2%.
Кроме того, при стандартизации препарата учитывали требования НД на аналогичные препараты импортного производства, такие как: ципролет 0,2% раствор для инфузий выпускаемый фирмой Доктор Реддис Лабораторне ЛТД (Индия) НД [42-1535-98], ципрофлоксацин 0,2% раствор для инфузий производимый фирмой Аквариус Энтерпрайзис (Индия) НД [42-11163-00], ципробид инфузия 100 мл выпускаемая фирмой Кадила (Индия) НД [42-2914-94], таблетки ципрофлоксацина 0,25 г, покрытые оболочкой изготавливаемые заводом "Мосхимфармпрепараты" имени Н. А. Семашко, ФС [42-2534-95], таблетки липроквин (ципрофлоксацин) по 0,25г и по 0,5 г, выпускаемые фирмой "Лайка Лабораториз Лтд" (Индия) НД [42-2082-92], субстанция ципрофлоксацина изготавливаемая фирмой Чемо Иберика С. А. (Испания) НД [42-3452-00] и фирмой Ауробиндо Фарма Лтд (Индия) НД [42-10852-00], ципрофлоксацина гидрохлорид 0,3%, глазные капли 5 мл производимые фирмой Промед Экспорте (Индия) НД [42-3466-94], ципролет, глазные капли 3 мг/мл, производимые фирмой Доктор Реддис Лабораторне Лтд, Индия НД [42-4194-00].
В дальнейших исследованиях мы использовали лекартсвенную форму для инфузий следующего состава::
Так как в качестве субстанции использовали ципрофлоксацина гидрохлорид, при приготовлении данной лекарственной формы исходили из того, что 2,0 г ципрофлоксацина (безводного основания) соответствует 2,345 г ципрофлоксацина гидрохлорида, при влажности 5%.
Прозрачный, бесцветный или светло-желтый раствор. Цветность раствора обусловлена свойствами субстанции ципрофлоксацина гидрохлорида, которая согласно НД 42-3452-00 представляет собой бело-кремовый кристаллический порошок.
Для идентификации аналогичных зарубежных препаратов используются методы УФ - спектроскопии и тонкослойной хроматографии. На основании этого нами был использован метод УФ - спектроскопии.
Методика. 1 мл препарата помещали в мерную колбу вместимостью 500 мл, доводили объём 0,1 М раствором кислоты хлористоводородной до метки и перемешивали. Спектр поглощения полученного раствора в области длин волн от 230 до 330 нм и при толщине слоя 1,0 см, был идентичен спектру поглощения раствора РСО ципрофлоксацина гидрохлорида.
Приготовление раствора РСО ципрофлоксацина гидрохлорида. Около 0,2345 г (точная навеска) ципрофлоксацина гидрохлорида (зарегистрированного в РФ) помещали в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяли, доводили объём до метки водой и перемешивали. 1 мл полученного раствора переносили в мерную колбу вместимостью 500 мл, доводили объем 0,1 М раствором кислоты хлористоводородной до метки и перемешивали.
В связи с тем, что раствор изотонирован натрия хлоридом проводили реакции подлинности на натрий и хлориды. 5 мл препарата давали положительную реакцию Б на натрий (ГФ XI, вып.1 с. 162). Такой же объём препарата давал положительную реакцию на хлориды (ГФ XI, вып.1 с. 165).
Поскольку в растворе содержится натрия хлорид, при обнаружении фосфатов проводили реакцию Б с хлоридом аммония, так как в реакции А при обнаружении используется нитрат серебра, который реагирует с хлорид ионом присутствующим в растворе. 10 мл препарата давали положительную реакцию Б на фосфаты. В реакциях обнаружения фосфатов также можно использовать реакцию В с молибдатом аммония, но в отличие от реакции Б на фосфаты она обладает меньшей чувствительностью (ГФ XI, вып.1 с. 164).
3 мл препарата выпаривали на кипящей водяной бане. Сухой остаток давал положительную реакцию Б на цитраты, так как в реакции А фосфаты мешают протеканию реакции образуя комплекс с хлоридом кальция (ГФ XI, вып.1 с. 165).
Стандартизация мази ципрофлоксацина 0,5%
Полученная на основе №6 мазь ципрофлоксацина гидрохлорида является новым лекарственным средством, поэтому были проведены исследования по разработке методик её анализа и стандартизации.
С этой целью в соответствии с ОСТ 91500.05.001-00 были выбраны следующие критерии - описание, подлинность, рН водного извлечения, количественное определение ципрофлоксацина гидрохлорида и микробиологическая чистота.
В результате анализа 6 серий мази, приготовленных в лабораторных условиях, сразу после изготовления и после нескольких лет хранения в естественных условиях и в условиях "ускоренного старения" при 40С установлено, что мазь представляет собой массу белого цвета с желтоватым оттенком без запаха. Желтоватый оттенок мази обусловлен присутствием в её составе эмульгатора.
Для установления рН водного извлечения растворяли 1 г мази в 10 мл воды при нагревании на водяной бане. Полученный раствор охлаждали до комнатной температуры и процеживали через 2 слоя марли, рН раствора определяли потенциометрически (ГФ XI, вып. 1, с. 113). При этом установлено, что во всех сериях мази рН водного извлечения находится в пределах 5,5 -6,0 (табл. 55).
Для идентификации мази ципрофлоксацина гидрохлорида 0,5% изучали влияние вспомогательных ингредиентов на спектр поглощения основного вещества - ципрофлоксацина гидрохлорида [154]. При этом установлено, что нипагин обладает собственным поглощением в УФ - области и имеет максимум при длине волны 256 нм, поэтому с достаточной степенью достоверности не позволяет идентифицировать ципрофлоксацина гидрохлорид при 278 нм.
Так как происходит наложение полос поглощения и сдвиг максимума светопоглощения ципрофлоксацина гидрохлорида в область 270±2 нм, использование метода непосредственной спектрофотометрии затруднено. Поэтому для идентификации ципрофлоксацина гидрохлорида в мази изучили возможность использования метода ВЭЖХ (см. раздел 2.3.1.).
Извлечение из мази готовили по методике: 4 г мази ципрофлоксацина гидрохлорида помещали в колбу вместимостью 100 мл, добавляли 40 мл ацетонитрила, интенсивно взбалтывали в течение 5-10 минут и фильтровали в мерную колбу вместимостью 100 мл. Осадок на фильтре декантировали ацетонитрилом порциями по 20 мл до общего объёма 100 мл, перемешивали. Параллельно проводили определение с раствором РСО ципрофлоксацина гидрохлорида и нипагина.
Для выбора волны детектирования проводили хроматографирование при 256 нм (максимум светопоглощения нипагина) и 278 нм (максимум све-топоглощения ципрофлоксацина гидрохлорида). Хроматографирование в одной точке невозможно, так как при этом получаются заниженные результаты одного из компонентов. Хроматограммы приведены на рисунках 22-23.
Из представленных рисунков следует, что при детектировании при длине волны 278 нм пик ципрофлоксацина гидрохлорида наиболее выраженный, а пик нипагина наоборот уменьшенный. А при детектировании при длине волны 256 нм наблюдается обратное действие. Этот факт свидетельствует о том, что детектирование мази ципрофлоксацина гидрохлорида 0,5% следует проводить при длинах волн 256 и 278 нм. В первом случае, чтобы с достаточной точностью определить нипагин, а во втором случае для наиболее достоверного определения количественного содержания ципрофлоксацина гидрохлорида в мази.
Методика приготовления раствора РСО. В мерную колбу вместимостью 100 мл помещали 0,4690 г ципрофлоксацина гидрохлорида и 0,1000 г нипагина. Объём доводили до метки водой и тщательно перемешивали.
Хроматографировали по 5 мкл раствора. Хроматограммы мази ципрофлоксацина гидрохлорида 0,5% и раствора РСО приведены на рисунках 24-25.
Из представленных рисунков следует, что время удерживания ципрофлоксацина гидрохлорида и нипагина в мази соответствуют времени удерживания раствора РСО ципрофлоксацина гидрохлорида и нипагина, соответственно.
