Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Характеристика флоры островов Соловецкого архипелага и прибрежной зоны 21
1.1 Физико–географическая и климатическая характеристика островов Соловецкого архипелага 21
1.2 Флористическая характеристика островов Соловецкого архипелага и прибрежной зоны 23
1.3 Ботанико–фармакогностическая характеристика перспективных для заготовки дикорастущих растений островов Соловецкого архипелага 27
1.4 Фитохимическая характеристика перспективных для заготовки дикорастущих растений островов Соловецкого архипелага 28
1.5 Применение в медицине перспективных для заготовки дикорастущих лекарственных растений островов Соловецкого архипелага 36
1.6 Влияние антропогенных факторов на флору островов Соловецких и прибрежной зоны 43
Выводы 46
Экспериментальная часть
Глава 2 Объекты и материалы исследования 47
2.1 Объекты и материалы исследования 47
2.2 Методы исследования 50
2.2.1 Методы ресурсоведческих исследований 50
2.2.2 Методы фармакогностических исследований 52
2.2.2.1 Морфологический и макроскопический анализ образцов исследуемых видов растительного сырья 52
2.2.2.2 Микроскопический анализ 52
2.2.3 Методы определения качества растительного
сырья 52
2.2.3.1 Определение числовых показателей 52
2.2.3.2 Качественное определение биологически активных веществ 53
2.2.3.3 Идентификация биологически активных веществ 53
2.2.3.4 Количественное определение биологически активных веществ 61
2.2.3.5 Определение загрязненности дикорастущего растительного сырья радионуклидами 69
2.2.4 Биологические исследования 69
2.2.4.1 Определение противовоспалительной активности 70
2.2.4.2 Определение ранозаживляющей активности 71
2.2.4.3 Определение антиагрегантной активности 72
2.2.4.4 Определение острой токсичности настоев исследуемых видов растительного сырья 73
2.2.4.5 Гистологические исследования 75
2.2.4.6 Определение гипогликемической
2.2.5 Микробиологические исследования 78
2.2.5.1 Определение микробиологической чистоты
2.2.5.2 Определение антимикробной активности...
2.2.6 Методы статистической обработки результатов исследований .
Глава 3 Ресурсоведческая характеристика и определение запасов некоторых видов дикорастущего растительного сырья островов Соловецкого архипелага
3.1 Экспедиционное обследование островов Соловецкого
Определение ресурсов исследуемых видов растительного сырья Оценка ресурсов выявленных зарослей исследуемых видов дикорастущих растений островов Соловецкого архипелага 3.4 Определение качества растительного сырья .
3.4.1 Определение числовых показателей исследуемых образцов дикорастущего лекарственного растительного сырья
3.4.2 Определение биологически активных веществ в исследуемых видах дикорастущего лекарственного растительного сырья
3.4.2.1 Качественное определение основных групп биологически активных веществ 3.4.2.2 Количественное определение основных групп биологически активных веществ 3.4.3 Определение микроэлементов и тяжелых металлов в исследуемых образцах дикорастущего лекарственного растительного сырья 3.4.4 Определение загрязненности исследуемого дикорастущего лекарственного растительного сырья радионуклидами .
3.4.5 Определение микробиологической чистоты дикорастущего лекарственного растительного сырья
Выводы .
Глава 4 Фармакогностическое изучение ложечной травы и водяники гермафродитной, произрастающих на островах
4.1 Ботанико–фармакогностический анализ исследуемых видов растительного сырья
4.1.1 Макроскопический анализ ложечной травы
4.1.2 Микроскопический анализ ложечницы лекарственной
4.1.3 Макроскопический анализ водяники гермафродитной .
4.1.4 Микроскопический анализ водяники гермафродитной .
4.2 Фитохимическое изучение воздушно–сухого сырья
ложечницы лекарственной и водяники гермафродитной
4.2.1 Определение числовых показателей .
4.2.2 Качественное определение биологически активных веществ ложечницы лекарственной и водяники гермафродитной
4.2.3.1 Идентификация кислоты аскорбиновой 137
4.2.3.2 Идентификация фенольных соединений 138
4.2.3.3 Идентификация алкалоидов в траве ложечницы лекарственной 140
4.2.3.4 Идентификация сапонинов в траве ложечницы лекарственной 142
4.2.3.5 Идентификация компонентов эфирного масла ложечницы лекарственной 143
4.2.4 Количественное определение основных групп биологически активных веществ в траве ложечницы лекарственной и побегах водяники гермафродитной 145
4.2.4.1 Количественное определение кислоты аскорбиновой в исследуемых видах растительного сырья 145
4.2.4.2 Количественное определение суммы свободных органических кислот в исследуемых видах растительного сырья 146
4.2.4.3 Количественное определение суммы флавоноидов в исследуемых видах растительного сырья 147
4.2.4.4 Количественное определение суммы фенолкарбоновых кислот в исследуемых видах растительного сырья 152
4.2.4.5 Количественное определение суммы гидроксикоричных кислот в исследуемых видах растительного сырья Количественное определение дубильных исследуемых видах растительного сырья
Количественное определение антоцианов в растительном сырье водяники гермафродитной Разработка методики и количественное определение суммы алкалоидов в исследуемом растительном сырье... Количественное определение пигментов в воздушно–сухом сырье ложечницы лекарственной Количественное определение сапонинов в воздушно–сухом сырье ложечницы лекарственной Количественное определение полисахаридов в исследуемых видах растительного сырья
4.2.4.12 Количественное определение эфирного воздушно–сухом сырье ложечницы лекарственной
Определение элементного состава исследуемых видов растительного сырья Определение загрязненности исследуемого растительного сырья радионуклидами Определение микробиологической чистоты исследуемого растительного сырья 183
4.2.4.16 Определение сроков годности исследуемых видов растительного сырья 183
Выводы 194
Глава 5 Идентификация и количественное определение калистегинов в дикорастущих растениях островов Соловецкого архипелага 196
5.1 Идентификация калистегинов в исследуемых образцах дикорастущего растительного сырья 197
5.1.1 Идентификация калистегинов методом капиллярного зонного электрофореза 197
5.1.2 Идентификация калистегинов методом тройной квадрупольной времяпролетной масс– спектроскопии (ГХ–МС/МС) 201
5.2 Количественное определение суммы алкалоидов, в исследуемых видах дикорастущего растительного сырья 207
Выводы 209
Глава 6 Совершенствование способов анализа лекарственного растительного сырья слоевищ ламинарии сахаристой, разработка методик экстракции и стандартизации отдельных химических компонентов растения .
Исследование возможности использования ламинарина для улучшения биофармацевтических характеристик лекарственных средств 210
6.1 Микроскопическое определение диагностических
признаков лекарственного растительного сырья слоевищ ламинарии сахаристой 210
6.2 Разработка технологии масляного концентрата суммы хлорофиллов из ламинарии сахаристой 6.2.1 Определение оптимальных условий экстракции суммы хлорофиллов из воздушно–сухого сырья ламинарии сахаристой 6.2.2 Получение масляного концентрата суммы хлорофиллов 6.3 Получение ламинарина и исследование его взаимодействия
с некоторыми лекарственными
веществами 6.3.1 Получение и идентификация ламинарина из
воздушно–сухого сырья ламинарии
сахаристой 6.3.2 Количественное определение полученного ламинарина
6.3.3 Исследование продуктов лекарственных Исследование взаимодействия ламинарина с некоторыми лекарственными веществами .
биодоступности взаимодействия веществ группы антиагрегантов с ламинарином в опытах
«in vitro» .
Исследование продуктов взаимодействия ламинарина с лекарственными еществами группы антиагрегантов методом ИК–спектроскопии Исследование продуктов взаимодействия ламинарина с лекарственными веществами группы антиагрегантов методом ЯМР Н1 спектроскопии 235
ВЫВОДЫ 242
Глава 7 Фармакологические исследования 243
7.1 Определение гипогликемической активности растений, содержащих калистегины 243
7.1.1 Исследование гипогликемической активности на модели перорального теста толерантности к глюкозе 245
7.1.2 Изучение влияния исследуемых видов растительного сырья на динамику липидного метаболизма экспериментальных животных с аллоксан–индуцированным сахарным диабетом 247
7.1.3 Определение динамики массы тела экспериментальных животных с аллоксан– индуцированным сахарным диабетом 249
7.2 Исследование антибактериальных свойств масляного концентрата суммы хлорофиллов из воздушно–сухого сырья ламинарии сахаристой 251
7.3 Изучение ранозаживляющей активности 0,25% масляного раствора суммы хлорофиллов из ламинарии сахаристой 253
7.4 Определение противовоспалительной активности продукта взаимодействия ламинарина и кислоты ацетилсалициловой на модели отека, индуцированного каолином 255
7.5 Исследование влияния продукта взаимодействия ламинарина и кислоты ацетилсалициловой на внутренние органы экспериментальных животных 257
7.6 Определение антиагрегантной активности продукта взаимодействия ламинарина и кислоты ацетилсалициловой 261
7.7 Предварительное исследование острой токсичности настоев травы ложечницы лекарственной и побегов водяники гермафродитной 263
Выводы 273
Заключение 276
Список сокращений 282
Список литературы
- Флористическая характеристика островов Соловецкого архипелага и прибрежной зоны
- Морфологический и макроскопический анализ образцов исследуемых видов растительного сырья
- Определение числовых показателей исследуемых образцов дикорастущего лекарственного растительного сырья
- Макроскопический анализ водяники гермафродитной
Введение к работе
Актуальность проблемы. Ассортимент лекарственного растительного сырья (ЛРС) в настоящее время значительно сузился за счет потерь ряда сырьевых источников. Одной из основных причин этого процесса явилось усиливающееся антропогенное воздействие на природу.
Вместе с тем, с каждым годом возрастает потребность в лекарственных препаратах растительного происхождения, обусловленная их относительной безопасностью и высокой эффективностью, возможностью рационального сочетания лекарственных растений в сборе и применения их в комплексе с синтетическими средствами, ценовая доступность и возможность длительного использования, поливалентность фармакологического действия биологически активных веществ (БАВ) растений и т.д. Все вышеперечисленное обусловливает необходимость расширения отечественной сырьевой базы за счет развития дополнительных растительных ресурсов и их комплексного использования.
В современных условиях перестройки фармацевтической службы в России особое значение приобретают региональные ресурсоведческие исследования, включающие решение теоретических и практических задач по эффективному освоению выявленных запасов ЛРС и разработке методологии охранных мероприятий.
Целесообразность изучения региональных ресурсов дикорастущих лекарственных растений (ДЛР) обусловлена задачами, сформулированными в «Стратегии национальной безопасности Российской Федерации до 2020 года», утвержденной Указом Президента РФ №573 от 12.05.2009, в которой отмечена необходимость формирования условий для преодоления сырьевой зависимости фармацевтической отрасли от зарубежных поставщиков.
Одним из экологически чистых регионов, практически никогда не подвергавшихся антропогенному воздействию, является Соловецкий архипелаг. В связи с этим, не вызывает сомнения актуальность проведения ресурсоведческих исследований на данной территории, с целью расширения сырьевой базы и
ассортимента экологически безопасных, обладающих низким порогом возникновения нежелательных эффектов и доступных для широких слоев населения лекарственных средств (ЛС).
Соблюдение требований бережного отношения к природным ресурсам Севера определяет необходимость разработки концепции рационального использования дикорастущего лекарственного растительного сырья (ДЛРС) Соловецких островов и прибрежной зоны, в которой расположены обширные плантации бурых водорослей, включая ламинари сахаристую Laminaria saccharina (L.) Lamour, семейство ламинариевые (Laminariaceae). Научный интерес к растени поддерживается в течение многих лет и обусловлен широким спектром БАВ, детерминирующим потенциал его фармакологической активности, что определяет актуальность дальнейшего изучения ламинарии сахаристой.
Расширение сырьевой базы, в свою очередь, обусловливает необходимость совершенствования контроля качества ЛРС. В соответствии с требованиями ОСТ 91500.05.001-00 «Стандарты качества лекарственных средств. Основные положения», некоторые нормативные документы (НД), в частности на ЛРС, нуждаются в уточнении показателей качества.
Степень разработанности темы исследования. Работа по исследованию флоры островов Соловецкого архипелага никогда не акцентировалась на изучении ДЛР как потенциально заготавливаемых. Не определен также химический состав растений, не включенных в Государственный реестр лекарственных средств, однако широко применяющихся в народной медицине северян.
Большое количество научных исследований посвящено изучени химического состава ламинарии сахаристой (Боголицын К.Г. (2012 г.), Облучинская Е. Д. (2004 г.) и др.), извлечению из водоросли БАВ (Коровкина Н.В. (2007 г.), Некрасова В.Б. (1999 г.) и др.), и определению их фармакологической активности (Беседнова Н.Н. (2000 г.), Меньшикова Е.А. (2005 г.) и др.). Тем не менее, научный интерес представляет получение нового эффективного лекарственного
средства из воздушно-сухого сырья на основе суммы хлорофиллов водоросли, отличающихся по составу от хлорофиллов растений наземной флоры.
Отсутствие сведений о взаимодействии ламинарина растворимого (ламинарии), полисахарида ламинарии сахаристой, образующего при высыхании его растворов структуры, сходные со структурой цикло декстринов, с фармакологически активными веществами определяет потребность изучения возможности влияния ламинарина на физико-химические свойства ЛС, что может способствовать улучшению их биофармацевтических характеристик.
Цель и задачи исследования. Целью данной работы явилась комплексная оценка ДЛРС травяно-кустарничкового яруса и прибрежной зоны островов Соловецкого архипелага, включащая ресурсоведческие и фитохимические исследования для разработки концепции рационального использования сырьевых ресурсов.
Для реализации поставленной цели следовало решить следующие задачи:
1. провести комплексную оценку ресурсно-сырьевого потенциала
дикорастущих растений (ДР) травяно-кустарничкового яруса флоры островов
Соловецкого архипелага, включающую исследование видового состава и
определение оптимальной номенклатуры лекарственных растений,
перспективных для заготовки;
2. изучить химический состав и фармакологическую активность некоторых ДР,
широко применяемых в народной медицине Севера;
3. разработать технологию масляного концентрата суммы хлорофиллов из
воздушно-сухого сырья - слоевищ ламинарии сахаристой, исследовать его
антибактериальные и ранозаживляющие свойства; подготовить изменения к
стандарту качества «Слоевища ламинарии - морская капуста» по разделу
«Микроскопия» с целью совершенствования контроля качества ЛРС;
4. исследовать возможность применения ламинарина для улучшения
биофармацевтических характеристик ЛС.
5. разработать концепцию рационального использования ДЛР травяно-кустарничкового яруса и прибрежной зоны Соловецких островов, с учетом сохранения и возобновления их природных запасов.
Научная новизна. Проведены комплексные ресурсоведческие и фитохимические исследования дикорастущего растительного сырья (ДРС) на территории островов Соловецкого архипелага, включающие определение его экологической безопасности.
Изучен химический состав ложечницы лекарственной (Cochlearia officinalis L.), капустные (Brassicaceae) и водяники гермафродитной (Empetrum hermaphroditum L.), вересковые {Ericaceae), произрастающих на исследуемой территории.
Впервые в шести растениях семейства вересковые: бруснике обыкновенной (Vaccinium vitis-idaea L.) (брусника), толокнянке обыкновенной (Arctostaphylos uvae-ursi L.) (толокнянка); багульнике болотном (Ledum palustre L.) (багульник); чернике обыкновенной (Vaccinium myrtillus L.) (черника), клюкве болотной (Oxycoccus palustris L.) (клюква) и водянике гермафродитной идентифицированы полигидроксилированные неэтерифицированные нортропановые алкалоиды -калистегины.
Установлено, что настой ложечницы лекарственной травы оказывает гипогликемическое действие. Подтверждены сведения о гипогликемической активности водяники гермафродитной. Выдвинута гипотеза о взаимосвязи сахароснижающих свойств исследуемых растений и присутствия в них калистегинов.
Сделано предположение о возможности взаимодействия ламинарина с ЛС, которое затем подтверждено на примере некоторых препаратов группы антиагрегантов (кислоты ацетилсалициловой (КАС), дипиридамола и тиклопидина) методами диализа через полупроницаемую мембрану, ПК- и ЯМР Н1 - спектроскопии. Определено, что ламинарии взаимодействует с данными ЛС с изменением их физико-химических и биофармацевтических свойств, что способствует улучшени биодоступности или пролонгировани их действия.
Теоретическая и практическая значимость. Теоретическая значимость.
Показано, что присутствие калистегинов в некоторых растениях семейства вересковые является одним из основных факторов, влиящих на их гипогликемические свойства.
Подтверждена гипотеза об улучшении биофармацевтических свойств некоторых ЛС, при их взаимодействии с ламинарином.
Разработана концепция рационального использования ДР островов Соловецкого архипелага, включающая не только аспекты использования ДЛРС с учетом сохранения и возобновления их природных запасов в условиях Севера, но и проведения исследований с целью расширения сырьевой базы и ассортимента экологически безопасных, обладающих низким порогом возникновения нежелательных эффектов, доступных для широких слоев населения новых эффективных лекарственных средств, и для преодоления сырьевой зависимости от зарубежных поставщиков.
Практическая значимость. Основные фрагменты работы выполнены по «Заказу» Соловецкого государственного историко-архитектурного и природного музея-заповедника в рамках программы изучения и сохранения флоры островов Соловецкого архипелага, и в соответствии с договором о совместном сотрудничестве с Северным государственным медицинским университетом (г. Архангельск). В соответствии с этим, для сотрудников отдела природы Соловецкого ботанического сада, занимающихся организацией работ по заготовке ДЛРС, с целью оптимизации процесса заготовки растительного сырья (PC) и проведению мониторинга растительных ресурсов на территории островов Соловецкого архипелага, составлены методические рекомендации по сбору и сушке ДЛРС и внедрены в работу отдела (акт внедрения от 25 июня 2013 г.).
Разработан способ получения масляного концентрата суммы хлорофиллов из воздушно-сухого ЛРС - слоевищ ламинарии сахаристой, обладающего антимикробными и ранозаживлящими свойствами, который может быть использован для приготовления наружных лекарственных форм (получен патент на изобретение №2500413 от 12.05.2011 г.).
Способ получения концентрата хлорофиллов из ламинарии сахаристой, адаптирован к условиям предприятия и внедрен в производственный цикл Архангельского опытного водорослевого комбината (акт внедрения от 20 июня 2013 г.).
Определены анатомо-диагностические признаки воздушно-сухого ЛРС -слоевищ ламинарии сахаристой, позволящие более точно идентифицировать данный вид сырья, на основе чего разработаны «Изменения» к фармакопейной статье (ФС) 83 Государственной фармакопеи Соза Советских Социалистических Республик XI изд. (ГФ XI) «Слоевища ламинарии - морская капуста» «Thalli Laminariae» и внедрены в работу контрольно-аналитической лаборатории отдела контроля качества ЗАО «ВИФИТЕХ» (г. Оболенск, Московская область) (акт внедрения от 11 марта 2014 г.).
Разработаны проекты ФС на ЛРС - «Ложечницы лекарственной траву» (Cochleariae officinalis herba) и «Водяники гермафродитной побеги» (Empetrum hermaphroditi cormus), обладающее гипогликемическими свойствами. Получены акты апробации методик идентификации и количественного определения основной группы фармакологически активных соединений, алкалоидов, в предлагаемых видах ЛРС «Испытательной контрольно-аналитической лаборатории ГБУЗ Архангельской области «Бюро судебно-медицинской экспертизы»» (акты апробации от 25 октября 2013 г.).
«Методические рекомендации по рациональной заготовке дикорастущего лекарственного растительного сырья во время практики по фармакогнозии на островах Соловецкого архипелага» (для студентов III курса очного отделения факультета фармации и медицинской биологии) внедрены в учебный процесс кафедры фармации и фармакологии ГБОУ ВПО «Северный государственный медицинский университет (г. Архангельск)» МЗ РФ (акт внедрения от 09 декабря 2013 г.).
Методология и методы исследования. Основой методологии исследования являлось соблюдение системного и комплексного подходов; научные труды
отечественных и зарубежных ученых по теме исследования; законодательные и НД МЗ РФ.
В работе были использованы критический и логико-семантический анализ, статистические, ресурсоведческие, химические, физико-химические и фармакологические методы.
оложения, выносимые на защиту:
рекомендации по рациональному использовани растительных ресурсов островов Соловецкого архипелага;
результаты идентификации и количественного определения калистегинов в растениях семейства вересковые;
результаты исследования химического состава ложечницы лекарственной травы, фармакологической активности сырья и материалы по разработке проекта ФС «Ложечницы лекарственной трава» (Cochleariae officinalis herba);
результаты исследования химического состава водяники гермафродитной побегов и материалы по разработке проекта ФС «Водяники гермафродитной побеги» (Empetrum hermaphroditi cormus);
результаты определения гипогликемического действия некоторых растений семейства вересковые, содержащих калистегины.
результаты исследования влияния ламинарина на физико-химические свойства и биофармацевтические характеристики некоторых ЛС группы антиагрегантов;
результаты получения масляного концентрата суммы хлорофиллов из воздушно-сухого сырья ламинарии сахаристой и определения его противомикробной и ранозаживлящей активности;
- материалы по внесению изменений в ФС «Слоевища ламинарии - морская
капуста» «Thalli Laminariae» (раздел «Микроскопия»).
Степень достоверности и апробация результатов. Результаты и основные положения диссертационной работы доложены на ежегодных научно-практических конференциях и конференциях молодых ученых и студентов СГМУ (2005-2012 гг.); XIII Международном конгрессе «Здоровье и образование в XXI
веке»; международной конференции в университете г. Тромсе (Норвегия) 29.10.2012-02.11.12; симпозиуме к билею профессора Н.Н. Алеутского (СГМУ, 15.05.2011); международной конференции, посвященной развити методологии преподавания фармакогнозии в университетах Тромсе (Норвегия) - Умео (Швеция) - СГМУ (Архангельск) (Соловки, 16.06.2013-18.06.2013); Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы педагогических и психологических наук» («Использование региональных природных и культурных ценностей при проведении практики по фармакогнозии»), Новосибирск, 2012 г.; на IV съезде фармакологов России «Инновации в современной фармакологии. Поиск и разработка новых лекарственных средств. Нанотехнологии в фармакологии» (Казань, 18.09-21.09.2012); конференции, посвященной 10-летнему билею факультета фармации и медицинской биологии СГМУ (Архангельск, 21.12.2010); научно-практической конференции «Актуальные вопросы изучения, сохранения и использования природной среды и историко-культурных памятников Соловецкого архипелага» (02.09.12-07.09.12); научно-практической конференции ученых и студентов с дистанционным участием: «Использование региональных природных и культурных ценностей при проведении практики по фармакогнозии (07.08.2012).
По материалам проведенных исследований опубликовано 39 печатных работ, из них 14 в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК, получен 1 патент на изобретение. Часть материалов диссертации оформлена в виде монографии «Cochlearia Соловецких островов (фитохимический анализ и определение фармакологической активности)» и главы в монографии «Нутриентное поведение человека».
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 314 страницах текста компьютерного набора и состоит из обзора литературы, 6 глав собственных исследований, заключения, списка литературы, включающего 301 источник, в том числе 116 иностранных, содержит 90 рисунков, 66 таблиц и 15 приложений.
Флористическая характеристика островов Соловецкого архипелага и прибрежной зоны
Соловецкий архипелаг расположен в устье Онежского залива Белого моря между параллелями 6457 и 6512 северной широты и меридианами 3530 и 3617 восточной долготы и отделен от материка проливом Западная Соловецкая Салма.
Соловецкий архипелаг образуют свыше 100 островов и островков. Среди них выделяются шесть больших островов: Большой Соловецкий площадью 225,28 км2, Анзер - 48,51 км2, Большая Муксалма - 19,91 км2 и Малая Муксалма - 1,54 км2, Большой Заяцкий 1,38 км2 и Малый Заяцкий - 1,24 км2. Общая площадь архипелага составляет 300 км2 [147].
Рельеф островов сильнопересеченный, представлен двумя типами: холмисто-моренным, образованным аккумулятивной деятельностью ледника в период его таяния, и рельефом морских террас. Самая высокая точка архипелага - гора Вербокольская - 86,2 м [130].
Климат Соловецких островов умеренно теплый, избыточно влажный. Относительная влажность воздуха в среднем за год составляет 82% (187 дней с относительной влажностью более 80% в году). Пасмурных дней по общей облачности - 175; ясных - 23 в году. Средняя годовая температура 0,9 С. Самый холодный месяц - февраль (-10 С), самый теплый - июль (+12,9 С до 31 С (абсолютный максимум)).
Холодный период (менее 0 С) длится 175 дней. Переход средней суточной температуры воздуха через 0 С в сторону понижения происходит в начале первой декады ноября, в сторону повышения - в середине третьей декады апреля.
Устойчивые морозы наблюдаются в течение 132 дней. Снежный покров залегает в течение 183 дней. Появляется он в начале третьей декады октября. Устойчивый снежный покров образуется в середине ноября. В течение зимы высота снега увеличивается и в марте достигает 60 см. Разрушение устойчивого снежного покрова происходит в начале первой декады мая, окончательный сход -в конце первой декады мая. За холодный период выпадает 186 мм или 34% годового количества осадков [179].
Теплый период (выше 0 С) длится 190 дней. Вегетационный период (выше 5С), в течение которого создаются благоприятные условия для роста и развития растений, составляет 128 дней. Начинается он в середине третьей декады мая, а заканчивается в начале первой декады октября. Лето (выше 10 С) продолжается 74 дня, начинается в конце второй декады июня, заканчивается в начале первой декады сентября. За теплый период выпадает 361 мм осадков, что составляет 66% от годового количества [147].
В почвенном покрове Соловецкого архипелага преобладают альфегумусовые подзолы различные по мощности, по степени оглеения и болотные почвы олиготрофного типа.
Болотные почвы представлены торфяно-глееземами и торфяными почвами. Почвы характеризуются кислой реакцией, малой степенью насыщения основаниями, и обеднены элементами питания - фосфором и калием. Почвы подзолистого типа, занимают 76,0% лесной площади островов [48, 89].
Почти половину нелесных земель занимают болота — их 4134,4 га или 14,6% общей площади островов (верховые болота — 76,4%, площадь переходных болот составляет 23,0%; низинных — 0,6%) [146, 147].
Несмотря на многочисленные исследования, побережье Белого моря остается недостаточно изученным районом. Существуют лишь общие сведения о флоре приморской растительности [45].
Соловецкие острова издавна привлекали внимание ученых-флористов. Первые гербарные коллекции растений островов датированы 1880-1882 гг. Наиболее полные сведения о флоре Соловков были собраны во втором томе книги «Флора северо-востока европейской части СССР», в котором отмечены особенности произрастания некоторых видов растений, однако многие конкретные данные, по свидетельству сотрудников Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, были опущены [172].
Растительный покров островов Соловецкого архипелага неоднороден (рис.1.2) [75,180]. Зональными биоценозами для Соловецких островов являются притундровые леса и лесотундровые криволесья [82]. Лесной растительностью естественного происхождения покрыто 19004,5 га (67,1%) общей площади островов [14, 124]. Лесов, созданных человеком (лесные культуры) всего 158 га (0,6%). К непокрытым лесом землям, отнесены естественные редины, представленные березовыми криволесьями на морском побережье. Их площадь составляет 86,0 га (0,3%) [74]. Для естественных безлесных участков характерны пустоши - низкотравные сообщества с несомкнувшимся надпочвенным покровом [73]. В приливно-отливной зоне - приморские луга [131].
Флора сосудистых растений островов Соловецкого архипелага включает более 550 видов, входящих в состав 369 родов из 75 семейств [111, 153], из них 30 видов являются лекарственными растениями [36, 161].
В Соловецком ботаническом саду и на подворьях, в объемах, достаточных для индивидуального использования, культивируется 5 видов лекарственных растений: бадан толстолистный, валериана лекарственная, горец змеиный, чемерица Лобеля, черемуха обыкновенная.
Ноготки лекарственные высевают как декоративное растение. ДЛР Соловецких островов условно можно разделить на 4 группы: — редко встречающиеся - 4 вида: ольха серая, подорожник большой, сушеница топяная, тмин; — обычные для флоры островов растения, не образующие зарослей -9 видов: мать-и-мачеха, одуванчик лекарственный, зверобой продырявленный, клевер луговой, пижма обыкновенная, родиола розовая, сабельник болотный, тысячелистник обыкновенный, хвощ полевой; — сорные, не образующие зарослей - 3 вида: горец птичий, крапива двудомная, пастушья сумка обыкновенная; — к широко распространенным видам официнального ЛРС травяно-кустарничкового яруса островов Соловецкого архипелага можно отнести 5 видов: багульник, толокнянку, бруснику, чернику и можжевельник обыкновенный (Juniperus communis L.) семейство кипарисовые (Cupressaceae) (можжевельник) [111].
Морфологический и макроскопический анализ образцов исследуемых видов растительного сырья
В качестве стандартных образцов (СО) использовали авикулярин (Fluka, 572-30-5), гиперозид (Sigma-Aldrich, 482-36-0), декстрозу 64/228/53 (Фармангро РПП, Россия), изокверцитрина (Fluka, 482-35-9), кверцетин (Sigma-Aldrich, 117-39-5), кверцитрин (Fluka, 522-12-3), кемпферол (Sigma-Aldrich, 520-18-3), кохлеарин (Trading chem., 52418-07-2), ламинарии (Sigma-Aldrich, L-9634), лютеолин (Sigma-Aldrich, 491-70-3), мирицетин (Sigma-Aldrich, 529-44-2), псевдотропин (Simagchem. Corp. 135-97-7), рутин (Sigma-Aldrich, 207671-50-9), тропин (Sigma- Aldrich, T89400), тропинон (Sigma- Aldrich T89605).
Экспедиционное обследование и ресурсоведческие исследования на территории островов Соловецкого архипелага проводились в течение летних периодов 2009-2011 гг, силами преподавателей и студентов факультета фармации и фармакологии Северного государственного медицинского университета. Исследования, в основном, проводились во время практики студентов по фармакогнозии при активном участии и помощи сотрудников отдела природа -Ботанический сад Соловецкого музея-заповедника - Гришановой О.В. и Новинской Т.А. В ходе проведенных исследований были изучены видовой состав, установлены места произрастания и определены сырьевые запасы ДРС [161,157,159,160,167,183].
Определение запасов багульника, брусники, черники, толокнянки и водяники гермафродитной, имеющих четкую эколого-ценотическую приуроченность, проводили на ключевых участках.
На объекте закладывали учетные площадки размером 11 м, с таким расчетом, чтобы учетная площадь составляла не менее 2% общей площади заросли.
Если на исследуемом участке экземпляры изучаемого растения были распределены равномерно, учетные площадки закладывали равномерно по всей площади заросли методом "конверта". Если растения исследуемого вида занимали менее половины площади сообщества, и были расположены отдельными куртинами, площадки размещали в пределах куртин [21].
Плотность запаса сырья багульника, брусники, черники, толокнянки и водяники гермафродитной устанавливали методом пересчета по проективному покрытию [134,148].
Определение запасов сырья можжевельника и ложечной травы проводили на конкретных зарослях.
Урожайность плодов можжевельника определяли методом модельных экземпляров. Среднюю массу одного плода определяли взвешиванием свежесобранных 100 плодов в шестикратной повторности. При расчете на сухой вес использовали коэффициент усушки.
Урожайность рассчитывали как произведение численности экземпляров на пробных площадках и массы сырья с одного экземпляра (можжевельник) или как массы сырья с 1% проективного покрытия (брусника, черника, толокнянка и водяника гермафродитная).
Биологический запас сырья вычисляли как произведение средней урожайности сырья на общую площадь заросли по верхнему пределу урожайности. Под биологическим запасом понимали все количество сырья, которое можно заготовить на площади участка.
Расчет величины эксплуатационного запаса проводили по нижнему пределу урожайности. Возможный ежегодный объем заготовок сырья определяли делением эксплуатационного запаса на оборот заготовки, учитывая сроки восстановления запасов сырья для каждого вида растений [78].
Морфологическое строение образцов исследуемых видов PC изучали на свежем материале при проведении полевых работ. Макроскопический анализ образцов сырья, для которых разрабатывалась нормативная документация, проводился по методикам ГФ XI [34,35]. Для проведения микроскопического анализа исследуемые препараты готовили в соответствии с указаниями статьи «Техника микроскопического и микрохимического исследования лекарственного растительного сырья» по методике приготовления микропрепаратов цельного сырья и порошка [34]. Для получения объективных результатов анализировали растения из разных мест произрастания. В качестве включающей жидкости использовали раствор хлоралгидрата.
Определение числовых показателей исследуемых образцов дикорастущего лекарственного растительного сырья
Идентификацию флавоноидов проводили методом одномерной хроматографии в тонком слое сорбента (ТСХ). С этой целью воздушно–сухое сырье измельчали и просеивали через лабораторные сита с размером отверстий 1 мм. В качестве экстрагента использовали спирт этиловый (спирт) 70%.
Точную навеску сырья (около 1,0 г) помещали в кругло донную колбу термостойкого стекла со шлифом, прибавляли 10 мл спирта, колбу присоединяли к обратному холодильнику и помещали на кипящую водяную баню. Нагревание проводили в течение 45 мин.
Полученное спиртовое извлечение охлаждали, фильтровали через бумажный фильтр «синяя лента» и упаривали до объема примерно 0,5 мл.
С целью подбора системы растворителей для оптимального разделения компонентов извлечения использовали следующие смеси: хлороформ-спирт-вода (26:14:3) [3]; н-бутанол-кислота уксусная-вода (БУВ) (4:1:5); БУВ (4:1:2) [85]; БУВ (5:1:1) [49].
Полученное извлечение (10 мкл), и по 10 мкл 1% растворов стандартных образцов (СО): рутина, кверцетина, кемпферола, кверцитрина, изокверцитрина, гиперозида, мирицетина, авикулярина и лютеолина наносили на линию старта хроматографической пластинки, которую затем помещали в хроматографическую камеру, предварительно насыщенную парами элюента в течение 6 часов. Высушенную на воздухе хроматограмму просматривали в видимом и ультрафиолетовом свете при длине волны 254 нм до и после обработки хроматограмм 5% спиртовым раствором алюминия хлорида [171].
Подтверждение качественного состава фенольных соединений травы ложечницы лекарственной осуществляли методом обращенно-фазовой распределительной хроматографии [23].
В качестве неподвижной фазы использовали фазу «Luna С-18» с содержанием углерода около 16%. Элюирование проводили в градиентном режиме. Элюент А -ацетонитрил, элюент В - раствор 2%-ной муравьиной кислоты. Содержание ацетонитрила увеличивалось от 20 до 60% за 40 мин при расходе подвижной фазы 1 мл/мин. Детектирование осуществляли при 280, 320 и 365 нм.
Для получения извлечения около 10,0 г PC помещали в колбу вместимостью 250 мл, прибавляли 70 мл спирта, присоединяли к обратному холодильнику и нагревали на кипящей водяной бане в течение 1 ч с момента закипания спиртоводной смеси в колбе. После охлаждения смесь фильтровали через бумажный фильтр в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводили спиртом до метки (исследуемый раствор). Параллельно готовили серию 0,05% растворов сравнения в спирте: рутина, гиперозида, гесперидина, кверцетина, лютеолина, кемпферола, галловой, кофейной, хлорогеновой, феруловой кислот, кумарина и танина.
По 20 мкл исследуемого раствора и растворов сравнения вводили в хроматограф и хроматографировали по приведенной выше методике. Идентификацию проводили посредством регистрации времен удерживания компонентов исследуемого раствора и растворов сравнения.
Алкалоиды идентифицировали методом ТСХ [205]. С этой целью сырье измельчали и просеивали через лабораторные сита с размером отверстий 1 мм.
К 3,0 г (точная масса) измельченного сырья прибавляли спирт 80% в соотношении экстрагент-сырье 1:3 г/мл. Фильтровали. Операцию проводили трижды. Объединенные спиртовые извлечения упаривали под вакуумом до объема 5 мл и подкисляли до рН 3-4 2% раствором кислоты винной. Водное извлечение экстрагировали, последовательно петролейным эфиром и этилацетатом, прибавляя растворители в количестве 3 мл.
Органические извлечения, содержащие липиды и хлорофилл, отбрасывали, рН водного остатка доводили до значения рН=10 с помощью 10% раствора аммония гидроксида и добавляли 10 мл смеси хлороформ - спирт изопропиловый в соотношении 3:1. Органический слой отделяли и упаривали под вакуумом. Остаток растворяли в 1,0 мл воды. Полученное извлечение и 2 мМоль/л растворы СО: кохлеарина [256], тропина, псевдотропина, тропинона и их модельной смеси наносили на хроматографическую пластинку. Хроматографировали в системе растворителей хлороформ - спирт 96% - 10% раствор аммиака (44:10:1) [24].
В качестве проявителя использовали реактив Драгендорфа в модификации Мунье [205].
Для идентификации калистегинов использовали методы капиллярного зонного электрофореза (КЗЭ) [295] и хромато-масс-спектроскопии (ГХ-МС) [265]. С целью идентификации калистегинов методом КЗЭ к 1 г измельченного сырья до размера частиц 1 мм добавляли спирт 50% в соотношении 1:10, гомогенизировали и оставляли в укупоренной колбе с пришлифованной крышечкой на 24 часа при комнатной температуре. Через сутки смесь фильтровали через бумажный складчатый фильтр и центрифугировали на лабораторной центрифуге со скоростью вращения 3000 об/мин в течение 10 мин. Супернантат пропускали через ионообменную колонку, заполненную Amberlite IR-120 в Н+-форме. Колонку промывали водой очищенной до нейтральной реакции. Калистегины элюировали, дважды пропуская через колонку по 10 мл 0,5 Моль/л раствора аммония гидроксида и воды. Полученный элюат пропускали через ионообменную колонку, заполненную Dowex 1-Х2 в ОН - форме [226]. Элюирование проводили 10 мл воды. Элюат упаривали и лиофилизировали.
Для идентификации калистегинов 0,05 г лиофилизата растворяли в 10 мл спирте 50%. Детектирование проводили при длине волны 191 нм; температуре 50С и напряжении 25 кВ. Режим ввода пробы: 50 мБар в течение 5 секунд.
Перед использованием капилляр промывали 0,5 М раствором кислоты хлористоводородной в течение 20 мин, водой в течение 10 мин и 0,5 М раствором натрия гидроксида в течение 20 мин, затем снова водой очищенной 10 мин.
Макроскопический анализ водяники гермафродитной
Определение микроэлементов-биофилов (марганца цинка и меди), тяжелых металлов, ртути и мышьяка в исследуемых видах ДЛРС островов Соловецкого архипелага проводили в соответствии с методиками, изложенными в гл. 2. Полученные результаты и допустимые пределы содержания исследуемых элементов представлены в табл. 3.21. В ходе проведенных исследований установлено, что максимальное количество тяжелых металлов обнаружено в листьях брусники. По сравнению с другими изучаемыми объектами, в данном виде ЛРС определено максимальное накопление кадмия, кобальта, железа и ртути. Вместе с тем, содержание кадмия в листьях брусники при этом меньше в 10 раз среднего содержания элемента в растениях по Архангельской области; кобальта - более чем в 8 раз. Содержание железа превышает среднее значение в 1,4 раза. Тем не менее, ни один из проанализированных образцов не содержит примеси тяжелых металлов в количествах, превышающих допустимые нормы.
Определение загрязненности исследуемого дикорастущего лекарственного растительного сырья радионуклидами Согласно Постановлению Правительства РФ от 20.06.2011 г. N 597 "О перечне эксплуатирующих организаций, на которые распространяется действие Федерального закона "Устав о дисциплине работников организаций, эксплуатирующих особо радиационно-опасные и ядерно-опасные производства и объекты в области использования атомной энергии", об изменении и признании утратившими силу некоторых актов Правительства Российской Федерации" на территории Архангельской области функционируют два предприятия, входящих в перечень: ОАО "Производственное объединение "Северное машиностроительное предприятие" и ОАО "Центр судоремонта "Звездочка" [100], поэтому определение загрязненности ЛРС радионуклидами является необходимым.
Поданным Центра по мониторингу загрязнения окружающей среды ФГБУ "Северное УГМС" мощность гамма-излучения в Архангельской области в среднем составляет 0,11 мкРв/ч, что не превышает естественный гамма-фон.
О наличии радионуклидов в образцах PC судили по естественному гамма-фону. Оценку проводили на измерителе мощности дозы РКСБ-104 РАДИАН («Белвар», Беларусь) [ПО].
В соответствии с полученными данными общий радиационный фон исследуемых образцов PC составлял в среднем 9,24 ± 1,02 мкРв/ч, что ниже среднего показателя мощности гамма-излучения по Архангельской области.
Поскольку отбор проб для определения загрязненности радионуклидами осуществлялся из объединенной пробы, заготовка PC возможна на всей обследованной территории. Определение микробиологической чистоты дикорастущего лекарственного растительного сырья
Таким образом, установлено, что все образцы исследуемого PC отвечают требованиям НД по разделу «Микробиологическая чистота». 1. Проведено экспедиционное обследование островов Соловецкого архипелага. Определены виды растений, внесенных в Государственный реестр лекарственных средств, заготовку которых целесообразно проводить на исследуемой территории: брусника, багульник, можжевельник, толокнянка, черника и растений, широко используемых в народной медицине Севера - ложечной травы и водяники гермафродитной. 2. Выполнены ресурсоведческие исследования: рассчитаны общая площадь и плотность зарослей, биологический, эксплуатационный запасы и возможный объем ежегодной заготовки, выделенных видов ДРС. 3. Установлено, что на исследуемой территории для трех видов ДЛРС возможный объем ежегодной заготовки превышает Ют- побеги брусники, побеги черники и трава толокнянки. Для трех видов ЛРС данный показатель составляет более трех тонн воздушно-сухого сырья: плоды можжевельника, листья брусники и побеги багульника. Ресурсы побегов водяники гермафродитной составляют более 20 т воздушно-сухого сырья, ложечной травы - более 600 кг (по данным для двух островов - Б. Соловецкого и Анзер). 4. Определено, что наиболее перспективными для проведения заготовительных работ территориями являются три острова Соловецкого архипелага: Б. Соловецкий, Анзер и Б. Муксалма. 5. Выявлено, что на острове Б. Соловецкий целесообразна заготовка багульника, брусники, черники, толокнянки и можжевельника; на острове Анзер - багульника, черники и толокнянки; на острове Б. Муксалма - багульника, брусники и толокнянки. Заготовка водяники гермафродитной и ложечной травы возможна на всех шести обследованных островах. 121 6. Обнаружено, что заготовку плодов черники и клюквы на исследованной территории проводить нецелесообразно из - за возрастающего с каждым годом антропогенного воздействия и вытеснения данных видов брусникой и водяникой гермафродитной. 7. Установлено соответствие исследуемых видов ДЛРС нормам качества, регламентированных НД. 8. Определена экологическая безопасность и микробиологическая чистота исследуемых видов ДЛРС. Фармакогностическое изучение ложечной травы и водяники гермафродитной, произрастающих на островах Соловецкого архипелага
Актуальность поиска безвредных, эффективных, экономически доступных всем слоям населения растительных противодиабетических средств не требует подробной аргументации. Эпидемиология СД 2 типа свидетельствует о катастрофическом увеличении количества больных.
Вместе с тем, большое количество нетоксичных растений, произрастающих на территории России, имеющих достаточные природные ресурсы, известных на уровне их многовекового применения и считающихся эффективными при СД, не подвергались экспериментальной верификации их лекарственных свойств [8,9].
Данные литературы свидетельствуют об обнаружении в химическом составе некоторых видов ложечной травы нортропановых алкалоидов, обладающих способностью избирательного ингибирования активности глюкозидаз [205]. Известны также гипогликемические свойства водяники гермафродитной [8]. Поскольку оба растения обильно произрастают на территории островов Соловецкого архипелага, представляло интерес изучение ложечной травы и водяники гермафродитной.
