Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы. растительные нейропротекторы - перспективные средства для профилактики и лечения цереброваскулярных заболеваний .
1.1. Этиология и патогенез цереброваскулярных заболеваний Ю
1.2. Лекарственные средства, обладающие нейропротективным действием
1.3. Растительные нейропротекторы 16
1.4. Характеристика лекарственного растительного сырья, входящего в состав исходного сбора
1.4.1. Корни астрагала перепончатого 19
1.4.2. Корни шлемника байкальского 25
1.4.3. Корневища и корни вздутоплодника сибирского З 3
1.5. Сборы и экстракты сухие - оптимальные формы переработки 38
лекарственного растительного сырья
Выводы к главе 1 41
Экспериментальная часть 42
Глава 2. Материалы и методы исследования 42
2.1. Материалы исследования 42
2.2. Методы исследования 42
ГЛАВА 3. Фармакогностическое изучение корней астрагала перепончатого
3.1. Характеристика морфологических признаков сырья 52
3.2. Характеристика микроскопических признаков сырья 52
3.3. Товароведческий анализ корней астрагала перепончатого 56
3.4. Фитохимическое изучение корней астрагала перепончатого
3.4.1. Качественный анализ 5 8
3.4.2. Идентификация фенольных соединений методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ)
3.4.3. Обнаружение олеаноловой кислоты методом тонкослойной хроматографии (ТСХ)
3.4.4. Идентификация свободных и связанных аминокислот методом ионообменной хроматографии
3.4.5. Изучение жирных кислот корней астрагала перепончатого 65
3.4.6. Изучение углеводного комплекса корней астрагала перепончатого 66
3.4.7. Определение содержания тритерпеновых сапонинов в корнях астрагала перепончатого
3.4.8. Количественное определение суммы органических кислот и дубильных веществ в корнях астрагала перепончатого
3.5. Стандартизация и разработка нормативной документации на корни астрагала перепончатого
Выводы к главе 3 82
ГЛАВА 4. Разработка и стандартизация растительного средства сбора нейропротекивного
4.1. Обоснование состава растительного сбора 85
4.2. Выбор оптимального варианта и соотношения компонентов сбора
4.3. Разработка технологии получения сбора 88
4.4. Товароведческий анализ сбора 91
4.5. Изучение внешних признаков сбора 93
4.6. Изучение микроскопических признаков сбора 93
4.7. Фитохимическое изучение сбора нейропротективного 102
4.7.1. Обнаружение основных групп биологически активных веществ с Ю2
помощью качественных реакций
4.7.2. Обнаружение веществ методом бумажной хроматографии (БХ) 102
4.7.3. Идентификация соединений методом ТСХ 104
4.7.4. Идентификация фенольных соединений методом ВЭЖХ
4.7.5. Идентификация свободных и связанных аминокислот, свободных НО углеводов, органических и жирных кислот, компонентов эфирного масла
4.7.6. Элементный состав сбора 118
4.7.7. Количественное определение биологически активных веществ в сборе 119
нейропротективном
4.7.7.1. Определение суммы органических кислот 119
4.7.7.2. Определение дубильных веществ 120
4.7.7.3. Определение аскорбиновой кислоты 120
4.7.7.4. Определение витаминов группы В в сборе и его компонентах 121
4.6.7.1. Определение суммы восстанавливающих моносахаров полисахаридного комплекса сбора
4.7.7.1. Определение тритерпеновых сапонинов 125
4.7.7.2. Определение кумаринов 128
4.8. Стандартизация и разработка нормативной документации на сбор нейропротективный
Выводы к главе 4 141
ГЛАВА 5. Разработка «брэйн-профит» экстракта сухого и его стандартизация
5.1. Оптимизация условий экстрагирования сбора нейропротективного 144
5.2. Технологическая схема получения «Брэйн-профит» экстракта сухого 149
5.3. Определение качественного состава и количественного содержания биологически активных веществ «Брэйн-профит» экстракта сухого
5.3.1. Идентификация фенольных соединений методом ВЭЖХ 154
5.3.2. Определение углеводов 156
5.3.3. Определение аминокислотного состава 157
5.3.4. Определение минерального состава
5.3.5. Исследование липидной фракции 159
5.3.6. Определение кумаринов 162
5.3.7. Определение витаминов группы В 163
5.3.8. Определение аскорбиновой кислоты 164
5.3.9. Определение дубильных веществ 165
5.3.10. Определение суммы органических кислот 165
5.4. Стандартизация и разработка нормативной документации на «Брэйн- 166
профит» экстракт сухой
Выводы к главе 5 171
Общие выводы 174
Список литературы
- Характеристика лекарственного растительного сырья, входящего в состав исходного сбора
- Характеристика микроскопических признаков сырья
- Идентификация свободных и связанных аминокислот методом ионообменной хроматографии
- Изучение внешних признаков сбора
Характеристика лекарственного растительного сырья, входящего в состав исходного сбора
В настоящее время около одного миллиарда человек во всем мире страдают неврологическими нарушениями [18], среди которых обширную группу составляют цереброваскулярные заболевания [42, 49, 96, ПО]. Показатели смертности от инсульта в России одни из самых высоких по сравнению с Европой и в 6 раз превышают аналогичные показатели в США [45, 105]. В структуре цереброваскулярных заболеваний различают острые и хронические нарушения мозгового кровообращения [70].
Острые нарушения мозгового кровообращения определяют как быстро возникающие очаговые и общемозговые (диффузные) нарушения функции головного мозга сосудистого генеза. Они представляют собой наиболее распространенные заболевания головного мозга в зрелом и пожилом возрасте. К острым нарушениям мозгового кровообращения относятся ишемические инсульты, геморрагические инсульты, транзиторная ишемическая атака (являющаяся преходящим нарушением мозгового кровообращения), острая гипертоническая энцефалопатия (гипертензивная энцефалопатия).
Хронические формы цереброваскулярных заболеваний, согласно принятой в России классификации сосудистых заболеваний головного и спинного мозга, выделены в разделе «прогрессирующие нарушения мозгового кровообращения». К группе хронических нарушений мозгового кровообращения относятся начальные проявления недостаточности кровоснабжения мозга и дисциркуляторная энцефалопатия.
К числу основных факторов риска ишемических нарушений мозгового кровообращения относятся пожилой и старческий возраст, артериальная гипертония, гиперхолестеринемия, атеросклероз церебральных и прецеребральных (сонных и позвоночных) артерий, курение, заболевания сердца (мерцательная аритмия, инфаркт миокарда и другие), сахарный диабет.
Ишемические нарушения мозгового кровообращения примерно в 90-95 % случаев вызваны атеросклерозом церебральных и прецеребральных артерий, поражением мелких церебральных артерий вследствие артериальной гипертонии, сахарного диабета или кардиогенной эмболией. В более редких случаях (5-10%) они обусловлены васкулитом, гематологическими заболеваниями, иммунологическими нарушениями, венозным тромбозом, расслоением прецеребральных или церебральных артерий, мигренью, у женщин - приемом оральных контрацептивов [64, 70, 85, 140]. В основе ишемических поражений головного мозга лежат реакции глутамат-кальциевого каскада, развивающиеся в первые минуты и часы после сосудистого инцидента [93]. В развитии глутамат-кальциевого каскада выделяют три основных этапа: индукция (запуск), ампфликация (усиление повреждающего потенциала) и экспрессия (конечные реакции каскада, непосредственно приводящие к гибели клетки).
Первый этап — индукция характеризуется нарушением энергетического метаболизма (активацией гликолиза, дискоординацией в цикле Кребса, торможением дыхания в митохондриальной цепи, дефицитом АТФ), усилением выброса возбуждающих аминоацидергических нейротрансмиттеров, развитием глутаматной эксайтотоксичности и «шоковым» притоком Са2+ в нейроны. Второй этап — амплификация характеризуется внутриклеточным накоплением ионов Са2+, распространяющейся глутаматной эксайтотоксичностью. Третий этап — экспрессия. На этом этапе происходит развитие ок-сидативного стресса и накопление низкомолекулярных цитотоксических продуктов - активных форм кислорода (АФК). Необходимо отметить, что свободное железо (II) участвует в образовании АФК в основном на инициальных этапах развития глутамат - кальциевого каскада и высокий уровень железа в нервной ткани зависит от повышения концентрации Са2+ в этих же системах.
При ишемии резко возрастает образование АФК в митохондриях при разобщении дыхательной цепи и окислительного фосфорилирования. Причем скорость образования АФК находится в прямой зависимости от степени блокирования дыхательной цепи.
Усиление образования АФК в ишемизированном мозге происходит при снижении функциональной активности антиоксидантной системы нейрона. В настоящее время выделяют четыре группы антиоксидантной системы нейрона [100].
К первой группе антиоксидантной системы относят жирорастворимые эндогенные антиоксиданты: токоферолы, убихиноны, ретинолы и мелатонин. Наибольшее значение в защите нейрона в условиях ишемии имеет вторая группа, к которой относят антиоксидантные ферменты — СОД, каталазу, глутатионредуктазу, соединения, которые содержат тиоловые и селено-группы (цистеин, метионин и цистин), а также гистидинсодержащие дипептиды (карнозин, анзерин, гомокарнозин).
Третью защитную систему нейрона составляют два фермента — глутатионпероксидаза и глутатионтрансфераза. Основной функцией данных ферментов является восстановление гидроперекисей до спиртов.
Четвертая защитная система существует для детоксикации Fe2+ и представлена церулоплазмином, трансферрином, ферритином и лак-тоферрином. Система регулирует металлкатализируемые реакции образования гидроксил-радикала (реакции Фентона и Габера — Вейсса). В условиях ишемии мозга недостаток данных белков приводит к усилению свободно радикального окисления и более выраженному неврологическому дефициту.
Характеристика микроскопических признаков сырья
Цельное сырье. Корни стержневые, ветвистые до 4 см толщиной, длиной 30-100 см, расширяющиеся в верхней части, сильно одревесневшие, волокнистые, поверхность продольно-морщинистая, от серовато-желтого до желтовато-бежевого цвета. На поперечном срезе видны светлая желтоватая внешняя кора, светло-желтая ксилема в виде сердцевинных лучей в корнях малого размера или в виде трещин в корнях большего размера, а также серовато-коричневый камбий, иногда видна коричневая сердцевина. Запах слабый, специфический. Вкус водного извлечения сладковато - горький.
Измельченное сырье. Кусочки корней различной формы, проходящие сквозь сито диаметром 7 мм. Цвет желтовато-белый, желтовато-серый. Запах слабый, специфический. Вкус водного извлечения сладковато - горький.
Порошкованное сырье. Измельченное сырье, проходящее сквозь сито с диаметром отверстий 0,5 мм. Цвет бежевый. Запах слабый, специфический. Вкус водного извлечения сладковато - горький.
При микроскопическом исследовании корней астрагала перепончатого, собранных в различных районах Республики Бурятия и Забайкальском крае, выявлены характерные анатомо-диагностические признаки сырья (поперечный срез корня и порошкованное сырье, рисунки 5 и 6).
Корни имеют вторичное беспучковое строение. На поперечных срезах видна хорошо развитая многорядная пробка, которая совместно с 3 - 5 рядами колленхимы образует феллодерму. Камбиальный пояс сплошной, многорядный, хорошо различим на срезах. Флоэмные лучи часто изогнуты и потрескавшиеся вдоль внешней части с волокнами, находящимися в виде пучков. Сердцевинные лучи 2 - 5-рядные. Просветы сосудов различного диаметра. В корнях присутствуют волокна, бесцветные или оранжевато-желтого цвета, с характерными утолщеными стенками, продольными трещинами и щеткообразными кончиками, расположены группами или одиночно в коровой и древесной частях корня. Каменистые клетки изодиаметрической или вытянутой формы с утолщенными, бороздчатыми стенками и простыми углублениями, встречаются в феллодерме. Клетки коры, древесины и сердцевины содержат простые крахмальные зерна (при обработке микропрепаратов раствором йода крахмальные зерна приобрели фиолетовое окрашивание).
Порошкованное сырье. Для микроскопии порошка корней астрагала перепончатого характерно: обрывки паренхимы, состоящей из округлых или округло-прямоугольных клеток; обилие механических волокон в плотных или расщепленных группах с разной степенью одревеснения, с продольной морщинистостью и редкими, едва заметными порами; обрывки сетчатых сосудов древесины диаметром 7-50 мкм, одиночные, в группах или прикрепленные к волокнам, редко - небольшие группы округлых или слегка удлиненных каменистых клеток с разной степенью одревеснения клеточных стенок; обрывки пробки коричневого цвета, состоящей из прямоугольных клеток, крахмальные зерна мелкие, нехарактерные, округлые, одиночные или в группах по 2 - 3. 7 Рисунок 5 - Микроскопическое строение поперечного среза корня астрагала перепончатого (А - увеличение 4x10, Б, В, Г, Д - увеличение 40x10, 1 - клетки пробки, 2 -колленхима, 3 - паренхима коры, 4 - флоэмные лучи, 5 - камбий, 6 - сердцевинные лучи, 7 - сосуды ксилемы, 8 - крахмальные зерна, 9 - механические волокна древесины) Рисунок 6 - Микроскопическое строение порошка корней астрагала перепончатого (Е -увеличение 4x10, Ж, 3, И - увеличение 10x10, 1 - паренхима, 2 - механические волокна, 3 - клетки пробки, 4 - сетчатые сосуды ксилемы) Таким образом, в результате проведения макро- и микроскопического анализа корней астрагала перепончатого установлены внешние признаки: корни стержневые, ветвистые до 4 см толщиной, одревесневшие, волокнистые, поверхность продольно-морщинистая, от серовато-желтого до желтовато-бежевого цвета. Для микроскопического строения корней астрагала перепончатого характерно наличие клеток хорошо развитой многорядной пробки, паренхимы, бесцветных и оранжевато-желтых механических волокон с характерными утолщенными стенками и продольными трещинами, сетчатых сосудов древесины, каменистых клеток изодиаметрической или вытянутой формы с утолщенными, бороздчатыми стенками и простыми углублениями и крахмальных зерен.
Товароведческий анализ корней астрагала перепончатого Товароведческий анализ проводили в образцах корней астрагала перепончатого, собранных в различных районах Республики Бурятия и Забайкальском крае, по методикам ГФ XI, ГФ XII. Оценку сырья проводили по показателям: содержание экстрактивных веществ, извлекаемых водой, влажность, зола общая, зола, не растворимая в 10% растворе НС1, примеси (органические и минеральные). Результаты анализа приведены в таблице 2. Таблица 2 - Товароведческие показатели образцов корней астрагала перепончатого, % от массы абсолютно-сухого сырья
В результате проведенного анализа обнаружено, что в различных образцах корней астрагала перепончатого содержание влажности составило от 5,81% до 6,43%, экстрактивных веществ, извлекаемых водой, от 20,98% до 25,12%, золы общей от 3,61% до 9,69%, золы, не растворимой в 10% растворе хлористоводородной кислоты, от 0,90% до 5,07%, органических примесей от 0,25% до 0,39%, минеральных примесей от 0,50% до 0,74%.
На основании полученных данных предложены числовые показатели для корней астрагала перепончатого: влажность не более 8,0%; экстрактивных веществ, извлекаемых водой, не менее 20,0%, золы общей не более 10,0%; золы, не растворимой в 10% растворе хлористоводородной кислоты, не более 6,0%; органических примесей не более 0,5%; минеральных примесей не более 1,0%. Золу общую, полученную при проведении товароведческого анализа, использовали для определения элементного состава корней астрагала перепончатого (таблица 3).
Идентификация свободных и связанных аминокислот методом ионообменной хроматографии
Качественное определение байкалина проводили в системе 8 на пластинах ПТСХ-ПА-УФ «Sorbfil». 0,05 мл 70% спиртового извлечения сбора нейропротективного (1:10) наносили микропипеткой на линию старта пластинки и хроматографировали в соответствующей системе параллельно с достоверным образцом байкалина. Хроматограммы высушивали на воздухе, обрабатывали 10% раствором серной кислоты и наблюдали оранжевую зону на белом фоне пластинки на уровне зоны РСО байкалина Rf 0,19 (рисунок 24).
Хроматографирование проводили на пластинах ПТСХ-ПА-УФ «Sorbfil» в системах растворителей 5, 6, 7. По 0,1 мл хлороформного извлечения сбора нейропротективного (1:5) и 0,05 мл спиртовых растворов стандартов наносили микропипеткой на линию старта хроматографической пластинки. Пластинку с пробами высушивали на воздухе в течение 15 минут и помещали в предварительно насыщенную камеру. Когда фронт растворителя проходил до 10 см, ее вынимали, сушили на воздухе до полного удаления системы и просматривали окраску пятен в УФ-свете, затем пластинку обрабатывали последовательно 0,5% спиртовым раствором NaOH и диазореактивом, высушивали, прогревали в сушильном шкафу при 110С в течение 5 минут и наблюдали изменение окраски зон адсорбции.
При использовании системы 5 происходило лучшее разделение веществ. В системе же 6 разделение было самым худшим, зоны адсорбции находились практически на одной линии, и возникали трудности при определении Rf веществ. В системе 5 было обнаружено 6 зон адсорбции (рисунок 25):
Схема хроматограммы хлороформного извлечения сбора нейропротективного (1) и спиртовых растворов стандартов (2 - фловерин - сумма дигидросамидина и виснадина, 3 -пеуцинидин, 4 - умбеллиферон, 5 - скополетин) в системе гексан - бензол - метанол (5:4:1) в УФ-свете 1) Rf(l) = 0,14 (Rf (1) соответствует Rf скополетина (7), голубая окраска зоны в УФ-свете; желтая - при обработке 0,5% спиртовым раствором NaOH; вишневая - при последующей обработке диазореактивом); 2) Rf (2) = 0,25 (Rf (2) соответствует Rf дигидросамидина (8); фиолетовая окраска зоны в УФ-свете; желтая - при обработке 0,5% спиртовым раствором NaOH; оранжевая - при последующей обработке диазореактивом); 3) Rf (3) = 0,34 (Rf (3) соответствует Rf умбеллиферона (9); голубая окраска зоны в УФ-свете; желтая - при обработке 0,5% спиртовым раствором NaOH; светло-оранжевая - при последующей обработке диазореактивом); 4) Rf (4) = 0,57 (Rf (4) соответствует Rf пеуцинидина (10); фиолетовая окраска зоны в УФ-свете; желтая - при обработке 0,5% спиртовым раствором NaOH; оранжевая - при последующей обработке диазореактивом); 5) Rf (5) = 0,68 (Rf(5) соответствует с Кґвиснадина (11); фиолетовая окраска зоны в УФ-свете; желтая - при обработке 0,5% спиртовым раствором NaOH; оранжевая - при последующей обработке диазореактивом); 6) Rf (6) = 0,76 (светло-зеленая окраска зоны в УФ-свете; желтая - при обработке 0,5% спиртовым раствором NaOH; оранжевая - при последующей обработке диазореактивом).
Качественное определение аскорбиновой кислоты проводили в водном извлечении сбора нейропротективного в системе растворителей 3 на пластинах «Silufol UV254».
На линию старта пластины микропипеткой наносили 0,5 мл водного извлечения сбора (1:10) и рядом 0,003 мл РСО аскорбиновой кислоты. Пластинку с нанесенными пробами помещали в камеру со смесью растворителей и хроматографировали восходящим способом. Когда фронт растворителей проходил 13 см, пластинку вынимали из камеры, сушили на воздухе в течение 5 минут и обрабатывали 0,04 % раствором 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия. При просмотре хроматограммы наблюдали белую зону на розовом фоне пластинки на уровне зоны РСО кислоты аскорбиновой Rf 0,90 (рисунок 26).
Схемы хроматограмм водного извлечения сбора нейропротективного (1) и раствора аскорбиновой кислоты (2) в системах этилацетат - ледяная уксусная кислота (80:20) (А) и этанол-уксусная кислота-вода (90:9:1) (Б)
Также водное извлечение исследовали на содержание аскорбиновой кислоты в системе растворителей 4 на пластинах ПТСХ-ПА-УФ «Sorbfil» в темной камере. При достижении фронта растворителя 15 см, пластину вынимали, высушивали при комнатной температуре и обрабатывали 10% раствором фосфорно-молибденовой кислоты в 95% спирте. При просмотре хроматограммы наблюдали синюю зону на желтом фоне пластинки на уровне зоны РСО кислоты аскорбиновой Rf 0,75 (рисунок 26).
На основании данных литературы и проведенных качественных реакций установлено, что в изучаемом сборе содержатся вещества фенольной природы. Проведен анализ водно-спиртового извлечения сбора методом ВЭЖХ. Методика приготовления 70% спиртового извлечения сбора нейропротективного. Аналитическую пробу сырья измельчали до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 2 мм.
Около 3 г (точная навеска) измельченного сбора помещали в колбу вместимостью 200 мл, прибавляли 60 мл 70% спирта, присоединяли колбу к обратному холодильнику и нагревали на кипящей водяной бане в течение 1 часа с момента закипания спиртоводной смеси в колбе. После охлаждения смесь фильтровали через бумажный фильтр в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводили 70% спиртом до метки (исследуемый раствор).
Изучение внешних признаков сбора
Для внедрения «Брэйн-профит» экстракта сухого в медицинскую практику проведена его стандартизация и разработан проект фармакопейной статьи предприятия.
Для определения подлинности экстракта предложены такие показатели, как описание внешнего вида, методики качественных реакций и тонкослойной хроматографии определения флавоноидов и свободных аминокислот.
Качественные реакции. 0,5 г экстракта сухого растворяют в 20 мл 60% спирта, перемешивают до растворения. К 2 мл раствора прибавляют 50 мг порошка металлического магния и 1 мл хлористоводородной кислоты концентрированной и нагревают на водяной бане 5 минут. Появляется красно-оранжевое окрашивание (флавоноиды); К 2 мл раствора прибавляют 4 капли 1% раствора нингидрина в 70% спирте, нагревают на кипящей водяной бане в течение 20 минут. Появляется красно-фиолетовое окрашивание (аминокислоты).
Хроматография. На линию старта хроматографической пластинки ПТСХ-ПА-УФ «Sorbfil» размером 15x15 см или 10x15 см наносят дробно в первую точку 0,05 мл 60% спиртового раствора экстракта сухого 1:20. Рядом на расстоянии 3 см от первой точки во вторую точку наносят 0,005 мл раствора РСО байкалина. Пластинку с нанесенными пробами высушивают на воздухе и помещают в камеру со смесью растворителей хлороформ-метанол (60:40) и хроматографируют восходящим способом. После прохождения фронтом растворителей 13 см, пластинку вынимают из камеры и высушивают на воздухе до удаления следов растворителей, опрыскивают 10% раствором серной кислоты и нагревают в сушильном шкафу при температуре 100С в течение 2-3 минут. На уровне зоны-свидетеля должна обнаруживаться доминирующая оранжевая зона Rf 0,19. Допускается наличие других желтых зон.
На линию старта хроматографической пластинки ПТСХ-ПА-УФ «Sorbfil» размером 15x15 см или 10x15 см наносят дробно в первую точку 0,05 мл водного раствора экстракта сухого 1:20. Рядом на расстоянии 3 см от первой точки во вторую точку наносят 0,005 мл раствора РСО аргинина. Пластинку с нанесенными пробами высушивают на воздухе и помещают в камеру со смесью растворителей пропанол - вода (70:30) и хроматографируют восходящим способом. После прохождения фронтом растворителей 10 см, пластинку вынимают из камеры и высушивают на воздухе до удаления следов растворителей, опрыскивают 0,2% спиртовым раствором нингидрина и нагревают в сушильном шкафу при температуре 100С в течение 2-3 минут. На уровне зоны-свидетеля должна обнаруживаться доминирующая фиолетовая зона аргинина с Rf 0,06. Допускается наличие других фиолетовых, розово-оранжевых зон.
Для определения доброкачественности экстракта сухого предложены методики количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на байкалин и суммы свободных аминокислот в пересчете на аргинин.
Разработка методики количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на байкалин в «Брэйн-профит» экстракте сухом
Разработка методики количественного определения флавоноидов в экстракте сухом проводилась по принципу сквозной стандартизации на основе методики разработанной для исходного сбора. В качестве стандартного образца использовали РСО байкалина, так как максимумы поглощения 60% спиртовых растворов байкалина и экстракта сухого находятся в одной области 279±2 нм (рисунок 50).
Методика 1. Около 0,3 г экстракта сухого помещают в плоскодонную колбу со шлифом вместимостью 250 мл, добавляют 50-60 мл 60% спирта, присоединяют колбу к обратному холодильнику, нагревают на кипящей водяной бане в течение 15 минут, периодически перемешивая, охлаждают. Полученный раствор переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят объем раствора 60% спиртом до метки (раствор А). 0,5 мл раствора А помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл и доводят объем раствора 60% спиртом до метки, перемешивают. Оптическую плотность раствора измеряют на спектрофотометре при длине волны 279±2 нм. В качестве раствора сравнения используют 60% спирт.
Данные, полученные в результате проведения валидации методики количественного определения суммы флавоноидов в экстракте сухом в пересчете на байкалин, позволяют оценить метод положительно по параметрам: линейность, повторяемость, воспроизводимость и правильность (Приложение 4)
Разработка методики количественного определения суммы свободных аминокислот в пересчете на аргинин в «Брэйн-профит» экстракте сухом
Аминокислоты являются одной из основных групп биологически активных соединений, определяющих суммарное фармакологическое действие сбора и экстракта сухого «Брэйн-профит».
Разработана методика количественного определения суммы свободных аминокислот по принципу сквозной стандартизации аналогично методике количественного определения свободных аминокислот в сборе, основанная на нингидриновой реакции с образованием комплекса голубого цвета с максимумом поглощения при длине волны 568±2 нм. Количественное определение суммы свободных аминокислот в «Брэйн-профит» экстракте сухом рассчитано по стандартному образцу аргинина, оптическая плотность раствора которого измеряется параллельно с раствором исследуемого образца. Выбор этой аминокислоты в качестве стандартного образца основан на спектрах поглощения комплексов аминокислот экстракта и аргинина с нингидрином (рисунок 51) и данных ионообменной хроматографии (глава 5, п. 5.3.4.).
Методика 2. Около 0,3 г (точная навеска) экстракта сухого помещают в плоскодонную колбу со шлифом вместимостью 250 мл, прибавляют 80 мл воды очищенной, нагревают на водяной бане при температуре 90С с обратным холодильником в течение 15 минут. После охлаждения полученное извлечение фильтруют в мерную колбу вместимостью 100 мл через бумажный складчатый фильтр «красная лента», предварительно промытый 10-15 мл воды очищенной, доводят объем раствора водой очищенной до метки, перемешивают (раствор А).
В пробирку вместимостью 25 мл помещают 1 мл раствора А, прибавляют к нему 2 мл ацетатного буфера 4,5, 2 мл 0,05% водного раствора аскорбиновой кислоты, 1 мл 0,2% водного раствора нингидрина и нагревают на кипящей водяной бане в течение 30 минут. После охлаждения раствор количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят объем раствора водой до метки, перемешивают и через 1 ч после начала реакции измеряют оптическую плотность на спектрофотометре при длине волны 568±2 нм.
Параллельно проводят реакцию свежеприготовленного раствора РСО аргинина (1 мл) с 0,2% водным раствором нингидрина (1 мл) в присутствии ацетатного буфера 4,5 (2 мл), 0,05% водного раствора аскорбиновой кислоты (2 мл) и измеряют оптическую плотность на спектрофотометре при длине волны 568±2 нм. В качестве раствора сравнения используют воду.
