Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 11
1. Роль инсулина в лечении сахарного диабета 11
2. Биосинтез и биологическое действие инсулина 12
3. Общая характеристика физико-химических и фармацевтических свойств инсулина 15
4. Препараты инсулина 24
5. Методы производства, стандартизации и контроля качества препаратов инсулина 31
6. Применение ЖХВД в фармацевтическом анализе инсулина... 46
ГЛАВА 2. Постановка задачи 50
ГЛАВА 3. Изучение влияния различных факторов на хроматографическое поведение инсулина в условиях ОФ ЖХВД 56
1. Методы и материалы 57
2. Обсуждение результатов 62
2.1. Влияние компонентного состава буферного раствора 62
2.2. Влияние концентрации натрия сульфата 68
2.3. Влияние температуры хроматографической колонки 70
2.4. Влияние органического модификатора 75
2.5. Влияние длины алкильного радикала привитой фазы 80
2.6. Влияние длины хроматографической колонки 80
3. Выводы 81
ГЛАВА 4. Совершенствование фармакопейных методик анализа препаратов инсулина, основанных на применении ОФ ЖХВД 82
1. Выбор оптимальных условий хроматографического определения инсулина и его примесей в лекарственных препаратах 82
2. Метрологические характеристики методики 84
3. Применение разработанной методики для испытания официнальных препаратов инсулина 95
4 Выводы 106
ГЛАВА 5. Разработка методик анализа инъекционных лекарственных форм изофан-инсулина на основе метода ОФ ЖХВД 107
1. Выбор условий хроматографического определения протамина в лекарственных формах изофан-инсулина 110
2. Изучение хроматографических профилей протаминов, выделенных из различных видов рыб 121
3. Методика определения протамина в препаратах изофан-инсулина 123
4. Валидация разработанной методики 125
5. Выводы 134
Общие выводы 136
Список литературы 139
Приложение 154
- Общая характеристика физико-химических и фармацевтических свойств инсулина
- Методы производства, стандартизации и контроля качества препаратов инсулина
- Применение разработанной методики для испытания официнальных препаратов инсулина
- Выбор условий хроматографического определения протамина в лекарственных формах изофан-инсулина
Общая характеристика физико-химических и фармацевтических свойств инсулина
С химической точки зрения инсулин представляет собой не большой глобулярный белок с молекулярной массой до 6000 Да. При этом следует отметить, что инсулин - это общее название для целого семейства гомологичных белков природного и искусст венного происхождения с общей характерной биологической актив ностью. Белковая природа инсулина установлена в 1928 г [52]. Он относится к числу белков, дающих биуретовую реакцию и реакцию Паули. Строение инсулина было полностью установлено в начале 50-х годов. Элементарный химический состав инсулинов различного происхождения характеризуется цифрами, приведенными в таблице 1 [40] .
Аминокислотный состав. Молекула большинства инсулинов содержит 51 аминокислотный остаток, среди которых находятся 17 аминокислот, встречающихся в большинстве известных белков.
Характерной особенностью аминокислотного состава инсулинов крупного рогатого скота, свиного и человеческого является отсутствие триптофана и метионина. Аминокислотный состав этих видов инсулина представлен в таблице 2 [40,46].
Инвариантным для всех видов инсулина является содержание цистина (6 полуцистиновых остатков). Кроме того, в молекуле инсулина всех видов содержится 6 амидных групп (аспарагин, глютамин) .
При выделении инсулина наряду с основной фракцией могут наблюдаться фракции дезамидированных форм инсулина. В кислой среде в процессе дезамидирования можно постепенно отщепить все 6 амидных групп, при этом изменяется электрофоретиче-ская и хроматографическая подвижность инсулина [40]. Об образовании дезамидированных форм инсулина можно судить по результатам определения аммиака. Для полностью амидной формы инсулина определяют 6 моль аммиака на 1 моль белка, для дезамидированных форм это значение может составлять от 5 до 0.
Первичная структура инсулина. Первичная структура инсулина была расшифрована группой Сэнгера в 1945-1955 гг. С помощью ряда хроматографических методов, которые позволили разделить и идентифицировать различные пептиды, аминокислоты и их производные, Сэнгеру удалось установить первичную структуру говяжьего инсулина [130,131,132,133,134,135]. Дальнейшие исследования инсулинов различного происхождения с применением целого ряда физико-химических методов, в том числе метода Эдмана для определения полной аминокислотной последовательности в длинных пептидах, подтвердили выводы Сенгера с соавторами о структуре инсулина [бб].
К настоящему моменту, первичная структура инсулина определена у представителей 24 видов, принадлежащих к 4 классам животных: млекопитающих, птиц, рыб и круглоротых [14] . Исследования инсулинов различного происхождения продолжается [71,72,73].
Структура инсулина у разных животных сходна, но не идентична. Инсулин человека по своей первичной структуре близок к инсулинам свиньи, собаки, кашалота и кролика, отличаясь лишь одной аминокислотой [40]. От инсулина крупного рогатого скота он отличается тремя аминокислотами. В большей мере инсулин человека не схож с инсулинами гвинейской свинки, птиц и рыб [40]. Отличия в последовательности аминокислот у инсулинов человека, свиньи и крупного рогатого скота приведены в таблице 3.
Несмотря на структурные различия, инсулины всех видов обладают сходной биологической активностью, т.е. вызывают гипог-ликемический эффект. Однако величина проявляемой биологической активности сильно зависит от видовой принадлежности и находится в пределах от 11 МЕ/мг (инсулин трески северного моря) до 62 МЕ/мг (инсулин индюка и цыпленка), при этом, активность инсулина человека составляет величину порядка 25-30 МЕ/мг [40]. Чем больше межвидовые отличия, тем значительней разница в биологической активности соответствующих инсулинов.
Молекула функционально активного инсулина состоит из двух полипептидных цепей (А- и В-цепи), соединенных дисульфидными связями; одна связь образована седьмыми аминокислотными остатками обеих цепей, вторая дисульфидная связь образована 20-м остатком А-цепи и 19-м остатком В-цепи (рисунок 2). Кроме того, в молекуле инсулина имеется третья дисульфидная связь, которая является внутрицепочечной и соединяет 6-й и 11-й остатки А-цепи [59,117].
Вторичная структура. С использованием различных физико-химических и физических методов исследования, было показано, что молекуле инсулина свойственна высокоупорядоченная пространственная структура (конформация), которая способствует выполнению специфических биологических функций [14]. В молекуле нативного инсулина присутствуют одновременно как сс-спирали, так и р-складчатые листы. Кроме того, имеются участки с неупорядоченной структурой и структурой {3-петли. Участки, имеющие форму а-спирали, составляют 57 %, 6 % приходится на [3-складчатую структуру, 10 % построено в виде р-петли, оставшиеся 27 % не имеют упорядоченной структуры (рисунок 3) [25].
При нагревании кислого раствора инсулина (рН 2,3-2,5) при температуре +100 С и быстром охлаждении до -80 С образуется так называемый фибриллярный инсулин - полностью неактивная форма гормона [27] . Внесение волокон фибриллярного инсулина в раствор активного инсулина вызывает спонтанное количественное осаждение инсулина в виде фибрилл [14,17].
Методы производства, стандартизации и контроля качества препаратов инсулина
Получение животных видов инсулина. Промышленное производство говяжьего и свиного инсулина было налажено практически одновременно в целом ряде стран, вскоре, после открытия инсулина в 1921 г [63] . За прошедшее с тех пор время принципиальная схема получения инсулина осталась практически неизменной (таблица б) [17,18]. Исходным сырьем для производства животных видов инсулина служат поджелудочные железы убойного скота, используемого для пищи.
Важнейшей задачей при производстве инсулина является его очистка - освобождение субстанций от сопутствующих примесей, которые снижают биологическую активность, вызывают иммунологические реакции, либо потенциально опасны для здоровья больного. Например, после нескольких лет применения плохо очищенного инсулина в крови больного может находиться до 5000 ЕД инсулина, связанного с антителами. Антитела к инсулину значительно влияют на профиль его действия и, тем самым, способствуют лабильному течению сахарного диабета.
Первым методом очистки инсулина была перекристаллизация в присутствии солей цинка. В 1945 г было показано, что семикратная перекристаллизация инсулина значительно снижает уровень аллергических реакций у пациентов, по сравнению с официальными на тот момент препаратами инсулина [63].
Гетерогенность образцов инсулина после кристаллизации и однократной перекристаллизации показана с помощью целого ряда методов: противоточной экстракции (ПЭ), распределительной хроматографии (РХ), ионообменной хроматографии (ИОХ), дискэлек-трофореза (ДЭФ) и гель-эксклюзионной хроматографии (ГЭХ) [63].
Было установлено, что основными сопутствующими инсулину примесями являются: проинсулин, его интермедиаты, ковалентный димер инсулина, монодезамидоинсулин, моноаргинин и моноэтилинсулин, а так же ряд высокомолекулярных соединений не инсулиновой природы. Обобщенным выводом по результатам проведенных исследований, с учетом сведений об иммунологической активности обнаруженных примесей [138], явилось заключение о необходимости дополнительной очистки субстанций инсулина, с тем, чтобы при анализе методами ДЭФ и ГЭХ обнаруживался один компонент - соответствующий инсулину.
Для решения проблемы очистки инсулина в 1950 г был предложен метод ГЭХ, а в 1970 г метод анионообменнои хроматографии (АОХ). Установлено, что инсулин, очищенный методом АОХ, содержит около 500 чнм (частей на миллион) примесей с проинсули-новой активностью [137]. Дополнительная очистка инсулина с использованием жидкостной хроматографии высокого давления на обращенных фазах (ОФ ЖХВД) позволяет снизить содержание иммуно-генных фракций до предела их обнаружения [63].
Обзор современных разработок в области хроматографической очистки инсулина представлен в работе [96]. Инсулин, подвергнутый очистке, последовательно, с помощью ИОХ и ГЭХ получил название - монокомпонентный инсулин [63]. Получение человеческого инсулина. Поиски методов получения человеческого инсулина были обусловлены двумя обстоятельствами. С одной стороны, актуальностью сырьевой проблемы в случае производства животного инсулина, с другой - стремительное развитие науки в этой области дало реальную возможность воплотить идею в жизнь. В 1979 и 1981 гг. практически одновременно были разработаны два способа получения человеческого инсулина - биосинтетический и полусинтетический [102,108]. В 1981 г. компания Ново Нордиск впервые в мире начала серийный выпуск человеческого полусинтетического инсулина. Использованный компанией метод основан на ферментно-химической взо замене Ала в молекуле свиного инсулина на остаток Тре [61]. Этот метод находится в прямой зависимости от получения необходимого количества свиного инсулина, что снижает его экономическое значение. Возможность получения инсулина человека биосинтетическим методом появилась с развитием технологии рекомбинантных ДНК [10]. Работы по генно-инженерному получению инсулина начались около 25 лет назад. В 1978 г появилось сообщение о получении штамма кишечной палочки, продуцирующего крысиный проинсу-лин. В 1979 г ученьм компании Genentech удалось клонировать в E.coli гены, кодирующие аминокислотные последовательности для. цепей А и В инсулина, включенньми в р-галоктозидазный участок плазмиды pBR322 [10,102]. В 1981 г был синтезирован ген-аналог проинсулина - мини-С-проинсулин, в котором 35-звенный С-пептид заменен сегментом из шести аминокислот: арг-арг-гли-сер-лиз-арг и показана его экспрессия в E.coli. В 1982 г компания Эли Лилли начала первое в мире промышленное производство инсулина человека по двух цепочечной технологии, разработанной в сотрудничестве с компанией Genentech [102]. В настоящее время показана возможность получения инсулина человека с помощью различных экспрессирующих систем [3,10,101,102]. С экономической точки зрения особый интерес представляет применение генетически модифицированных штаммов граммположительных бактерий E.coli, многие из которых считаются сверхпродуцентами [3]. В то же время значительные успехи были достигнуты с дрожжевыми клетками Saccharomices cerevisiae [3,75] . В таблице 7 перечислены основные, общие для различных способов получения рекомбинантного инсулина человека, этапы технологического процесса [3,10,63].
Применение разработанной методики для испытания официнальных препаратов инсулина
Жидкостная хроматография высокого давления (ЖХВД) - вариант колоночной жидкостной хроматографии, в котором подвижная фаза - элюент - проходит через заполняющий колонку сорбент с большой скоростью за счет значительного давления (до 400х105 Па) на входе в колонку [11] .
Как способ анализа сложных смесей веществ ЖХВД появилась чуть более 30 лет назад. Применение сорбентов с диаметром частиц 3-10 мкм вызвало резкое повышение эффективности хромато-графического разделения по сравнению с классическим вариантом колоночной жидкостной хроматографии. Поэтому ЖХВД часто называют - высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ). Инструментальные особенности применения ЖХВД подробно описаны в многочисленных пособиях [49,50] и в соответствующих разделах ведущих фармакопеи [79,150]. Для ЖХВД разработан и выпускается широкий ассортимент сорбентов. По оценке авторов обзора [51] - около 100 фирм во всем мире выпускают более 300 типов наименований сорбентов. История, современное состояние и перспективы развития метода обсуждаются в обзорных работах [51] и [77,78].
В различных своих вариантах метод ЖХВД широко используется в фармацевтическом анализе (контроль производства и испытание качества лекарственных средств). Метод включен во все ведущие фармакопеи мира. Наиболее полно этот метод описан в европейской и американской фармакопеях. ЖХВД применяют для идентификации лекарственных средств, для определения чистоты, молеку-лярно-массового фракционного состава и количественного анализа. В фармакопее США 28 изд. около 30 % частных статей предусматривают применение ЖХВД. В европейской фармакопее 4-го изд. этот показатель составляет около 40 %.
Первым хроматографическим методом исследования инсулина была гель-эксклюзионная жидкостная хроматография низкого давления (ГЭ ЖХНД). Принцип разделения в условиях ГЭЖХ основан на различной способности молекул разного размера проникать в поры нейтрального геля, который служит неподвижной фазой. Гидродинамический диаметр мономера и димера инсулина пропорционален их молекулярной массе и равняется 2,69 и 5,50 нм соответственно [115].
В 1967 г с помощью метода ГЭ ЖХНД было показано, что коммерческие препараты инсулина, очищенные путем кристаллизации содержат примеси с молекулярной массой превышающей молекулярную массу инсулина [63]. На хроматограммах свиного инсулина были обнаружены три пика, условно обозначенные как а-, Ь- и с-компоненты. С тех пор было предложено ряд хроматографических систем, позволяющих контролировать содержание высокомолекулярных примесей в препаратах инсулина. Разделение проводили на сильно набухающих ксерогелях агарозы (Bio-Gel Р-30, Bio-Rad Lab.) или декстрана (Sephadex G-50, Pharmacia Fine Chemicals), в качестве ПФ использовали 1-3 М растворы кислоты уксусной [127]. Высокая чувствительность указанных сорбентов к сжатию при давлениях, превышающих давление набухания матрицы, делает эти материалы непригодными для работы в режиме ЖХВД.
Применение гель-эксклюзионной жидкостной хроматографии при высоких давлениях (ГЭ ЖХВД) для анализа инсулина впервые было описано в 1980 г, после разработки жестких макропористых сорбентов совместимых с водой и выдерживающих высокие давления. В работе [151] разделение проводилось на колонках Protein-Pak 1-125 (Waters), TSK-Gel SW 2000 (Toho Soda Corp.), Bondagel (Pharmacia) в денатурирующих условиях (сочетание 7 М раствора мочевины, минеральных кислот и не ионных детергентов). Необходимость анализа инсулина в денатурирующих условиях связана со способностью инсулина к агрегации в растворе. Для разделения инсулина в условиях ГЭ ЖХВД описано так же применение «традиционного» элюента - уксусной кислоты [152]. Применение уксусной кислоты имеет ряд преимуществ - минимальное воздействие на нативную структуру разделяемых соединений, доступность, низкая стоимость, кроме того, важным обстоятельством является способность уксусной кислоты подавлять ассоциацию инсулина.
В настоящее время ГЭ ЖХВД является фармакопейным методом контроля содержания высокомолекулярных примесей в субстанциях и готовых лекарственных формах. Метод применяют так же для определения содержания протамина в препаратах изофан-инсулина.
Применение ЖХВД на обращенных фазах (ОФ ЖХВД) для разделения инсулина крупного рогатого скота и свиного инсулина впервые продемонстрировало высокую эффективность этого метода для анализа близких по структуре инсулиноподобных пептидов.
Механизм разделения белков и полипептидов в условиях ОФ ЖХВД основан на различной гидрофобности молекул инсулина и сопутствующих примесей. К настоящему моменту описано несколько десятков методик хроматографического разделения инсулинов различного происхождения и их производных, в том числе, от проин-сулина, панкреатических полипептидов, дезамидопроизводных, ди-мера инсулина. В работе [126] показана возможность разделения куриного, кроличьего, овечьего и лошадиного инсулина. Были разделены так же человеческий, говяжий и свиной инсулин. Ллойд и Корран опубликовали метод позволяющий разделить говяжий, свиной, человеческий инсулины и их соответствующие дезамидиро-ванные формы [104].
Разделение проводят на селикагелевых сорбентах модифицированных, метил-, бутил-, октил-, октадецил- и фенильными группами в изократическом или градиентном режиме. В качестве ПФ используют органические модификаторы - ацетонитрил, спирт метиловый, спирт изопропиловый, в смеси с водными буферными растворами, содержащими неорганические соли и ионпарные реагенты. Детектирования пиков проводят главным образом спектрофотомет-рическим методом при длине волны 190-220 нм, описаны так же флуориметрические методы [103].
Анализ субстанции и готовых лекарственных форм инсулина с использованием ОФ ЖХВД описан в частных статьях американской и европейской фармакопеи [79,150]. Метод применяется для испытания препаратов указанной группы по показателям «Подлинность инсулина», «Родственные белки», «Количественное определение» и «Инсулин в растворе».
В научно-исследовательской литературе описано так же применение ионообменной и аффинной хроматографии для анализа инсулина [44,102], однако широкого применения эти методы в фармакопейной практике не получили.
Выбор условий хроматографического определения протамина в лекарственных формах изофан-инсулина
Увеличение ионной силы ПФ, как правило, приводит к увеличению коэффициентов емкости инсулина, что может быть вызвано рядом факторов: - увеличение концентрации ионов уменьшает степень ионизации заряженных групп молекулы белка, повышая ее гидрофобность/ - высокая концентрация катионов способствует экранированию свободных силанольных групп на поверхности стационарной фазы, что ослабляет неспецифическое электростатическое взаимодействие протонированных аминогрупп белка с матрицей; - высокая ионная сила оказывает влияние на пространственную структуру инсулина, в результате изменяется поверхность, доступная взаимодействию с сорбентом. Концентрация неорганических солей в ПФ влияет на форму пи-ков и селективность разделения инсулина и дезамидо-Асн -инсулина [143,144]. При изократическом элюировании на сорбенте LiChrosorb Сів 0,1 М раствором натрия фосфата (рН 2,3) удовлетворительного результата удалось достигнуть только при добавлении в буферный раствор натрия сульфата до концентрации 0,1 М. Большинство методик анализа инсулина, включенных в фармакопейные статьи и НД, используют ПФ на основе буферных растворов с содержанием натрия сульфата равным 0,2 М. Столь высокое содержание натрия сульфата негативно сказывается на воспроизводимости результатов хроматографирования из-за расслаивания элюентов, кроме того, высококонцентрированные солевые растворы отрицательно воздействуют на хроматогра-фическое оборудование, сокращая срок его эксплуатации. Учитывая, что фармакопейные методики анализа разрабатывались более 20 лет тому назад, представлялось интересным изучить хроматографическое поведение инсулина в условиях ОФ ЖХВД на хроматографических сорбентах последнего поколения в зависимости от концентрации натрия сульфата. При этом стремились выяснить - допустимо ли снижение содержания натрия сульфата в ПФ без существенного ухудшения разделительной способности хрома-тографической системы. В результате проведенных исследований установлено, что влияние концентрации натрия сульфата в ПФ носит различный, характер, в зависимости от типа привитой фазы, а так же от видовой принадлежности инсулина. На сорбентах с привитыми группами С4 и С& селективность разделения пиков инсулина человека и дезамидо-Асн -инсулина человека не зависит от концентрации натрия сульфата в. буферном1 растворе в диапазоне от 0,05 М до 0,2 М. На сорбенте Диасфер-110-С18 селективность разделения данной пары пиков имеет максимум при 0,05 М и минимум при 0,1 М (диаграмма 4). С другой стороны, селективность разделения животных видов инсулина и соответствующих им дезамидированных по АснА21 форм не зависит от ионной силы раствора при разделении на сорбенте Диасфер-110-С18. На сорбенте с привитыми группами С8 селективность увеличивается от 1,25 до 1,28 с ростом концентрации натрия сульфата (диаграмма 4). На сорбенте с привитыми группами С4 селективность разделения в случае говяжьего инсулина максимальна при 0,1 М натрия сульфата и минимальна при 0,2 М. Для свиного инсулина не обнаружено ярко выраженного максимума при концентрации натрия сульфата 0,1 М, в данном случае повышение ионной силы приводило к снижению селективности разделения (диаграмма 4). Число эффективных теоретических тарелок с ростом концентрации натрия сульфата возрастает. Исключение составляет поведение человеческого инсулина на сорбенте Диасфер-110-С8 (диаграмма 5) . Степень разделения пиков инсулина и дезамидо-Асн -инсулина возрастает с увеличением ионной силы ПФ независимо от видовой принадлежности инсулина и типа привитой фазы (диаграмма б) . При снижении концентрации натрия сульфата от 0,2 М до 0,1 М степень разделения выбранной пары пиков снижается в среднем на 5 % - для человеческого и свиного инсулинов, и на 10 % - для говяжьего инсулина. С учетом того, что абсолютная величина степени разделения превышает 2,0, измеренное ухудшение разделительной способности колонки, по нашему мнению, не является существенным. Следовательно, концентрация натрия сульфата в буферном растворе ПФ может быть снижена в 2 раза по сравнению с фармакопейными методиками анализа.
В большинстве работ, посвященных анализу белков и пептидов, разделение проводится при комнатной температуре. Более того, некоторые авторы указывают, что влияние температуры на селективность разделения минимально [48] . Однако при увеличении температуры ускоряется процесс массо-обмена между стационарной и подвижной фазами, что приводит к уменьшению времени удерживания пептидов и сужению пиков.
