Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Химико-токсикологическое значение бупивакаина14
1.1. Применение бупивакаина в медицинской практике и его побочные
1.2. Аналитические методы исследования бупивакаина 22
1.3. Применение электрофореза для очистки и анализа органических
Экспериментальная часть 37
ГЛАВА 2. Объекты и методы исследования 37
2.2. Методы исследования бупивакаина 38
2.2.1. Условия проведения анализа бупивакаина методом электрофореза на
2.2.1.1. Пропитывание полосок бумаги электролитом 38
2.2.1.3. Нанесение исследуемых образцов и метчиков 39
2.2.1.4. Подготовка прибора и проведение электрофореза 39
2.2.1.5. Обнаружения зон бупивакаина на электрофореграмме 40
2.3. Условия проведения исследования бупивакаина методом капиллярного
2.3.1. Общая характеристика системы капиллярного электрофореза
2.3.3.1.Условия подготовки нового капилляра 43
2.3.3.2.Условия подготовки капилляра между анализами 43
2.3.6. Изучение УФ-спектра бупивакаина .46
2.3.7. Условия исследования бупивакаина методом капиллярного
2.4. Статистическая обработка результатов исследований и валидационная характеристика методик анализа бупивакаина 48
ГЛАВА 3. Изучение возможности идентификации по электрофоретическим спектрам и количественного определения бупивакаина методом капиллярного электрофореза50
3.1. Изучение возможности идентификации бупивакаина по элетрофоретическим спектрам методом капиллярного электрофореза 50
3.1.1. Идентификация бупивакаина по времени миграции 50
3.1.2. Идентификация бупивакаина по электрофоретическим спектрам и
3.1.3. Изучение ионного состояния бупивакаина по электрофоретическим спектрам и исправленному времени миграции 55
3.1.4. Количественные характеристики бупивакаина по электрофоретическим спектрам и исправленному времени миграции 56
3.1.5. Чувствительность идентификации бупивакаина по электрофоретическим спектрам и исправленному времени миграции
3.2. Количественное определение бупивакаина методом капиллярного
3.2.1. Построение калибровочного графика 58
3.2.2. Определение погрешности метода капиллярного электрофореза при
ГЛАВА 4. Идентификация и количественное определение бупивакаина в биологических объектах (модельных смесях) методом капиллярного электрофореза63
4.1. Изучение влияния соэкстрактивных веществ биологических объектов на идентификацию бупивакаина по электрофоретическим спектрам и исправленному времени миграции методом капиллярного электрофореза .63
4.1.1. Исследование биологического материала (ткани печени)64
4.1.2. Исследование мочи 64
4.1.3. Исследование крови 65
4.1.4. Приготовление модельных биологических смесей бупивакаина 65
4.1.5. Идентификация бупивакаина в присутствии соэкстрактивных веществ биологических объектов по электрофоретическим спектрам и исправленному времени миграции методом капиллярного электрофореза .65
4.1.6. Количественные характеристики бупивакаина по электрофоретическим спектрам и исправленному времени миграции в присутствии соэктрактивных веществ биологических объектов 68
4.1.7. Чувствительность идентификации бупивакаина по электрофоретическим спектрам и исправленного времени миграции в присутствии соэкстрактивных веществ биологических объектов методом капиллярного электрофореза 69
4.2. Количественное определение бупивакаина в биологических объектах (модельных биологических смесях) методом капиллярного электрофореза 70
4.2.1. Выбор оптимальных условий экстракции бупивакаина из водных растворов 71
4.2.1.1. Влияние рН среды и природы органического растворителя на степень экстракции бупивакаина из водных растворов 71
4.2.1.2. Влияние кратности экстрагирования и объема экстрагента на степень экстракции бупивакаина из водных растворов 72
4.2.2. Количественное определение бупивакаина в моче методом капиллярного электрофореза 74
4.2.3. Количественное определение бупивакаина в крови методом капиллярного электрофореза 76
4.2.3.1. Изучение влияния осадителей белковых веществ на степень экстракции бупивакаина из крови 76
4.2.3.2. Чувствительность количественного определения бупивакаина в крови методом капиллярного электрофореза 79
4.2.4. Количественное определение бупивакаина в тканях трупной печени методом капиллярного электрофореза 81
4.2.4.1. Чувствительность количественного определения бупивакаина в тканях трупной печени методом капиллярного электрофореза 84
Заключение по главе 4 86
ГЛАВА 5. Обнаружение и определение бупивакаина в органах экспериментальных животных88
5.1. Изучение распределения бупивакаина в биологических средах и органах экспериментальных животных88
5.2. Идентификация бупивакаина по электрофоретическим спектрам и исправленному времени миграции, выделенного из крови и ткани печени экспериментальных животных методом капиллярного электрофореза 90
Заключение по главе 5 95
ГЛАВА 6. Сохраняемость бупивакаина в трупном материале96
6.1. Выбор условий электрофоретической очистки бупивакаина методом электрофореза на бумаге 96
6.1.1. Изучение потерь бупивакаина при элюировании из хроматографической бумаги 97
6.1.2. Изучение потерь бупивакаина при очистке методом электрофореза на бумаге 98
6.2. Изучение сохраняемости бупивакаина в биологическом материале .99
6.3. Идентификация бупивакаина по электрофоретическим спектрам и исправленному времени миграции в гнилостно измененном материале
Общие выводы 108
Литература 110
Приложение 132
- Аналитические методы исследования бупивакаина
- Условия подготовки капилляра между анализами
- Исследование биологического материала (ткани печени)
- Изучение распределения бупивакаина в биологических средах и органах экспериментальных животных
Введение к работе
Актуальность работы. Бупивакаина гидрохлорид является одним из наиболее активных и длительно действующих местных анестетиков амидного типа, характеризующийся длительностью латентного периода, высокой диффузионной способностью (Rusu M., Фесенко В.С.). В анестезиологии применяется для проведения региональной, каудальной, эпидуральной анестезии, включая местную инфильтрационную, а также другие виды блокад. При однократном эпидуральном введении длительность эффекта составляет 2 – 5 часов, при периферической блокаде нервов – до 12 ч (Калви Т.Н., Уильямс Н.Е., Харкевич Д.А. и др.).
При определённых условиях (передозировка, индивидуальная непереносимость, патология внутренних органов и др.) бупивакаин, как и другие местные анестетики, оказывает токсическое действие на организм человека, в том числе с летальным исходом (Малрой М., Калви Т.Н., Джеймс П. Рафмел и др.).
Для выяснения смерти лиц, принимавших анестетик, решающее значение приобретают результаты судебно-химического исследования. При определении токсических веществ в биологических объектах целесообразно использование высокочувствительных и селективных методов, позволяющих сочетать разделение, идентификацию и количественное определение при исследовании одной и той же пробы. Одним из них является капиллярный электрофорез (КЭ), характеризующийся простым аппаратурным оформлением, доступными расходными материалами, высокой эффективностью, сочетанием разделения веществ с последующей их идентификацией в УФ-области спектра непосредственно в кварцевом капилляре (Комарова Н.В., Каменцев Я.С. и др.).
Степень разработанности темы исследования. В настоящее время метод капиллярного
электрофореза имеет хорошие результаты практического применения в пищевой
промышленности (Якуба Ю.Ф. и др.), ветеринарии, криминалистике (Будников В.Н.), фармации
при анализе субстанций, лекарственных форм (Гремяков А.И., Шпак А.В., Богачук М.Н.,
Сенченко С.П. и др.), разделении энантиомеров (Комарова Н.В., Буданова Н.Ю.); в
биофармацевтических исследованиях (Arranz A.J. , Chik Z. , Vargas G.), химико-токсикологической и клиническо-лабораторной практике (Джурко Ю.А., Биткин И.А.). Однако данные литературы содержат только отдельные методики анализа бупивакаина с использованием этого метода. При
этом возможности КЭ применительно к химико-токсикологическому (судебно-химическому) исследованию анестетика в биологических объектах не изучены, а также отсутствует схема химико-токсикологического анализа бупивакаина
В связи с вышеизложенным, цель работы - изучение возможности применения капиллярного электрофореза как метода, удовлетворяющего требованиям аналитической токсикологии, для анализа бупивакаина в биологических объектах.
Задачи, решаемые для достижения поставленной цели:
-
Установить оптимальные условия анализа бупивакаина с использованием отечественной системы капиллярного электрофореза «Капель -105».
-
Изучить возможность обнаружения и идентификации бупивакаина по электрофоретическим спектрам (ЭФС-идентификация).
3. Разработать методики количественного определения бупивакаина, пригодные для целей
химико-токсикологического и клинического лабораторного анализа
4. Разработать методики выделения и аналитической детекции бупивакаина в
биологических объектах.
-
Провести изучение распределения бупивакаина в органах и биологических средах экспериментальных животных
-
Изучить сохраняемость бупивакаина в гнилостно измененном материале методом капиллярного электрофореза
Научная новизна исследования
Впервые на базе отечественной системы капиллярного электрофореза «Капель-105» разработаны высокочувствительные, экономичные, доступные и простые в выполнении методики:
ЭФС-идентификации бупивакаина в водных растворах и в извлечениях из биологических объектов (кровь, моча, ткань печени). Электрофоретический спектр по исправленному времени миграции (ЭФС по t и) позволил рассчитать константы ионизации (рКа) и установить стадии депротонирования молекулы анестетика в зависимости от рН среды;
количественного определения бупивакаина в водном растворе и в модельных биологических объектах.
Предложенные методики ЭФС-идентификации и количественного определения бупивакаина апробированы на лабораторных животных при введении им максимальных терапевтических доз.
Впервые изучена сохраняемость бупивакаина в тканях трупной печени со сроком хранения 1, 2 и 4 недели.
Теоретическая значимость работы заключается в обобщении данных о методах анализа местного анестетика - бупивакаина, обосновании методик его изолирования, идентификации и количественного определения в биологических объектах Результаты исследования могут использоваться кафедрами высших медицинских учебных заведений при изучении дисциплин «Фармацевтическая химия» и «Токсикологическая химия».
Практическая значимость работы заключается в разработке экономичных, доступных и экспрессных в выполнении методик изолирования, ЭФС-идентификации и количественного определения бупивакаина в биологических объектах на базе современного физико-химического метода - капиллярного электрофореза Методики обладают высокой воспроизводимостью, чувствительностью и требуют минимума исследуемого вещества и реактивов.
По материалам исследования составлен проект информационного письма «Химико-токсикологический анализ бупивакаина в моче капиллярным электрофорезом», предназначенного для использования химико-токсикологическими лабораториями и Бюро судебно-медицинских экспертиз РФ.
Полученные акты внедрения подтверждают использование разработанных методик
изолирования, идентификации и количественного определения бупивакаина в биологических
объектах судебно-химическим отделением ГБУЗ ВО «Владимирское областное бюро судебно-
медицинской экспертизы» (акт внедрения ГУЗ
ЯО «Ярославское областное бюро судебно-медицинской экспертизы» (2 акта внедрения от 03.06.2013г), судебно-химическим отделением ГБУЗ ЯО «Ярославская областная клиническая наркологическая больница» (акт внедрения от 18.06.2013г).
Методология и методы исследования. Теоретическую основу исследования составили труды отечественных (Комарова НВ., Каменцев ЯС. и др.) и зарубежных (Йоргенсон, Лукас и др.) исследователей, развивающие практическое применение капиллярного электрофореза, а
также публикации в области фармакологических и аналитических исследований бупивакаина; международная и российская нормативная документация по метрологии и валидации методик анализа Методология заключалась в изучении поведения бупивакаина в растворах электролитов, выборе оптимальных условий экстракции для последующего исследования модельных биологических объектов (в том числе гнилостно измененных) и биологических образцов, полученных от лабораторных животных, а также в обобщениях, заключениях и рекомендациях по практическому применению.
При выполнении работы было проведено комплексное физико-химическое и биологическое исследование бупивакаина в водных растворах и биологических объектах.
Основные положения, выносимые на защиту. На защиту диссертационной работы выносятся следующие результаты исследования:
обоснование и выбор условий идентификации бупивакаина по электрофоретическим спектрам с использованием отечественной системы капиллярного электрофореза «Капель-105»;
доказательства возможности ЭФС-идентификации бупивакаина в присутствии соэкстрактивных веществ в модельных биологических объектах, биологических средах и внутренних органах лабораторных животных, а также в гнилостно измененном трупном материале;
выбор условий экстракции бупивакаина из водных растворов с учетом влияния следующих факторов: природы органического растворителя, рН среды, объема экстрагента, кратности экстрагирования;
результаты количественного определения бупивакаина в биологических объектах, разработанные применительно к целям и задачам химико-токсикологической (судебно-химической) и клинической лабораторной практики;
обнаружение и определение бупивакаина в жидких средах и внутренних органах экспериментальных животных (крысах);
результаты изучения сохраняемости бупивакаина в тканях трупной печени со сроком хранения 1, 2 и 4 недели.
Степень достоверности и апробация результатов. Достоверность результатов подтверждена статистической обработкой полученных результатов. Научные положения и
выводы основываются на обширном экспериментальном материале и логически вытекают из результатов исследования.
Основные результаты исследований доложены и обсуждены на научно-практической конференции с международным участием, посвященной 25-летию фармацевтического факультета Ярославской государственной медицинской академии, Всероссийской научно-практической конференции с международным участием, посвященной 65-летию СНО ЯГМА, Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные вопросы медицинской науки», посвященной 70-летию профессора А.А. Чумакова, Всероссийской научно-практической конференции с международным участием, посвященной 30-летию фармацевтического факультета Ярославской государственной медицинской академии «Инновационные процессы в лекарствоведении», Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные вопросы медицинской науки», посвященной 85-летию профессора Е.Н. Дормидонтова (г. Ярославль, 2007 – 2012 гг.).
Личный вклад автора. Личное участие автора выразилось в непосредственном участии на всех этапах исследования: от постановки цели и задач работы, реализации эксперимента, апробации проведенных испытаний, интерпретации полученных результатов до их обобщения, систематизации и формулировке общих выводов. Автором проведен комплекс исследований по разработке методик изолирования, идентификации, количественного определения бупивакаина в биологических объектах.
Соответствие диссертации паспорту научной специальности. Научные положения соответствуют формуле специальности 14.04.02 – «Фармацевтическая химия, фармакогнозия». Результаты проведенного исследования соответствуют пунктам 3 и 4 области исследования специальности.
Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано 14 научных работ, 4 из них в научных журналах, рекомендованных ВАК.
Связь задач исследований с проблемным планом фармацевтических наук.
Диссертационная работа выполнена по плану научно-исследовательских работ ГБОУ ВПО
«Ярославская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения
Российской Федерации (номер государственной регистрации 01201153123).
Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 161 странице печатного текста и состоит из введения, обзора литературы (1 глава), экспериментальной части (5 глав), общих выводов, списка литературы и приложения. Работа иллюстрирована 31 рисунком и 30 таблицами. Список литературы включает 179 источников, из них 95 на иностранных языках. В приложение включены акты внедрения и проект информационного письма «Химико-токсикологический анализ бупивакаина в моче капиллярным электрофорезом».
Аналитические методы исследования бупивакаина
По ФС 42-12541-02 «Бупивакаина гидрохлорид» для установления подлинности, доброкачественности и количественной оценки предусмотрены следующие испытания:
- снятие ИК спектра субстанции в таблетке с калия бромидом (0,7 мг препарата в 300 мг калия бромида) в области от 4000 до 400 см-1; - снятие УФ-спектра 0,05% раствора бупивакаина в 0,1 М растворе кислоты хлористоводородной в области от 240 до 290 нм;
- реакция на хлорид-ион;
- определение прозрачности и цветности раствора;
- определение значения рН 2% раствора;
- определение примеси 2,6-диметиланилина;
- определение влажности, содержания сульфатов и тяжелых металлов;
- испытания на бактериальные эндотоксины (для субстанций, предназначенных для приготовления инъекционных лекарственных форм) и микробиологическую чистоту;
- определение остаточных органических растворителей [49].
В литературе имеется значительное количество описаний методик, позволяющих провести качественный и количественный анализ бупивакаина с использованием современных физико-химических методов. Надежным в вопросе внутригрупповой идентификации бупивакаина и обнаружения специфических примесей оказался метод спектроскопии ЯМР`Н . Авторы проводили регистрацию спектров ЯМР`Н на спектрометре WH-90 фирмы «Брукер» (Германия) с рабочей частотой 90 Мгц при температуре 30 оС [31].
Хроматографические методы являются наиболее применяемыми в анализе бупивакаина. Карпенко Ю.Н. провела скриннинговые исследования ряда местных анестетиков, в том числе и бупивакаина, в тонком слое сорбента на пластинках «Силуфол». При этом оптимальными хроматографическими системами явились -диоксан: хлороформ: ацетон: 25% раствор аммиака (47,5: 45: 5: 2,5) и н-бутанол: этилацетат: хлороформ: 25% раствор аммиака (20: 20: 10: 0,5). Этим же автором предложена методика разделения 8 местноанестезирующих препаратов (анилокаин, лидокаин, тримекаин, бупивакаин, пиромекаин, дикаин, артикаин, кокаин) методом газожидкостной хроматографиина хроматографе «Кристалл 2000М». Выбранные условия (капиллярная колонка с фенилметилсилоксановой неподвижной фазойдлиной 30 м и внутренним диаметром 0,05 мм, температура детектора (ПИД) 200 С, температура детектора (ТИД) 280С, испарителя - 160 С, колонки - 100 С в течение 2 минут, подъем до200 С со скоростью 4 С/мин, выдержка при 200 С - 23 минуты; расходгазов (мл/мин): азот 30, водород 20, воздух 200, коэффициент деленияпотока газа-носителя 1:20, линейная скорость азота 32 см/сек, объемная скорость азота 1,4 мл/мин) позволили четко идентифицировать бупивакаин в присутствии других анестетиков [30].
Киричёк А.В. с соавторами использовали хроматографию в тонком слое сорбента для предварительного обнаружения бупивакаина, выделенного из ткани почки, печени, кишечника и желудка. Исследование проводилось на хроматографической пластине размером 10 х 10 см с закреплённым слоем СТХ-1А (Sorbifil) в системе метанол – 25% раствор гидроксида аммония (100:1,5). Пластинку проявляли в ультрафиолетовом свете при длине волны 254 и 365 нм, а также обрабатывали раствором подкисленного йодплатината. Для подтверждающего исследования был предложен метод газовой хроматографии с масс-спектрометрической детекцией (ГХ/МС). Анализ проводили на приборе 6890/5973N фирмы «AgilentTechnologies» (США), работавшем в режиме ионизации электронным ударом при 70 эВ и оборудованном капиллярной колонкой с неподвижной жидкой фазой HP-5MS длиной 30 м и внутренним диаметром 0,25 мкм [63].
В статье Дементьевой Н.Н. и Кулешовой М.И. сообщается о проведении Reynolds и Beckett определения бупивакаина методом газо-жидкостной хроматографии на насадочной колонке с неподвижной жидкой фазой SE-30 при 210о С [22].
Фармакопея США предлагает для количественного определения бупивакаина гидрохлорида инъекционного раствора, бупивакаина гидрохлорида инъекционного раствора в декстрозе, бупивакаина гидрохлорида и эпинефрина инъекционного раствора метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с УФ-детектором. Условия хроматографирования: подвижная фаза -фосфатный буфер, рН 6,8, колонка размером - 4 мм х 30 см, заполнена собрентом Ll, длине волны - 263 нм, скорость потока элюента – 2 мл/мин. Концентрацию анестетика рассчитывают методом внутреннего стандарта [66]. Для количественного определения бупивакаина O.W. Lan и соавт. использовали жидкостную экстракцию из подщелоченной плазмы крови н-гексаном с последующей газовой хроматографией (ГХ) на насадочной колонке размером 2,0 м х 2 мм с 3% W/WSP 2250 on ChromosorbW (80/10 mesh) и азот-селективным детектором. Чувствительность методики - 0,01 мг/мл, при объеме вводимой пробы 0,5 мл [133].
Метод газовой хроматографии может быть также применен для определения бупивакаина и лидокаина в плазме крови человека [173].
Газовая хроматография с масс-спектрометрией была использована для анализа пяти местных анестетиков, в том числе и бупивакаина, в плазме крови T. Watanabe с соавтр [157].
Капиллярная газовая хроматография может быть применена для анализа, как бупивакаина, так и его метаболитов в крови человека [102,146].
Определение бупивакаина при совместном присутствии ряда местных анестетиков (мепивакаин, лидокаин, прилокаин, тетракаин и др.) в крови и спинномозговой жидкости методом газовой хроматографии в режиме химической ионизации осуществили H. Hattori с соавтр. При этом предел детектирования для изучаемого анестетика находился в пределах 5 – 10 нг в исследуемом образце [122].
Жидкостная хроматография в сочетании с масс-спектрометрией была предложена A. Koehler с соавторами для количественного определения бупивакаина в сыворотке крови. Предел обнаружения составил 1,0 нг/мл [132].
Определения свободной концентрации бупивакаина в плазме крови после эпидуральной анестезии у новорожденных методом жидкостной хроматографии (ЖХ) с масс-спектрометрией осуществили M. Stumpe с соавтр. Чувствительность при этом составила 2,5 нг/мл [165].
С целью количественной оценки свободных концентраций ропивакаина и бупивакаина в плазме крови T. Arvidsson с соавтр. использовали ЖХ с обращенно-фазовой и ионно-обменной колонками. Анализ проводили прямым введением образцов плазмы крови, полученных после ультрафильтрации при длине волны 210 нм [85].
Ram N.Gupta с соавтр. разработали методику колоночной жидкостной хроматографии для определения бупивакаина и основных его метаболитов – дезбутилбупивакаина и 4`-гидрокисибупивакаина в сыворотке крови. Условия хроматографирования: подвижная фаза – смесь ацетонитрила и 10 мМ дигидрофосфата калия в соотношении 25:80, хроматографическая колонка, размером 150 х 4,6 мм, заполнена силикагелем, скорость потока 1,5 мл/мин, детектирование – 205 нм. Данная методика обладает высокой чувствительностью и селективностью для данных соединений, степень экстракции во всех случаях составила около 90% [120].
Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) является одним из основных в анализе исследуемого лекарственного вещества. Так, например, для изучения фармакокинетики бупивакаина при назначении терапевтических концентраций Wei-Wei Qin c соавт. использовали жидкофазное экстрагирование исследуемого анестетика из плазмы крови с последующим определением методом ВЭЖХ. Анализ проводили в следующих условиях: колонка – Kromosil ODS C18, подвижная фаза - смесь 30 мМ дигидрофосфата калия и ацетонитрила (63:37), рН 4,9, время анализа – 13 мин, детекция осуществлялась в диапазоне длин волн 210 – 290 нм [161].
Условия подготовки капилляра между анализами
При подготовке к работе капилляр обычно промывают раствором кислоты, водой и раствором щелочи. Цель первой операции заключается в удалении с поверхности примесей многовалентных катионов и первичном гидролизе силоксановых групп. Промывка водой способствует удалению кислоты и дальнейшему гидролизу поверхности. Щелочная промывка предназначена для удаления примесей, не реагирующих с кислотой, и максимальной диссоциации образовавшихся силанольных групп. Заключительная промывка водой имеет цель удалить из капилляра щелочь. Для того чтобы привести очищенную и подготовленную поверхность в равновесие с раствором ведущего электролита, капилляр промывают раствором ведущего электролита.
С целью получения стабильных величин времени миграции нами были разработаны условия промывки нового капилляра, которые заключались в последовательном применении следующих растворов:
1. 0,5 М раствора хлористоводородной кислоты – 30 минут.
2. Вода очищенная – 30 минут.
3. 0,5 М раствора натрия гидроксида – 30 минут.
4. Вода очищенная – 30 минут.
2.3.3.2. Условия подготовки капилляра между анализами
При последовательных анализах для сохранения постоянства времен миграции необходимо подбирать условия промывки. С этой целью нами были разработаны оптимальные условия промывки капилляра между анализами бупивакаина, позволившие получить электрофоретические параметры исследуемого вещества, характеризующиеся наименьшими коэффициентами вариации.
Промывка капилляра между первым и четвёртым анализами проводилась по полной схеме:
1. 0,5 М раствором хлористоводородной кислоты – 10 минут.
2. Водой очищенной – 10 минут.
3. 0,5 М раствором натрия гидроксида – 10 минут.
4. Водой очищенной – 10 минут.
5. Рабочий электролит (РЭ) – 10 минут.
6. Холостой электрофорез – 15 минут (положительный электрод со стороны введения РЭ, напряжение: +20 кВ).
Промывка капилляра между вторым и третьим анализами включала следующую короткую схему:
1. РЭ – 10 минут.
2. Холостой электрофорез – 15 минут (положительный электрод со стороны введения РЭ, напряжение: +20 кВ).
При проведении серии анализов бупивакаина, промывка капилляра осуществлялась путём последовательного повторения разработанных схем (полной и короткой).
Ведущий электролит должен иметь такую концентрацию, при которой электрическое сопротивление раствора в капилляре будет достаточно велико. В зависимости от концентрации электролитов в растворе пробы поведение компонентов при разрушении может несколько различаться. Если электропроводности ведущего электролита и пробы одинаковы, то падение напряжения на всей длине капилляра равномерно, и компоненты пробы равномерно перемещаются каждый с присущей ему скоростью. В этом случае на выходе капилляра ширина пика будет приблизительно равна ширине зоны пробы. Следовательно, эффективное разделение может быть достигнуто при введении возможно меньшего объема пробы, но для обеспечения необходимой чувствительности концентрация определяемых компонентов в пробе должна быть, возможно, выше.
В качестве рабочего электролита нами были выбраны: буферный раствор Бриттона-Робинсона, рН 2,3 и 20мМ раствор фосфорной кислоты. Буферный раствор Бриттона-Робинсона готовился путем смешивания уксусной, борной и о-фосфорной кислот в определенных соотношениях. При этом рН исходного раствора составляет 1,8, а достижение необходимых значений в диапазоне от 2,3 до 10,0 проводилось путем добавления 0,2 н раствора натрия гидроксида.
Приготовление 20 мМ раствор фосфорной кислоты осуществлялось путем смешивания определенных объемов водного раствора о-фосфорной кислоты, рН 1,8 и 0,2 н раствора натрия гидроксида.
Исследование биологического материала (ткани печени)
При судебно-химических (химико-токсикологических) и клинических лабораторных исследованиях при работе с биологическими объектами необходимо учитывать то, что на общее наблюдаемое время миграции (tm) исследуемых веществ могут оказывать влияние соэкстрактивные вещества. В данном случае важную роль играет природа и характер объекта, а также методика исследования. С целью изучения влияния соэкстрактивных веществ на идентификацию бупивакаина нами были поставлены опыты на модельных биологических смесях (кровь, моча, ткань печени).
Для исследования брали печень трупов людей, погибших от травм и подвергнутых судебно-медицинскому вскрытию. Нами был применен метод изолирования подкисленной водой. К 1 г мелкоизмельченной печени добавляли 7 мл раствора щавелевой кислоты, рН 2,0. Через 1 час смесь центрифугировали (6000 об/мин, 10 мин). Надосадочную жидкость сливали, добавляли 25% раствор гидроксида аммония до рН 10,0 по универсальной индикаторной бумаге (УИБ) и проводили экстракцию хлороформом (10 мл х 3). Эмульсию разрушали центрифугированием (6000 об/мин, 10 мин). Хлороформные экстракты отделяли через бумажный складчатый фильтр, предварительно смоченный растворителем, и оставляли для испарения при комнатной температуре. Сухие остатки растворяли в 1 мл РП.
Использовали мочу добровольцев, не принимавших лекарственные препараты в течение 1 месяца до отбора проб. К 1 мл мочи добавляли 4 мл буферного раствора Бриттона-Робинсона, рН 10,0 и проводили экстракцию хлороформом (5 мл х 3). Дальнейшее исследование осуществляли, как и при исследовании ткани печени. 4.1.3. Исследование крови
В опытах использовали кровь добровольцев, не принимавших лекарственные препараты в течение 1 месяца до отбора проб и стабилизированную цитратным антикоагулянтом (1:9).
К 1 мл крови добавляли 4 мл буферного раствора Бриттона – Робинсона, рН 10,0 и проводили экстракцию хлороформом (5 мл х 3). Дальнейшее исследование осуществляли, как и при исследовании ткани печени.
Для приготовления модельных биологических смесей использовали 0,01% стандартный раствор бупивакаина. К 0,1 мл данного раствора анестетика добавляли аликвоту стандартного раствора маркера ЭОП – бензилового спирта с концентрацией 10 мкг/мл и растворы сухих остатков в РП (полученных после исследования печени, мочи и крови) до общего объема 1 мл.
Полученные модельные биологические смеси использовали для исследования методом КЭ согласно разработанной методике (п. 3.2.1.).
Идентификация бупивакаина в присутствии соэкстрактивных веществ биологических объектов по электрофоретическим спектрам и исправленному времени миграцииметодом капиллярного электрофореза
Обработку полученных ЭФГ осуществляли так, как описано в п. 3.1.2.. Результаты исследований представлены в таблице 4.1–4.2 и на рисунках 4.1–4.3.
Полученные данные свидетельствуют о том, что соэкстрактивные вещества не оказывают существенного влияния на значения tи и ЭФС-профиль исследуемого анестетика.Для определения чувствительности методики идентификации бупивакаина по ЭФС и tив присутствии соэктрактивных веществ биологических объектов к полученным реэктрактам (п. 4.1.1., 4.1.2., 4.1.3.)вносили аликвоты стандартного раствора исследуемого анестетика с содержанием 10 и ниже мкг вещества в пробе, и маркер ЭОП – бензиловый спирт с концентрацией 10 мкг/мл. Электрофоретическое исследование осуществляли согласно разработанным ранее условиям (п. 2.3.7.). Результаты исследований представлены в таблице 4.4.Согласно полученным данным, чувствительность ЭФС-идентификации бупивакаина по tив присутствии соэктрактивных веществ биологических объектов мочи и крови составила 0,5 мкг, ткани печени – 1 мкг вещества в пробе.
a Количественное определение бупивакаина в биологических объектах (модельных биологических смесях) методом капиллярного электрофореза
Одним из наиболее сложных разделов судебно-химического (химико-токсикологического) и биофармацевтического анализов является обнаружение и определение лекарственных средств в биологических объектах. Сложность обуславливается необходимостью изолировать незначительные количества искомых соединений из биологического субстрата и трудностью их очистки от соэкстрактивных веществ. При этом методы определения бупивакаина для целей химико-токсикологической практики не разработаны, а также отсутствуют сведения об основных факторах, влияющих на степень экстракции анестетика. В связи с этим нами были проведены исследования по изучению влияния рН среды, природы и объема экстрагента, а также кратности экстрагирования на степень извлечения бупивакаина из водных растворов.
Изучение распределения бупивакаина в биологических средах и органах экспериментальных животных
Разработанные методики выделения, очистки, обнаружения и количественного определения бупивакаина методом КЭ были использованы для анализа на лабораторных животных (крысах) с целью изучения возможности ЭФС-идентификации и распределения анестетика в органах и тканях. Исследования проводились в соответствии с «Руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» (2005, 2012), Национальным стандартом Российской Федерации ГОСТ Р-53434-2009 «Принципы надлежащей лабораторной практики», Приказом Министерства здравоохранения и социального развития РФ от 23.08.2010 № 708н «Об утверждении Правил лабораторной практики», «Guide for the care and use of laboratory animals» (2011) [19,58,119].
Изучение распределения бупивакаина в биологических средах и органах экспериментальных животных
Опыты проводили на белых крысах в возрасте 1,0 – 2,0 месяца массой 265 – 360 г. Группе животных внутримышечно вводили максимально рекомендуемую терапевтическую концентрацию (2,72 мг/кг). Через 3 часа (время максимальной концентрации в крови) животных забивали путем декапитации. Для исследования проводили забор биологических жидкостей (моча, кровь) и внутренних органов (печень, почки, сердце, легкое, надпочечник и мышечная ткань с места введения). Кровь стабилизировали цитратным антикоагулянтом в соотношении 1:9. Из биожидкости получали плазму путем центрифугирования (10000 об/мин, 3 мин). В качестве контроля использовали биологические объекты группы крыс, которые содержались в тех же условиях, что и опытные животные.
Извлечение из тканей внутренних органов проводили с использованием извлекателя – раствора щавелевой кислоты, рН 2,0 с последующей экстракционной очисткой и количественным определением, согласно разработанным выше условиям. Изолирование анестетика из биологических жидкостей (моча, кровь, плазма) осуществляли прямым экстрагированием хлороформом при рН 10,0 (п.п. 4.2.3.2., 4.2.4.1.).
Данные по распределению бупивакаина в тканях экспериментальных животных представлены в таблице 5.1. Результаты, представленные в таблице 5.1, показали, что наибольшее количество анестетика содержится в плазме крови, моче и мышечной ткани с места введения, значительные количества также отмечены в ткани печени, сердца и легкого.
aИдентификация бупивакаина по электрофоретическим спектрам и исправленному времени миграции, выделенного из крови и тканей печени экспериментальных животных методом капиллярного электрофореза
Одну третью часть реэкстракта использовали для изучения возможности идентификации бупивакаина методом КЭ по ЭФС и tи. С этой целью к пробе добавляли аликовотурастворбензиловогоспирта - маркера ЭОП, с концентрацией 10 мкг/мл. Анализ и обработку ЭФГ проводили в соответствии с разработанной ранее методикой (п. 2.3.7.). На основании полученных величин tm и tи строили ЭФС спектры бупивакаина, выделенного из крови и тканей печени лабораторных животных и рассчитывали количественные характеристики (рКа) исследуемого основания.
Результаты исследования представлены на рисунках5.1 – 5.2 и втаблицах5.2 – 5.3.
Результаты исследований показали, что ЭФС-профили бупивакаина стандарта и бупивакаина, выделенного из крови и ткани печени экспериментальных животных практически совпадают, а рассчитанные количественные характеристики рКа идентичны рКабупивакаина-стандарта. С целью подтверждения анализа бупивакаина в объектах экспериментальных животных методом капиллярного электрофореза полученные реэкстракты были подвергнуты анализу методом газовой хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией (ГХ-МС). Исследование проводили на газовом хроматографе 6850 с масс-селективным детектором 5973 фирмы AgilentTechnologies в следующих условиях: температура испарителя – 280С, колонка – HP-5MS (диметилполисилоксан с 5% фенильных групп), газ носитель – гелий (1 мл/мин), температура термостата колонки – с 50С (1 мин) до 300С (10 мин), 25С/мин. Полученные данные, представленные на рисунках 5.3. и 5.4. свидетельствуют о том, что на всех хроматограммах был обнаружен пик исследуемого анестетика.
Похожие диссертации на Применение капиллярного электрофореза при исследовании бупивакаина в биологических объектах
