Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Современное состояние и перспективы исследований лекарственных растений, содержащих фенилпропаноиды 15
1.1 Фенилпропаноиды как класс химических соединений: определение, классификация, органическая связь с другими классами фенольных соединений, биосинтез и распространение в растительном мире 16
1.2 Фенилпропаноиды как ведущая группа соединений в химической стандартизации лекарственного растительного сырья и препаратов 27
1.3 Фенилпропаноиды как самостоятельный класс биологически активных соединений 48
1.3.1 Лекарственные растения и сырье, обладающие антиоксидантной и гепатопротекторной активностью 48
1.3.2 Лекарственные растения и сырье, обладающие иммуномодулирующей активностью 58
1.4 Обоснование перспективности разработки гепатопротекторных и иммуномодулирующих препаратов на основе лекарственного растительного сырья, содержащего фенилпропаноиды 75
1.4.1 Фенилпропаноиды - антиоксиданты 77
1.4.2 Фенилпропаноиды - иммунокорректоры 88
Глава 2 Характеристика объектов и методов исследования 98
2.1 Объекты исследования 98
2.2 Методы исследования 102
2.3 Данные изучения структуры и определения физико-химических констант выделенных соединений 107
Глава 3 Результаты изучения компонентного состава некоторых видов растительного сырья и разработка способов получения стандартных образцов веществ фенилпропаноидной природы 115
3.1 Silybiim marianum (L.) Gaertn 117
3.2 Syringa vulgaris L 125
3.3 Rhodiola species 131
3.4 Echinacea purpurea L 136
3.5. Melissa officinalis L 141
Глава 4 Изучение показателей качества гсо веществ и использование стандартных образцов в анализе сырья и лекарственных препаратов на основе фенилпропаноидов 147
4.1 ГСОсилибин 152
4.2 ГСО сирингин 159
4.3 ГСО розавин 165
4.4 Использование стандартных образцов веществ в анализе сырья и лекарственных препаратов, содержащих фенилпропаноиды 173
Глава 5 Технологические, аналитические и фармакологические исследования по разработке гепатопротекторных фитопрепаратов 183
5.1 Монопрепараты на основе расторопши пятнистой 187
5.2 Комплексный препарат «Силибохол» 197
5.3 Обсуждение результатов медико-биологических экспериментов 205
Глава 6 Технологические, аналитические и фармакологические исследования по разработке иммуномодулирующих и неиротропных фитопрепаратов 212
6.1 Лекарственные препараты на основе родиолы розовой 212.
6.2 Лекарственные средства на основе эхинацеи пурпурной 223
6.3. Лекарственные препараты на основе мелиссы лекарственной 232
6.4 Обсуждение результатов медико-биологических экспериментов 235
Заключение 243
Общие выводы 249
Литература 253
Приложения: 289
- Фенилпропаноиды как ведущая группа соединений в химической стандартизации лекарственного растительного сырья и препаратов
- Данные изучения структуры и определения физико-химических констант выделенных соединений
- Использование стандартных образцов веществ в анализе сырья и лекарственных препаратов, содержащих фенилпропаноиды
- Комплексный препарат «Силибохол»
Введение к работе
Актуальность. В ассортименте гепатопротекторных и иммуномодулирующих лекарственных средств значительное место занимают фитопрепараты, использующиеся для лечения целого ряда заболеваний, обусловленных или имеющих следствием ослабление эндогенной антиоксидантной защиты, вторичные иммунодефицитные состояния, соответствующие сдвиги в системе гомеостаза. При анализе ситуации на современном фармацевтическом рынке РФ, с одной стороны, для указанных фармакотерапевтических групп очевиден перевес в пользу дорогостоящих импортных препаратов (в том числе на основе расторопши пятнистой, эхинацеи пурпурной, мелиссы лекарственной), с другой, - не в полней мере реализован потенциал используемых растений, что сказывается на эффективности выпускаемых лекарственных препаратов. Последнее обстоятельство, как правило, связано с некорректным выбором целевой группы веществ, с недостаточно полными данными по составу и физико-химическим свойствам извлекаемых соединений, и, соответственно, нерациональной технологией их получения, а на этапе оценки качества продукции - с отсутствием объективных и унифицированных методик анализа. Комплекс обсуждаемых проблем для ряда лекарственных растений, на наш взгляд, замыкается на недооценке значимости фенилпропаноидов как в плане стандартизации сырья и лекарственных препаратов, так и в отношении трактовки вклада данных соединений в фармакологическую активность.
К моменту начала собственных исследований в литературе в недостаточной мере были освещены в сравнительном плане фитохимические и аналитические аспекты изучения фенилпропаноидов, не было сформировано цельное представление о них, как о самостоятельном классе биологически активных соединений (БАС) с позиций зависимостей в ряду: химическая структура – фармакологическое действие. В частности, тонизирующая и адаптогенная активность препаратов родиолы розовой (экстракт жидкий) связывались только с содержанием простых фенольных соединений – салидрозида и его агликона тирозола. При создании препаратов расторопши пятнистой (карсил, легалон, силимар, силибор, силибинин…) отечественные и зарубежные ученые ориентировались на получение и использование в качестве лекарственной субстанции силимарина - очищенной суммы трех доминирующих флаволигнанов растения. Однако известно, что все флаволигнаны (описано более 20) обладают гепатопротекторной активностью, а нативный комплекс соединений, по результатам наших исследований, - превосходит силимарин по влиянию на ферментативные и неферментативные звенья антиоксидантной защиты. Ценное лекарственное растение мелисса лекарственная рассматривалась преимущественно с позиций седативной активности терпеноидного комплекса, тогда как фенольные соединения (фенилпропаноиды и флавоноиды) в аспекте решения вопросов стандартизации и разработки лекарственных препаратов, глубоко не исследовалась. На сегодняшний день в отечественной нормативной документации (НД) заложено определение экстрактивных веществ и разрешен к применению только настой (за рубежом мелисса входит в состав более 300 лекарственных препаратов). Существует и ряд других примеров, иллюстрирующих необходимость дальнейших исследований в выбранном направлении.
В этой связи представляется целесообразным пересмотр подходов к использованию известных лекарственных растений и поиску новых сырьевых источников с позиции содержания в них фенилпропаноидов. В частности, социально значимой является разработка эффективных и безопасных импортозамещающих препаратов с гепатопротекторным и иммуномодулирующим действием. В свою очередь, создание качественной продукции требует решения ряда вопросов: систематизация и восполнение неполных, иногда противоречивых данных по содержанию фенилпропаноидов в ЛРС, определение ведущей и анализируемой группы БАС в отношении рассматриваемого класса, разработка на этой основе объективных и унифицированных методик анализа растительного сырья и лекарственных препаратов, совершенствование НД.
Таким образом, исследования по теме диссертации являются актуальными для современной фармации.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является комплексное исследование ряда лекарственных растений, содержащих фенилпропаноиды, как перспективных сырьевых источников для получения гепатопротекторных и иммуномодулирующих препаратов.
Для достижения этой цели решались следующие задачи:
-
Обоснование выделения фенилпропаноидов в самостоятельный класс биологически активных природных соединений.
-
Разработка подходов к поиску перспективных сырьевых источников на основе данных по химическому составу ЛРС, и в частности, по содержанию соединений фенилпропаноидной природы.
-
Развитие концепции определения ведущей группы БАС в отношении соединений фенилпропаноидной природы для эффективного решения проблем стандартизации.
-
Формирование принципов разработки стандартных образцов веществ фенилпропаноидной природы, способов их получения и изучения показателей качества.
-
Поиск оптимальных технологических решений при получении лекарственных препаратов, содержащих в качестве целевых веществ фенилпропаноиды.
-
Обоснование использования ЛРС, содержащего фенилпропаноиды, для получения иммуномодулирующих, антиоксидантных и гепатопротекторных препаратов на основе выявления зависимостей в ряду: «химическая структура соединения – биологическая активность» и «компонентный состав – фармакологическое действие».
-
Разработка нормативной документации (либо внесение изменений в имеющуюся НД) на изучаемые виды лекарственного растительного сырья, стандартные образцы веществ и фитопрепараты.
Научная новизна. Разработана концепция оценки перспективности лекарственных растений как сырьевых источников для получения гепатопротекторных и иммуномодулирующих препаратов, а также эффективных технологических подходов с точки зрения содержания фенилпропаноидов и возможности их получения.
На основании химических, физико-химических и фармакологических исследований доказано, что фенилпропаноиды являются самостоятельной группой природных БАС. Данные сравнительного изучения структуры и физико-химических свойств фенилпропаноидных соединений, выделенных из расторопши пятнистой, родиолы розовой, сирени обыкновенной, элеутерококка колючего, мелиссы лекарственной, эхинацеи пурпурной, позволили охарактеризовать группы производных коричных спиртов и коричных кислот по структурным особенностям, спектральным, хроматографическим и другим параметрам. Это послужило основой разработки единых подходов к обнаружению данных соединений в ЛРС и решению проблемы стандартизации.
На основе данных по химическому составу изучаемых видов ЛРС и с учетом подтвержденного (в ряде случаев - впервые выявленного) спектра фармакологической активности фенилпропаноидов обосновано их выделение в качестве ведущей группы и анализируемой группы БАС в стандартизации сырья и лекарственных препаратов из изучаемых растений.
По результатам структурных исследований и установлению физико-химических констант, с учетом данных по уровню содержания БАС в сырье и их диагностическому значению предложены подходы к разработке веществ – стандартов фенилпропаноидной природы. В частности, обосновано использование силибина, розавина, сирингина в качестве ГСО и разработаны их показатели качества (по разделам описание, растворимость, подлинность, удельный показатель поглощения, температура плавления, угол вращения, содержание примесей, потеря в массе при высушивании), включенные в нормативную документацию.
Для класса фенилпропаноидов даны рекомендации по получению веществ – стандартов, заключающиеся для кристаллических соединений на основе коричных спиртов (ГСО силибина, розавина, сирингина) в препаративном хроматографическом разделении водно-спиртовых извлечений из сырья в варианте колоночной адсорбционной хроматографии и рехроматографии на силикагеле и полиамиде с последующей кристаллизацией и перекристаллизацией из соответствующих растворителей; в случае некристаллических соединений (РСО цикориевая и розмариновая кислота) - целесообразно дополнительное использование сефадекса LH-20.
При разработке высокоэффективных гепатопротекторных и иммуномодулирующих фитопрепаратов на основе изучаемых видов растений предложено ориентироваться на извлечение нативного комплекса соединений и считать целевой группой БАС фенилпропаноиды и их производные (лигнаны, неолигнаны, флаволигнаны и др.). Предложены оригинальные технологические способы получения экстракционных препаратов на основе ЛРС расторопши пятнистой, родиолы розовой, эхинацеи пурпурной, мелиссы лекарственной и некоторых других растений (Патенты РФ на изобретения № 2102999, № 2133620, № 2134584, № 2139724, № 2155071, № 2209063, № 2139722, № 2147223, № 2155054, № 2185843).
Детальное изучение структуры индивидуальных фенилпропаноидных соединений, выделенных из рассматриваемых видов ЛРС, и соотнесение вклада производных коричных спиртов и коричных кислот как группы в целом, так и для отдельных (доминирующих) представителей в формирование фармакологической активности позволили выявить некоторые аспекты в зависимости «компонентный состав – фармакологическое действие» и «химическая структура соединения - биологическая активность». Для всех изученных фитосубстанций и индивидуальных соединений фенилпропаноидной природы установлено антиоксидантное и иммуномодулирующее действие. При этом лидером по антиоксидантной активности являются флаволигнаны расторопши пятнистой, а по влиянию на иммунный ответ - фенилпропаноиды эхинацеи пурпурной. Спектр нейротропной активности фенилпропаноидов различен для производных коричных спиртов и производных гидроксикоричных кислот: в частности, первая группа, представленная гликозидами коричного, п-кумарового и синапового спирта, обладает выраженными тонизирующими свойствами, тогда как для второй группы (производные кофейной кислоты) - они не характерны. Установленный характер фармакологической активности доказывает целесообразность использования новых фитопрепаратов с целью усиления адаптационных возможностей, повышения неспецифической и специфической (иммунной) сопротивляемости организма и позволяет варьировать стратегию назначения фитопрепаратов с учетом выявленных особенностей.
Практическая значимость. Объем выполненных исследований доказывает приоритетность оценки вклада фенилпропаноидов при создании гепатопротекторных и иммуномодулирующих фитопрепаратов и решении вопросов стандартизации как уже известных растений, так и при поиске новых сырьевых источников.
На основе сложившегося системного подхода к изучению и использованию ЛРС, содержащего фенилпропаноиды, разработаны эффективные иммуномодулирующие и гепатопротекторные препараты, обладающие также нейротропными и адаптогенными свойствами: “Эхинацеи пурпурной настойка”, “Эхинацеи экстракт жидкий”, “Родиолы розовой настойка”, “Расторопши экстракт жидкий”, комплексный препарат “Силибохол”, “Мелиссы настойка”, “Мелиссы экстракт жидкий”, “Сирени настойка”, а также лекарственные формы на их основе (сироп и фитопленка).
Результаты фитохимических исследований и, в частности, изучение физико-химических свойств индивидуальных соединений - производных коричных спиртов и коричных кислот позволили в соответствии с современными требованиями подойти к обоснованию аналитических подходов в решении проблемы стандартизации изучаемых видов ЛРС и лекарственных препаратов на их основе. Разработаны объективные и унифицированные методики качественного и количественного анализа с применением ТСХ, ВЭЖХ, УФ-спектрометрии и использованием стандартных образцов веществ фенилпропаноидной природы:
контроль качества сырья и лекарственных препаратов на основе родиолы розовой, элеутерококка колючего и сирени обыкновенной предложено проводить по доминирующей группе БАС - циннамилгликозидам с использованием ГСО розавина для сырья и фитопрепаратов р. розовой и ГСО сирингина (элеутерозид В) для сырья и лекарственных препаратов элеутерококка и сирени: качественный ТСХ – анализ и количественное определение розавина и сирингина методами хроматоспектрофотометрии и ВЭЖХ.
в нормативную документацию на сырье и лекарственные препараты эхинацеи пурпурной и мелиссы лекарственной включено качественное и количественное определение содержания производных кофейной кислоты: ТСХ-анализ и спектрофотометрическое определение суммы фенилпропаноидов в пересчете на цикориевую и розмариновую кислоты соответственно;
для плодов расторопши пятнистой (нативных и обезжиренных) и лекарственного препарата «Экстракт расторопши жидкий» разработаны методики качественного и количественного определения содержания флаволигнанов с использованием ГСО силибина, который также предложен в качестве вещества-стандарта для анализа комплексного лекарственного препарата «Силибохол» (составная часть препарата - лекарственная субстанция «экстракт расторопши жидкий»): качественная оценка проводится с помощью ТСХ-анализа и подтверждается характерным УФ-спектром, количественное определение предусматривает прямое спектрофотометрическое определение суммы флаволигнанов (для «Силибохола» - флавоноидов) в пересчете на силибин, для сырья и монопрепаратов расторопши - дополнительно ВЭЖХ-анализ.
Результаты внедрения. Разработана и утверждена следующая нормативная документация: ФС 42-0072-01 “Силибин - стандартный образец”, ФС 42-0071-01 “Розавин - стандартный образец”, вошедшие в Государственный реестр лекарственных средств РФ (2004 г.); материалы исследований ранее были использованы при подготовке ВФС 42-2088-92 “Сирингин - стандартный образец”; ВФС 42-3380-99 «Плоды расторопши пятнистой», ВФС 42-3334-99 «Родиолы розовой настойка», ВФС 42-3382-99 «Эхинацеи пурпурной настойка», ВФС 42-3381-99 «Расторопши экстракт жидкий». Включены в действующую НД “Изменение № 1 к ФС 75 Государственной фармакопеи XI издания “Корневища и корни родиолы розовой”, “Изменение № 1 к ФС “Экстракт родиолы жидкий”, а также подготовлен и передан на рассмотрение в Фармакопейный Государственный комитет проект «Изменение № 1 к ФС 42-3645-98 «Трава мелиссы лекарственной». Приняты к рассмотрению в Научном центре экспертизы и государственного контроля лекарственных средств проект ФС «Расторопши плоды», проект ФС «Родиолы розовой корневища и корни», проект ФС «Сирени кора» и проект изменений и дополнений к ВФС 42-2371-94 «Трава эхинацеи пурпурной» для включения в XII издание Российской государственной фармакопеи, а также проекты ФСП на лекарственные препараты «Силибохол», «Расторопши настойка», «Эхинацеи экстракт жидкий», «Мелиссы настойка».
Публикации. Основное содержание диссертации опубликовано в 50 научных работах, 10 патентах на изобретение РФ, 4-х учебно-методических пособиях и монографии «Фенилпропаноиды лекарственных растений».
Апробация работы. Материалы работы доложены и обсуждены на различных региональных, Всесоюзных, Всероссийских и международных конференциях, в том числе на I Международном симпозиуме “Новые и нетрадиционные растения и перспективы их практического использования” (Пущино, 1995), на II - ХI Международной научно-практической конференции “Экология и здоровье человека” (Самара,1995 – 2006 гг.), на II, III, X Российском национальном конгрессе “Человек и лекарство” (Москва, 1996, 1997, 2004 гг.), на 2-ом Национальном конгрессе Российской Ассоциации Аллергологов и Клинических Иммунологов (РААКИ) (Москва, 1998), на 8-ой Российской конференции «Гепатология сегодня» (Москва, 2003), на 2-ом Международном симпозиуме по химии природных соединений (Турция, 1996), на 22-ой Международной конференции по полифенольным соединениям (Финляндия, 2004).
Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтической науки. Диссертационная работа выполнена в соответствии с тематическим планом научно-исследовательских работ ГОУ ВПО «СамГМУ Росздрава» (№ Гос. регистрации 01200202299), с Республиканскими программами Минздравсоцразвития РФ “Совершенствование лекарственного обеспечения населения и лечебно-профилактических учреждений в рыночных условиях” по теме: “Создание лекарственных средств природного происхождения антимикробного, адаптогенного и гепатопротекторного действия” (№ Гос. регистрации 01990005277) и «Создание и стандартизация фитопрепаратов на основе фенилпропаноидов и флавоноидов» (№ Государственной регистрации 01990007536), а также в рамках основных научных проблем Межведомственного Научного Совета по биотехнологии РАМН по направлению ПК.28.01 “Разработка новых лекарственных средств с помощью современных методов и создание биомедицинской технологии коррекции состояний организма”.
Положения, выдвигаемые на защиту:
-
Обоснование выделения фенилпропаноидов в самостоятельный класс природных биологически активных соединений на основании данных структурных исследований, изучения физико-химических свойств, биологической активности.
-
Теоретическое и экспериментальное обоснование рассмотрения лекарственных растений, содержащих фенилпропаноиды в качестве доминирующей группы соединений (одной из доминирующих), как перспективных сырьевых источников для получения гепатопротекторных и иммуномодулирующих препаратов.
-
Результаты исследований фенилпропаноидов как ведущей и анализируемой группы БАС в оценке показателей качества сырья и фитопрепаратов, пути решения проблемы стандартизации с позиций унификации методик качественного и количественного анализа и использования веществ - стандартов.
-
Принципы разработки веществ – стандартов фенилпропаноидной природы, относящихся к группам коричных спиртов (ГСО силибин, розавин, сирингин) и коричных кислот (РСО розмариновая и цикориевая кислота), подходы к способам получения, изучению показателей качества и методам их оценки.
-
Данные по разработке рациональной технологии получения экстракционных (галеновых) препаратов на основе рассмотрения фенилпропаноидов и их производных в качестве целевой группы веществ (на примере способов получения и стандартизации фитопрепаратов «Расторопши экстракт жидкий», «Силибохол», «Родиолы розовой настойка», «Эхинацеи пурпурной настойка», «Мелиссы настойка»).
-
Результаты изучения зависимости в ряду: «химическая структура - фармакологический эффект» для класса фенилпропаноидов как основа создания эффективных гепатопротекторных и иммуномодулирующих препаратов.
-
Подходы к разработке и совершенствованию нормативной документации на ЛРС и лекарственные препараты, содержание фенилпропаноиды.
Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 288 страницах машинописного текста, содержит 37 таблиц, 35 рисунков, список литературы, включающий 311 ссылок, в том числе 158 - на иностранных языках. Диссертация состоит из введения, 6 глав, выводов и приложений.
Фенилпропаноиды как ведущая группа соединений в химической стандартизации лекарственного растительного сырья и препаратов
В отношении рассматриваемых в настоящей работе растений, необходимо отметить, что на сегодняшний день их потенциал раскрыт и востребован далеко не в полной мере, что связано с рядом факторов: необходимостью совершенствования методов стандартизации лекарственного растительного сырья (ЛРС) - лекарственных субстанций - лекарственных форм, разработкой или доработкой нормативной (НД) и технологической документацией (ТД) на сырье и фитопродукцию в соответствии с современными фармакопейными требованиями к качеству (А.П. Арзамасцев.., 2000; В.Л. Багирова.., 2001); выбором целевых групп БАС, отвечающих за фармакологическую активность препаратов, способов их извлечения и ряд других направлений [6,9,27,28].
Решение этих актуальных вопросов требует фундаментального исследования химического состава ЛРС, изучения биологической активности соединений, выявления зависимостей структура, физико-химические свойства вещества - биологическая активность и компонентный состав - фармакологическое действие, научного обоснования выбора в пользу той или иной группы соединений (индивидуальных веществ) при анализе лекарственных растений, содержащих несколько групп БАС [2,8,12,44,89,132,135]. Такая группа соединений, по предложению профессора В.А. Куркина, получила название «Ведущая группа биологически активных соединений» [40,72,75,228,229,282,283].
Ведущая группа БАС - вещества, наиболее уязвимые (подверженные деструкции) с точки зрения фармакогнозии на всех стадиях технологического процесса (сбор, сушка, хранение сырья, получение препаратов), т.е. от «грядки» до лекарственной формы [37,39,71]. Термин используется в значении «ведет в анализе», в идеале - ведущая группа становится анализируемой и позволяет объективно оценить качество сырья и фитопрепаратов по разделам «качественный анализ» и «количественное определение». Но не всегда это возможно, как например, в случае с мелиссой лекарственной.
Правильный выбор ведущей группы соединений, на наш взгляд, является отправной точкой в разработке объективных методов стандартизации, обеспечивающих возможность получения сырья и лекарственных препаратов высокого качества.
Кроме того, залогом успешного решения проблемы химической стандартизации нам также видится соблюдение принципа системного подхода, предложенного профессором И.А. Самылиной (1994-1996 гг.), заключающегося в унификации методик анализа в ряду лекарственное растительное сырье - лекарственная субстанция - лекформа [124,125].
Многолетние исследования, проведенные нами по проблеме химической стандартизации ЛРС некоторых видов растений, содержащих производные коричных спиртов и кислот, позволили выработать единые методологические подходы в оценке показателей качества сырья и лекарственных препаратов с позиций определения ведущей группы БАС [39,40,41,47,53,92,146,309].
Рассмотрим некоторые варианты решения обсуждаемых проблем. Echinacea purpurea (L.) Moench., сем. Asteraceae хинацея пурпурная, пожалуй, самое популярное растение рода Эхинацея (Echinacea L., сем. сложноцветных или астровых - Asteraceae), объединяющего пять видов. На второе место по популярности можно поставить эхинацею узколистную - Echinacea angustifolia DC, имеющую близкий химический состав с основным объектом наших исследований. Эти растения пришли к нам из зарубежной народной и научной медицины. В настоящее время они широко культивируются в Европе как декоративные растения, надземная часть и корневища данных видов применяются в медицинской практике в качестве иммуномодулирующих, антимикробных, общеукрепляющих лекарственных средств. Основные систематические исследования химического состава эхинацеи пурпуной осуществлены в немецкими учеными [170].
По данным литературы и результатам наших исследований, в состав эхинацеи входят различные классы химических соединений: полисахариды, фенольные соединения: производные кофейной кислоты (содержание цико-риевой кислоты в соцветиях и листьях 0,6-2,1 %, в стеблях и корнях значительно меньше), флавоноиды, дубильные вещества пирокатехиновой природы (5,56-5,67 %), эфирные масла (0,01-0,24 %), ненасыщенные алкиламиды (изобутиламиды 0,0004-0,039 %), смолы, микроэлементы [45,144].
Данные изучения структуры и определения физико-химических констант выделенных соединений
Дегидросилибин. Кристаллы желтого цвета состава С25Н2оОю(М+ 480) с т. пл. 253-255 С (ЕЮН). УФ-спектр: Хтах 267, 365 нм. Н-ЯМР-спектр в дейтероацетоне (200 МГц): 12,15 (с, 5-ОН), 9,74 (уш. с, 7-ОН), 7,87 (д, 2,1 Гц, Н-21), 7,17 (дд, 8,3 и 2,1 Гц, Н-61), 7,8-6,9 (м, 4Н-Аг), 6,60 (д, 2,1 Гц, Н-8), 6.28 (д, 2,1 Гц, Н-6), 5,06 (д, 8,06 Гц, НА), 4,24 (м, Нв), 3,88 (с, ЗН, СН30), 3,80 (дд, 12,5 и 3,5 Гц, Нс), 3,55 (дд, 12, 5 и 4,3 и Гц, HD) (рис.5). 2. Силибин. Белые кристаллы состава С25Н22О10 (М+ 482) с т. пл. 164-166 С, [a]D + 10,8 (ацетон), УФ-спектр: Хтах 289, 325 (пл) нм. Н-ЯМР-спектр в дейтероацетоне при 50 (200 МГц): 11,70 (с, 5-ОН), 6,8-7,2 (м, 6Н-Аг), 5,96 (д, 2Н, 2 Гц, Н-6,8), 5,10 (д, 12 Гц, Н-2), 5,00 (д, 8 Гц, НД 4,60 (д, 12 Гц, Н-3), 4,1-4,2 (м, Нв), 3,3-3,8 (м, Нси HD), 3,85 (с, ЗН, СН30) (рис. 6). 3. Силидианин. Белые кристаллы состава С25Н22О10 (М 482) с т. пл. 188-191 С. УФ-спектр: л.тах 289, 325 (пл) нм. Н-ЯМР-спектр в дейтероацетоне (200 МГц): 11,76 (с, 5-ОН), 9,78 (уш. с, 7-ОН), 6,7-7,0 (м, ЗН-Аг), 6,30 (м, Н-61), 6,02 (уш. с, 2Н, Н-6,8), 4,92 (дд, 12 и 2 Гц, Н-2), 4,65 (дд, 12 и 3 Гц, Н-3), 4.29 (дд, 8 и 3,5 Гц, Нс), 3,78 (д, 8 Гц, HD), 3,75 (с, ЗН, СН30), 3,66 (дд, 4 и 2 Гц, Н-21), 3,42 (м, НА ), 3,28 (дд, 6 и 2,5 Гц, Н-51), 2,9 (м, Нв). 4. Силикристин. Кристаллы светло-желтого цвета состава С25Н22О10 (М+ 482) с т. пл. 173-175 С, [a]D + 207 (этанол). УФ-спектр: tmax 289, 326 (пл) нм. Н-ЯМР-спектр в дейтероацетоне (200 МГц): 11,86 (с, 5-ОН), 6,8-7,18 (м, 6Н Аг), 6,0 (д, Н, 2 Гц, Н-8), 5,96 (д, Н, 2 Гц, Н-6), 5,60 (д, 6,4 Гц, НА), (5,05, д, 11,5 Гц, Н-2), 4,65 (д, 11,5 Гц, Н-3), 4,1-4,3 (м, Нв), 3,5-3,8 (м, Нс и HD), 3,82 (с, ЗН, СН30) [2,77,78]. Соединения, выделенные из травы мелиссы лекарственной: 1. Кофейная кислота. Светло-желтые кристаллы состава С9Н8О4 с т.пл. 218-222 С (водный ацетон); УФ- спектр: А,тах- 217, 242, 326 нм. Масс-спектр при 100 С: М+180 (100%), 179(16), 163(31), 162(5), 135(16), 134(39), 123(7), 117(11), 89(15). Спектр ПМР в d-ацетоне (м.д.): 7.56 (д, 16 Гц, Нс), 7.20 (с, Н-2), 7.14 (д, 9 Гц, Н-6), 6.88 (д, 9 Гц, Н-5), 6.28 (д, 16 Гц, Нв). 2. Розмариновая кислота. Светло-желтое аморфное вещество состава Сі8Ні6Об; УФ- спектр: Ятах- 235, 242, 299 пл, 327 нм. Н-ЯМР-спектр в d-ацетоне (100 МГц, м.д.): 7.43 (д, 15.9 Гц, Н-7), 7.02 (д, 1.7 Гц, Н-2), 6.92 (дд, 1.7 и 8.2 Гц, Н-6), 6.77 (д, 8.2 Гц. Н-5), 6.73 (д, 1.8 Гц, Н-2 ), 6.66 (д, 8.06 Гц, Н-5 ), 6.57 (дд, 1.8 и 8.06 Гц, Н-6 ), 6.19 (д, 15.9 Гц. Н-8), 5.04 (кв, 4 и 8.6 Гц, Н-8 ), 2,95 (т, 8.6 Гц, Н-7 ). 3. Этиловый эфир розмариновой кислоты. Светло-желтое сиропообразное вещество состава СгоНгоОз; УФ- спектр: А,гаах- 235, 242, 299 пл, 326 нм. ПМР-спектр в d-ацетоне (100 МГц, м.д.): 7.62 (д, 16 Гц, Н-р), 7.22-6.60 (м; 6Н-Аг), 6.34 (д, 16 Гц, Н-а), 5.24 (т, 6 Гц, Н-а0, 4.20 (кв, 2Н -СН2СН3), 3.07 (т, 6 Гц -2Н-Р0, 1.28 (д, 6 Гц, ЗН, СН3-СН2-). 4. Хлорогеновая кислота. Светло-желтые кристаллы состава CieHigOgC Т.пл. 203-205 С; УФ- спектр: Хтах 243, 300 пл, 330. 5. Космосиин (7-0-р-0-глкжопиранозид апигенина). Кристаллы светло-желтого цвета состава С21Н20О10 с т.пл. 231-233С (водный спирт); УФ-спектр: А,тах- 269, 341 нм; +NaoAc 268, 394 нм. Масс-спектр: 270 (М аглико-на, 1005. 6. Цинарозид (7-0-р-В-глюкопиранозид лютеолина). Кристаллы светло-желтого цвета состава СгіНгоОц с т.пл. 232-234С (водный спирт); УФ-спектр: Л,тах- 257, 266 пл, 352 нм; +NaoAc 258, 268 (пл), 380 нм. Масс-спектр: 286 (М+ агликона, 100%). 7. Лютеолин. Желтые игольчатые кристаллы состава С НюОб с т.пл. 329-331С (хлф-этанол); УФ- спектр: Aax- 255, 267 пл, 352 нм. М 286. ПМР спектр в дейтероацетоне (100 МГц, м.д.): 12. 98 (с, 5-ОН), 7.52 (уш. с, Н-2 ), 6.44 (дд, 2 и 9 Гц, Н-6 ), 7.00 (д, 9 Гц, Н-5 ), 6.58 (с, Н-3), 6.53 (д, 2 Гц, Н-8), 6.26 (д, 2 Гц, Н-6). 8. Даукостерин (P-D-глюкозид р-ситостерина). Бесцветные кристаллы состава С35Нб0Об с т.пл. 315-317С (из смеси хлф-метанол, 1:1). Масс-спектр соединения содержит все характерные ионы, имеющиеся в спектре Р-ситостерина. Спектр ПМР : 2.4 (кв, Ш, =СН-СН2-), 4.2 (д, 7 Гц, H-I глюкозы), 2.9-3.7 (м, 7Н, 1Н агликона и 6Н глюкозы), 0.6-2.3 (м, 47Н). Кислотный гидролиз гликозида в жестких условиях (10% НС1 в течение 5 часов) приводит к образованию глюкозы и агликона, который идентичен р-ситостерину [147]. Соединения, выделенные из травы эхинацеи пурпурной: 1. Кофейная кислота. С9Н804. (М 180). Т. пл. 218-222 (водный ацетон), УФ: 247, 299, 327 нм. Масс-спектр при 100: М+ 180 (100), 163 (31), 152, 136. -ЯМР-спектр в дейтероацетоне (100 МГц, м.д.): 7.56 (д, 16 Гц, Н-7), 7.2 (с, Н-2), 7,14 (д, 9 Гц, Н-6), 6.88 (д, 9 Гц, Н-5), 6.28 (д, 16 Гц, Н-8). 2. Феруловая кислота. Ci0Hi0O4. (М 194). Т. пл. 168-170 (водный спирт), УФ: 242, 292, 324 нм. Н-ЯМР-спектр в дейтероацетоне (100 МГц, м.д.): 8.14 (д, 16 Гц, Н-7), 7.68 (д, 2 Гц, Н-6), 7,24 (дд, 2 и 9 Гц, Н-2), 6.98 (д, 9 Гц, Н-5), 6.90 (д, 16 Гц, Н-8), 3.80 (с, СН30).
Использование стандартных образцов веществ в анализе сырья и лекарственных препаратов, содержащих фенилпропаноиды
В соответствии с основной целью настоящей работы - разработка новых лекарственных средств на основе некоторых видов растений, содержащих фенилпропаноиды, выполнены исследования по решению проблемы химической стандартизации ЛРС, субстанций и лекарственных препаратов на основе расторопши пятнистой [Silybiim marianum (L.) Gaertn.], родиолы розовой {Rhodiola rosea L.), эхинацеи пурпуной [Echinacea purpurea (L.) Moench.], мелиссы лекарственной {Melissa officinalis L.), сирени обыкновенной (Syringa vulgaris L.), результаты чего в обобщенном виде представлены в данном разделе.
Указанные растительные источники послужили сырьем для создания целой серии экстракционных (галеновых) препаратов с иммуномодулирую-щими, гепатопротекторными, адаптогенными, нейротропными свойствами: "Родиолы розовой настойка", "Эхинацеи пурпурной настойка", "Расторопши экстракт жидкий", "Силибохол", "Мелиссы настойка", «Сирени настойка» и др. Данные лекарственные средства также могут использоваться и в качестве лекарственных субстанций, что было показано при их включении в обсуждаемом качестве в лекарственные формы сиропы и фитопленки, а также в случае экстракта расторопши жидкого - в состав комплексного препарата «Силибохол».
С учетом современных требований, предъявляемых к галеновым препаратам [8,12,50,89,124] при разработке разделов «Подлинность» («Качественные реакции») и «Количественное определение» были использованы соот-ветстующие ГСО и РСО веществ (Приложение 4).
Для нативных плодов расторопши пятнистой, обезжиренных шрота и жома плодов, для экстракционных препаратов - настойка расторопши и жидкий экстракт (под названием «просилибохол - 1» входит в качестве лекарственной субстанции наряду с суммарным экстрактом «просилибохол - 2» в комплексный препарат «Силибохол») предложены унифицированные методики анализа в ряду: сырье-субстанция-препарат, основанные на определении основных БАС - флаволигнанов, отвечающих за гепатопротекторную активность расторопши. При этом нами ранее обоснована целесообразность использования в анализе ГСО силибина. Для качественной оценки предложен ТСХ-анализ. Методика количественного определения суммы флаволигнанов в пересчете на ГСО силибин (в случае силибохола - сумма флавонои-дов в пересчете на ГСО силибин) проводится с использованием прямой спектрофотометрии - метод 1 или ВЭЖХ-анализа - метод 2.
Качественный анализ. Определение подлинности ЛРС и принадлежности анализируемых образцов к хеморасе (силибиновая, силидианиновая) предложено проводить методом ТСХ на пластинках "Силуфол УФ 254" в системе циклогексан-ацетонитрил 6:4.
Для идентификации флаволигнанов были использованы в качестве свидетелей ГСО силибин (Sb) и достоверно известные образцы 2,3-дегидросилибина (d-SB), силидианина (Sd) и силикристина (Sk). При облучении УФ- светом (254 нм) указанные соединения в экстракте обнаруживаются в виде доминирующих пятен с яркой фиолетовой флуоресценцией. Величина Rf 2,3-дегидросилибина, силибина, силидианина и силикристина составляет 0.85, 0.8, 0.7, 0.6 соответственно.
Количественное определение. С целью совершенствования имеющихся подходов к анализу плодов расторопши пятнистой (ТУ 64-4-97-93), нами ранее предложены методики количественного определения флаволигнанов в нативном сырье и разработанном препарате "Расторопши экстракт жидкий" с использованием прямой спектрофотометрии (аналитическая длина волны 289 нм) и ВЭЖХ-анализа в условиях (с детекцией при 288 нм), приведенных на рис. 18, причем в обоих случаях предусмотрено применение ГСО сили бина.
Результаты исследований свидетельствуют о том, что данные, полученные на основе разработанных методик, коррелируют как по содержанию суммы флаволигнанов, так и по содержанию отдельных компонентов.
Анализ образцов пяти серий плодов расторопши, заготовленных в 1995-1998 гг. на промышленных плантациях в Самарской области, показал, что содержание суммы флаволигнанов колеблется в интервале 2,4 % -3,0 % и не опускается ниже 2,4 % (нижний предел содержания БАС по НД); в шроте и жоме плодов - отходах производства жирного масла (экстракция хладоном-12 и горячее прессование соответственно), как было установлено в ходе диссертационных исследований, содержание несколько выше: в среднем 2,8 % -3,2 %.
В этой связи в проекте ФС на «Расторопши пятнистой плоды» (Прило-" жение 2) нами заложены следующие показатели: сумма флаволигнанов в пересчете на силибин для необезжиренных цельных, измельченных плодов и порошка: не менее 2,4 %; для обезжиренных измельченных плодов и порошка: не менее 2,6 %.
В экстракте расторопши жидком, полученном как из обезжиренных, так и из необезжиренных плодов расторопши, нормируемый предел содержания суммы флаволигнанов - 1,5 %, что включено нами в ВФС 42-3381-99 и соответствующий проект ФСП, находящийся на рассмотрении в Фармакопейном и Фармакологическом Государственных комитетах.
Комплексный препарат «Силибохол»
Методические подходы, выработанные нами при углубленном изучении химического состава расторопши пятнистой, солодки голой [2,68,77,91] и ряда других растений, позволили разработать комплексный препарат «Силибохол», в котором реализован подход направленной комбинации лекарственных субстанций для получения лекарственного средства с заданными свойствами (гепатопротекторный, желчегонный, иммуномодулирующий, спазмолитический, антимикробный, противовоспалительный и успокаивающий эффекты). Необходимость в данной разработке продиктована потребностью практического здравоохранения в препаратах для восстановления (структурного и функционального) печени и желчевыводящих путей у пациентов, в том числе с вирусными гепатитами. Спектр БАС лекарственного растительного сырья, включенного в пропись силибохола, позволяет решать не только проблемы гепатопротективной защиты - в основном за счет флаво-лигнанов расторопши пятнистой, но и благоприятно влиять на весь синдро-мо-комплекс со стороны желчевыводящеи системы и гастродуоденальнои зоны. Последнее обстоятельство обусловлено богатой гаммой соединений фенольной и терпеноидной природы, входящих в состав суммарного экстракта из 10 растений: корни солодки, листья березы, цветки календулы, травы мелиссы лекарственной, травы спорыша, трава череды, листья крапивы двудомной, плоды кориандра, цветки ромашки, трава тысячелистника.
Ранее, при изучении компонентного состава суммарного препарата были выделены доминирующие флаволигнаны (силибин, силидианин, силикри-стин, 2,3-дегидросилибин) и другие веществ, относящиеся к классам фе-нольных соединений (галловая кислота), флавоноидов и изофлавоноидов (рутин, авикулярин, кверцетин и др.), фенилпропаноидов (розмариновая кислота, кофейная кислота) и тритерпенов (глицирризиновая кислота); подтверждено наличие терпеноидов (хамазулен, линалоол и др.). Данные по химическому составу фитопрепарата «Силибохол» позволили предложить объ ективные методы контроля качества, а также разработать соответствующую нормативную и патентную документацию (Пат. РФ № 2139722).
Особого рассмотрения заслуживает введение ЛРС солодки голой в состав препарата. Технологическое обоснование по включению солодки в пропись основывается на высоком содержании в корнях солодки голой основного тритерпеноидного гликозида растения глицирризиновой кислоты. При введении в лекарственную форму данного соединения возрастает биодоступность препарата, что, по всей видимости, связано с процессами комплек-сообразования флаволигнанов с молекулами глицирризиновой кислоты. Образующийся за счет наличия в молекуле глицирризиновой кислоты гидрофильной (диглюкуроновой) и гидрофобной (тритерпеновой) частей комплекс обладает лучшей растворимостью в водных средах по сравнению с исходным компонентом. В нашем случае введение в пропись глицирризиновой кислоты позволило в несколько раз снизить дозу основного ингредиента и, как следствие, уменьшить токсичность препаратов, и кроме того, за счет ее со-любилизирующих свойств увеличить стабильность показателей качества при хранении. Кроме того, солодка усиливает антиоксидантную и иммуномоду-лирующую составляющую эффектов лекарственного препарата, в том числе за счет наличия изофлавоноидов формононетина и ононина; позволяет снизить концентрацию спирта этилового с 80 % в экстракте расторопши жидком (просилибохол - 1) до 65 % - 67 % в готовом продукте, что, в свою очередь, позволяет включить в пропись ЛРС другие растения (просилибохол-2), усиливающие и дополняющие основное гепатозащитное действие.
При получении "Расторопши экстракта жидкого" из обезжиренных плодов, также как и для нативных плодов, нами рекомендован 80 % спирт этиловый, что не приемлемо для эффективного извлечения более полярных БАС из остальных видов ЛРС, входящих в состав комбинированного препарата. Результатом проведения исследований по данному параметру и в отношении второй части прописи - просилибохола-2, в качестве оптимального экстра-гента был предложен 40 % спирт этиловый, который позволяет извлечь и фенольные соединения (фенилпропаноиды травы мелиссы, флавоноиды листьев березы, корня солодки, травы спорыша, каротиноиды цветков календулы), и терпеноидные соединения (эфирное масло травы мелиссы, листьев березы, цветков ромашки, плодов кориандра, тритерпеноидные гликозиды корня солодки, и в частности, глицирризиновую кислоту).
Для получения просилибохола-2, представляющего собой экстракт жидкий 1:2, мы остановили свой выбор на методе бисмацерации с делением указанного экстрагента на две равные части, причем второе настаивание предполагает термический режим для повышения эффективности экстракции (ранее нами предлагалось деление экстрагента на 3 неравные части 0.5:1:0.5 и мацерационными паузами: 24 ч при комнатной температуре, 24 ч при комнатной температуре, 6 ч при 60 С соответственно). Новая схема короче на 3 ч за счет сокращения времени термического настаивания: за это время эффективно доизвлекаются оставшиеся БАС после однократного настаивания при периодическом перемешивании в течение 48 ч (рис. 27).
Таким образом, предложен следующий способ получения просилибохо-ла-2: замачивание сырья трехкратным объемом 40 % спирта этилового на 24 ч (коэффициент поглощения — 3,0); настаивание при комнатной температуре одинарным весо-объемным количеством экстрагента в течение 48 ч; слив готовой продукции и отжим сырья; повторное термическое настаивание со второй равной порцией экстрагента в режиме - 3 ч при 60 С либо получасовое настаивание на кипящей водяной бане; слив готовой продукции и отжим отработанного сырья; отстаивание, фильтрация.
Для получения готового продукта "Силибохол" оптимальным является соотношение просилибохола-1 и просилибохола-2 (2:1). При смешивании лекарственных субстанций (тонкой струйкой при перемешивании 1 часть просилибохола-2 вливают в отмеренные 2 части просилибохола-1) происходит процесс смены растворителя, следствием чего является выпадение в осадок части полисахаридов цветков календулы, корней солодки и др. За 3.5-4.0 часа происходит частичное выпадение сопутствующих гидрофильных веществ. Увеличение временного интервала приводит к уменьшению содержания флаволигнанов и флавоноидов в готовом продукте из-за их адсорбции на образующемся осадке. Через 4 часа выпавшие в осадок гидрофильные вещества отфильтровывают - они являются отходами производства; полученный фильтрат - целевой продукт "Силибохол" (рис. 27).
![Получение и стандартизация органических солей магния и их таблетированных лекарственных препаратов [Электронный ресурс]](/i/i/4447/189958.png "Получение и стандартизация органических солей магния и их таблетированных лекарственных препаратов [Электронный ресурс] Григорян Ирина Валериковна")
