Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 11
1.1. Ботанико-географическая характеристика родов Corydalis DC. и Hydrastis L 11
1.2. Современное состояние исследований в области химии и биогенеза изохинолиновых алкалоидов 14
1.3. Фармакологическая активность изохинолиновых алкалоидов видов рода Corydalis DC. и Hydrastis L 27
1.4. Использование изохинолиновых алкалоидов в 30
медико-биологической практике 30
Выводы по главе 33
Глава 2. Объекты и методы исследования 35
2.1. Выбор объектов исследования. Сбор сырья и его идентификация 35
2.2. Биологические методы 37
2.3. Методы выделения, разделения и идентификации биологически активных веществ из исследуемых растений 37
ГЛАВА 3. Фитохимическое изучение исследуемых объектов 40
3.1. Определение алкалоидов 40
3.1.1. Выделение алкалоидов из клубней Corydalis marschalliana Pers. var. rosea-purpurea Rupr 40
3.1.2. Выделение алкалоидов из клубней Corydalis caucasica DC. var. albiflora Rupr 44
3.1.3. Выделение алкалоидов из травы Hydrastis canadensis L 47
3.1.4. Характеристика и идентификация выделенных алкалоидов
3.2. Определение флавоноидов 63
3.3. Определение аминокислот 65
3.4. Определение дубильных веществ 67
3.5. Определение смолистых веществ 67
3.6. Определение микроэлементов 68
3.7. Определение полисахаридов и продуктов их гидролиза
Выводы по главе 72
Глава 4. Изучение возможности культуры Hydrastis canadensis L. и Corydalis marschalliana Pers. var.roseo-purpurea и их биологические особенности 74
4.1 .Интродукция С. marschalliana var. rosea-purpurea Rupr 74
4.2. Опыт интродукции Н. canadensis на территории Северного Кавказа 80
Выводы по главе 86
Глава 5. Морфолого-анатомическая диагностика исследуемых объектов 87
5.1. Corydalis marschalliana var. roseo-purpurea Rupr 88
5.2. Corydalis caucasica DC. var. albiflora Rupr 100
5.3. Hydrastis canadensis L 108
Выводы по главе 116
ГЛАВА 6. Стандартизация сырьевых источников бульбокапнина и d-b-гидрастина 118
6.1. Разработка методики получения бульбокапнина 118
6.2. Разработка методики количественного определения бульбокапнина в сырье 121
6.3. Разработка методики получения P-D-гидрастина 124
6.4. Разработка методики количественного определения D-P-гидрастина в сырье 126
6.5. Определение числовых показателей исследуемого сырья 128
6.6. Фармакологические испытания P-D-гидрастина и бульбокапнина 129
Выводы по главе: 134
Общие выводы: 135
Литература
- Фармакологическая активность изохинолиновых алкалоидов видов рода Corydalis DC. и Hydrastis L
- Биологические методы
- Характеристика и идентификация выделенных алкалоидов
- Разработка методики получения P-D-гидрастина
Фармакологическая активность изохинолиновых алкалоидов видов рода Corydalis DC. и Hydrastis L
В 1937 году систематическим положением и подробной обработкой рода Corydalis занимался М.Г. Попов. Род был отнесен к подсемейству Fumarioideae в семействе Papaveraceae A.L. de Jussieu. В системе рода рассматривались два подрода: Capnites DC. и Capnoides DC. Для подрода Capnites DC. характерно то, что растения имеют клубневидный корень, листья чаще тройственные, реже перистые, семена с одной семядолей.
Растения, относящиеся к подроду Capnoides DC, имеют корень не клубневидной формы, листья чаще перистые, реже тройственные, семена имеют 2 семядоли [118].
Подробному ботаническому изучению представителей рода Corydalis посвящена диссертация М.А. Михайловой (1983). Измененная классификация рода выглядит следующим образом: подрод Capnites DC. состоит из 5 секций: Bulbo-capnos (Bernh.) W. Koch., Ceratotuber M.Pop., Dactylotuber Rupr., Leonticoides DC, Pes-gallinaceus Irmisch.; подрод Capnoides DC. состоит из 7 секций: Archae-opnos M. Pop., Bilobatae Mikhailova, Capnogorium (Bemh.) Irmisch, Chrysocapnos Wendelbo, Corydalis, Sophorocapnos Turcz., Strictae (Fedde) Wendelbo [67,68].
В настоящее время работы, посвященные систематическим исследованиям рода, проводятся шведским ученым М. Лиденом, который предлагает следующую систематику подрода Capnites DC: Corydalis, Radix-cava Irmisch., Leonicoides DC, Dactylotuber Rupr., Duplotuber Rupr. [175].
Что касается эволюции данного семейства, то по мнению известного ученого А.Л. Тахтаджяна семейство Fumariaceae произошло от травянистых Papav-eraceae [195]. В соцветиях представителей семейства Fumariaceae можно проследить переход от плейохазия к кисти, которая имеет более специализированные цветки [109]. Цветки этого семейства достигли более высокой степени специализации, они преимущественно билатеральные или зигоморфные [196]. Благодаря нектарным железкам, формирующимся у основания тычиночной нити, цветки приспособились к опылению при помощи пчел, шмелей и других перепончатокрылых [69,111].
Кариология. Полная характеристика рода Corydalis включает кариологиче-ские показатели. В разные годы этим занимались ученые Lawrence (1930), Negody (1940), Ownbey (1951), Ryberg (1960), Соколовская (1960), Жукова (1966) . Для рода Corydalis характерным является следующий набор хромосом: 2п= 12,16,24, 28, 32. Наиболее специфичным можно считать число - 16 , так как они встречаются у 18 из 32 изученных видов хохлаток [67,123].
География. Большинство представителей рода произрастает в северной умеренной зоне. На территории Российской Федерации распространение рода Corydalis простирается как на Дальний Восток, Сибирь, так и на Европейскую часть, Кавказ, Памиро-Алай [63,126]. На Северном Кавказе представители подрода Capnites DC произрастают в основном в лесах, на травянистых склонах, в нижнем поясе гор. Представители секции Dactylotuber Rupr. - в верхнем лесном, альпийском и субальпийском поясе, на каменистых склонах и осыпях [25,68]. Известно, что род Corydalis характеризуется значительным морфологическим разнообразием по окраске венчика. По мнению исследователей Насимови-ча Ю.А. и Романовой В.А., изучавших дихромизм Corydalis cava в подмосковных популяциях, механизм двуцветности предположительно связан с высокой частотой мутирования гена, контролирующего окраску венчика [72,138].
Интересными в этом плане являются разновидности в пределах видов C.marschalliana Pers. и С. caucasica DC. Полное ботаническое название С. marschalliana Pers., по данным свода дополнений и изменений к Флоре СССР, -С. bulbosa subsp. marschalliana Pers. [127]. Отличительной особенностью является то, что листовые дольки имеют продолговато - эллиптическую форму [31].
По окраске лепестков венчика выделяется разновидность - С. marschalliana Pers. var. rosea-purpurea Rupr., отличающаяся от типовой С. marschalliana Pers.var. marschalliana, имеющей желтые лепестки, розово-пурпурной окраской лепестков венчика [2,52,187].
Общее распространение - Балканы, Малая Азия, Иран. Распространение на территории нашей страны - Европейская часть, Кавказ: Предкавказье, Дагестан, в лесах от равнин до среднегорного пояса [86].
Хохлатка кавказская - С. caucasica DC, по данным свода дополнений и изменений к Флоре СССР, C.solida var. caucasica [127], многолетнее травянистое растение 10-20 см высотой, имеет отогнутый нижний чешуевидный лист [31], распространенное на Северном, Западном и Южном Кавказе, в Малой Азии, в лесах среди кустарников до среднегорного пояса [84,86].
У типовой С. caucasica DC. var. caucasica окраска лепестков венчика пурпурно-фиолетовая, а у разновидности - С. caucasica DC.var.albiflora Rupr. цветки белые [52]. В определителе флоры Северного Кавказа Галушко А.И. выносит эту разновидность в ранг вида и указывает, что он имеет высоту 15 см и белые цветки, а в остальном схож с С. caucasica DC. var. caucasica [25,77]. Род Hydrastis L. был впервые описан К. Линнеем в 1759 году. Ареал естественного произрастания рода распространяется на широколиственные леса Северной Америки и Канады. Некоторые систематики Tamura М. (1963), Ford В.А.(1997) относят этот род к семейству Ranunculaceae J. [162, 197]
Ряд авторов, в том числе Engler (1912), Wettstein (1935), перенесли род Hydrastis L. в семейство Berberidaceae, что обосновывалось морфологической близостью к Podophyleae и наличием диизохинолинового алкалоида - бербери-на. Наконец, Lemesle (1955), исходя из особенностей строения стебля, предложил выделить род Hydrastis L. в отдельное семейство Hydrastidaceae. Тахтад-жян установил в качестве законного это семейство и опубликовал его под названием Hydrastidaceae Lemesle ex Takhtajan. Hydrastis L. имеет семязачатки с двойным интегументом, внешний интегумент длиннее внутреннего, в отличие от представителей семейства Ranunculaceae [110,162].
Биологические методы
Более того, содержание основного алкалоида бульбокапнина в клубнях С. marschalliana var.roseo-purpurea Rupr. составляет 0,23%, а в клубнях С. marschal-liana var. marschalliana -0,18%.
Собранные в фазу цветения трава и клубни С. marschalliana var. marschalliana. экстрагировали смесью хлороформ - этанол (4:1), после чего подвергали хроматографическому анализу. Дальнейшие исследования проводились с использованием методом колоночной хроматографии в системе хлороформ - этанол (99:1) с целью получения p-D-гидрастина и бульбокапнина.
Нами изучались надземные и подземные органы разновидности в пределах вида Corydalis caucasica DC. 350 г высушенных и измельченных клубней С. caucasica var. albiflora предварительно обрабатывали раствором аммиака, оставляли на 2 часа и экстрагировали смесью хлороформ - этанол (4:1) в аппарате Сокслета в течение 15 часов. Из полученного извлечения экстрагент удаляли полностью и остаток обрабатывали 5%-ным раствором серной кислоты до отрицательной реакции с кремне-вольфрамовой кислотой.
Очистку солей алкалоидов осуществляли обработкой небольшими порциями диэтилового эфира (50:30:20мл). Очищенный сернокислый раствор обрабатывали 10%-ным раствором аммиака до рН=10, затем последовательно экстрагировали диэтиловым эфиром и хлороформом до отрицательной реакции на алкалоиды с 1%-ным раствором кремневольфрамовой кислоты (рис.2).
Из клубней С. caucasica var. albiflora, используя метод перекристаллизации и фракционирования на колонке с силикагелем, элюируя смесью растворителей бензол -этанол и хлороформ - этанол в различных соотношениях выделили фракции В2 (эфирная сумма) и Сг (хлороформная сумма). Схема выделения третичных и четвертичных алкалоидов из клубней Corydalis caucasica var. albiflora Rupr.
Вслед за диэтиловым эфиром маточник обрабатывали хлороформом до полного извлечения нефенольных оснований (реакция с 1%-ным раствором кремневольфрамовой кислоты) - фракция Сг (1,14 г).
Оставшийся после отделения третичных оснований маточник обрабатывали 2% раствором кислоты серной до рН=5 и добавляли насыщенный раствор йодида калия, после чего переносили полученный раствор в делительную воронку и исчерпывающе экстрагировали смесью растворителей хлороформ- этанол в соотношении (20:1). Смесь растворителей отгоняли, получая сумму четвертичных алкалоидов (фракция Ei).
Полученные фракции подвергали дальнейшему изучению с помощью восходящей тонкослойной хроматографии (система Si) на незакрепленном слое силикагеля марки КСК. После прохождения фронта пластинки вынимали из хроматографической камеры, высушивали под вытяжным шкафом и просматривали в УФ-свете, затем обрабатывали реактивом Драгендорфа или помещали в камеру с парами йода, при этом фиксировали расположение пятен.
Из фракции В2 выделили основание I (0,18 г), основание X (0,11 г), основание XI (0,31г), основание III (0,09г), основание VI (0,25г), основание VII (0,2г). Оставшийся слабощелочной раствор экстрагировали диэтиловым эфиром.
Из фракции Сг (хлороформная сумма) перекристаллизацией из этанола получили основание V (0,45г), затем из маточника на колонке промывая смесью хлороформ - этанол в различных соотношениях выделили основания II, XII, XIII.
Во фракции Ег обнаружены йодид основания 9, а в маточнике - йодиды основания IV, V и XIII. [98].
Таким образом, в клубнях С. caucasica var. albiflora хроматографически обнаружены 14 алкалоидов, из которых 10 выделены в индивидуальном состоянии. Сравнивая полученные результаты и данные литературы, можно еде 47 лать заключение, что разновидность С. caucasica var. albiflora отличается по алкалоидному составу от типовой С. caucasica var. caucasica, что представлено в таблице 9. Таблица 9. Алкалоидный состав С. caucasica var. albiflora Rupr. и С. caucasica var. caucasica. Тип алкалоида С. caucasica var. albiflora Rupr. С. caucasica var. caucasica. Апорфиновый БульбокапнинИзоболдинИзокоридинКоритуберинГлауцин Бульбокапнин Изоболдин Изокоридин Коридин Фталидизохинолиновый Бикукуллин Гидрастин Адлумидин Бикукуллин Гидрастин Протобербериновый Стилопин Хайлантифолин ИзокорипальминСтилопинХайлантифолинТетрагидропальматинСкулерин Протопиновый Протопин Аллокриптопин Протопин Аллокриптопин
Типовая С. caucasica var. caucasica значительно отличается от белоцвет-ковой разновидности по качественному составу протобербериновых и фталиди-зохинолиновых алкалоидов.
Измельченную воздушно-сухую надземную часть Н. canadensis массой 400 г обрабатывали 10 % раствором гидроксида аммония и алкалоиды - основания извлекали в аппарате Сокслета хлороформ - этанол (4:1). Выход суммы алкалоидов составляет 2,4 %. После удаления растворителя полученную сумму алкалоидов обрабатывали несколькими порциями 2% кислоты серной, и кислый раствор солей алкалоидов очищали диэтиловым эфиром (рис.3).
Характеристика и идентификация выделенных алкалоидов
Что касается С. marschalliana var. marschalliana, то следует отметить, что его флавоноидный состав представлен 2 гликозидами (а и б) и 1 агликоном (в), который имеет интенсивно-желтую окраску в УФ-свете и идентифицирован как кверцетин. При хроматографировании спиртовых экстрактов соцветий C.caucasica var. caucasica и C.caucasica var.albiflora Rupr. также обнаружены 2 гликозида (коричневое окрашивание в УФ-свете).
Кроме кверцетина в данных объектах проявляется и другой агликон (г), имеющий желто-зеленое окрашивание в УФ-свете, который по значениям Rf идентифицирован как кемпферол.
У С. caucasica var. caucasica, имеющей фиолетово-пурпурные лепестки ве-чика, обнаружено вещество антоциановой природы, окрашенное в видимом свете в розовый цвет. У белоцветковой C.caucasica var.albiflora Rupr. антоцианы отсутствуют.
У С. marschalliana var. roseo-purpurea Rupr. с розово - пурпурной окраской лепестков венчика обнаружены 1 вещество антоциановой природы, предположительно цианидин. У желтоцветковой типовой C.marschalliana var. marschalliana Rupr. веществ антоциановой природы не обнаружено.
Флавоноидный состав указанных растений изучен качественно. Установлено, что доминирующее соединение - кверцетин может служить характерным признаком для данных растений.
Аминокислоты являются основными компонентами практически всех процессов метаболизма, происходящих в растительном организме. В связи с этим, представлялось целесообразным изучение качественного состава и определения количественного содержания аминокислот в исследуемых объектах.
Для качественного обнаружения аминокислот использовали реакцию с нингидрином [121]. Определение аминокислотного состава проводили методом колоночной жидкостной хроматографии на аминокислотном анализаторе AAA 339М ( колонка ОСТИОН ЛГ АНБ диаметром 8 мм и длиной 35 мм). Условия хроматографирования: подвижная фаза раствор нингидрина с добавлением натрий лимоннокислого буфера при рН=2,2; скорость подачи элюента 15 мл в час; цикл хроматографирования - 120 минут. Параллельно хроматографировали стандартные образцы аминокислот. Качественный состав и количественное содержание аминоксилот в объектах исследования представлены в таблице 10.
Из таблицы видно, что в траве Corydalis marschalliana Pers.var.rosea-рифигеа Rupr. в значительном количестве находится глутаминовая кислота (34 г/кг), лизин (15,6 г/кг), аспарагиновая кислота (13,4 г/кг), аланин (13,6 г/кг). В траве Corydalis caucasica DC. var. albiflora Rupr кроме глутаминовой кислоты (17,4 г/кг) накапливается треонин (12,2 г/кг), аспарагиновая кислота 916,2 г/кг), лизин (11,5 г/кг), аланин (11,3 г/кг).
На основании полученных данных можно сделать заключение о том, что аминокислотный состав исследуемых объектов разнообразен, а их присутствие вполне логично, так как они принимают активное участие в биосинтезе алкалоидов и других биологически активных веществ растений.
Качественное обнаружение дубильных веществ в водных извлечениях проводили реакцией осаждения 1%-ным раствором желатины и 10% раствором соляной кислоты по появлению аморфного осадка, растворяющегося в избытке реактива.
Природу дубильных веществ определяли по реакции с железоаммоние-выми квасцами: черно-синее окрашивание свидетельствует о наличии в исследуемых объектах гидролизуемых дубильных веществ [17,38,119].
Количественное определение дубильных веществ проводили титриметри-ческим методом [28]. Установлено, что количественн j содержание дубильных веществ в исследуемых объектах соответствует: в траве Corydalis marschalliana Pers.var.rosea-purpurea Rupr. - 0,65±0,04%; в траве C.caucasica vur. albiflora -0,41±0,09%.
Для определения содержания смолистых веществ в траве и клубнях Corydalis marschalliana var. rosea-purpurea и Corydalis caucasica var.albiflora использовали гравиметрический метод [116]. Для исследования брали 10 г сухого, мелко измельченного сырья, помещали в предварительно взвешенную колбу и заливали 100 г 96 % этанола и экстрагировали в течение 2 часов. После охлаждения колбу с содержимым доводили до первоначального веса 96 % этанолом. Извлечение фильтровали. При нагревании на водяной бане (температура воды 65С) в колбу с сухим остатком прибавляли 15 мл воды, нагретой до той же температуры. Содержимое интенсивно перемешивали стеклянной папочкой, затем кол 68
бу быстро охлаждали и фильтровали. Эту операцию повторяли 3 раза, после чего нерастворимый остаток растворяли в 15 мл 96% этанола и фильтровали через тот же фильтр в предварительно взвешенную колбу. Фильтр промывали последовательно 15,10,5 мл горячего этанола. Спирт отгоняли, колбу со смолой высушивали в сушильном шкафу при температуре 70С до постоянной массы. Результаты определения смолистых веществ приведены в таблице 11.
Микроэлементы могут быть компонентами и активаторами ферментов, тем самым оказывая влияние на биосинтез и метаболизм различных биологически активных веществ. Такие элементы, как Си и Fe принимают активное участие в фотосинтезе, a Zn влияет на обмен фенольных соединений и алкалоидов [103,129]. Известно, что в алкалоидоносных растениях в наибольших количествах концентрируются 3-7 элементов, которые ответственны за процессы метаболизма алкалоидов. Существует определенная взаимосвязь между содержанием алкалоидов как сильных восстановителей, и соединений марганца как окислителей [56].
Исследование микроэлементного состава проводили после озоления изучаемых образцов сырья спектральным методом на спектрографе СТЭ-1. Результаты исследования приведены в таблице 12.
Разработка методики получения P-D-гидрастина
Целью настоящего исследования явилось изучение морфолого-анатомических признаков предлагаемых видов в качестве сырьевых источников медико-биологических реактивов - бульбокапнина и D-P-гидрастина, необходимых для установления их подлинности.
Для реализации поставленных задач использовали как свежие растения, так и высушенные образцы, предварительно просветленные в хлоралгидрате. Гистохимические реакции проводили соответствующими реактивами (глава 2).
Исследуемые виды принадлежат к разным секциям: С. marschal-liana Pers. относится к секции Radix-cava Irmisch. Виды этой секции произрастают в лесах Юго-Восточной Европы и Юго-Западной Азии. C.caucasica DC. относится к секции Pes-gallinaceus Irmisch., виды которой свойственны Евразии, где они обычно произрастают в горных или равнинных лесах. Это многолетние травы с ежегодно замещающимся клубнем, у которого в нижней части расположены придаточные корни, а стебель в нижней части несет чешуевидный лист.
Оба вида характеризуются разнообразием окраски венчика. Венчики C.caucasica DC. имеют розово-бордовую окраску, но иногда в пределах одной популяции встречается альбиносная форма - C.caucasica DC.var.albiflora Rupr., рассматриваемая, как уже было указано (глава 3) как разновидность или же хемораса. С. marschalliana Pers. характеризуется желтыми цветками, но нередко в пределах популяции встречаются розово-цветковые формы -разновидность С. marschalliana Pers. var. rosea-purpurea Rupr.
Как правило, растительное сырье, получаемое на основе этих видов, состоит из достаточно измельченной надземной вегетативной и подземной (клубневой) массы, поэтому нам представляется важным иметь диагностические критерии по оценке сырья. В качестве таких критериев были выбра 88 ны препараты поперечных срезов клубней, стеблей, черешков листьев, а также препараты верхней и нижней эпидермы листьев.
Многолетнее травянистое растение с клубнем округлой или неправильной формы, отмирающим изнутри, в результате чего в центре часто образуется полость. Придаточные корни отходят от всей поверхности клубня. Средний диаметр клубня 25мм. Стебли прямостоячие, в нижней части не имеют чешуевидного листа, высота от 20-35 см. Листья крупные, дважды тройчатые, что характерно для секций, представленных клубневыми растениями [118], дольки эллиптической или продолговато - удлиненной формы. Расположение двух боковых сегментов листа очередное (рис.21).
Соцветия верхушечные, кистевидные, состоят из 8-Ю цветков. Прицветники цельные, обратнояйцевидные, 10-18 мм длины, 4-6 мм ширины, цветоножки 3-4 мм длины. Цветки билатерально симметричные, обоеполые, с двойным околоцветником. Чашечка состоит из двух свободных пленчатых чашелистиков, которые имеют длину 2-3 мм. Венчик раздельнолепестный, из четырех розово-пурпурных лепестков, расположенных в два круга.
Наружные лепестки отличаются по строению т внутренних, верхний наружный лепесток образует шпору. Шпора с характерным изгибом на верхушке, слегка повислая (Рис.21). Внутренние лепестки слипаются верхушками. Андроцей из 6 тычинок с нектарниками, выступающими у основания тычиночной нити.
Гинецей состоит из двух сросшихся плодолистиков, паракарпный, рыльце уплощено в боковой плоскости. Плоды - вскрывающиеся многосеменные коробочки продолговатой формы, повислые, 15-17 мм длиной, 3-5 мм шириной, открывающиеся двумя створками. Семена округло-яйцевидной формы, черные, блестящие, 0,8-1,3 мм в диаметре. Морфологическое строение С. marschalliana Pers. var. rosea-purpurea Rupr.
Рис.21. A - Б. Внешний вид вегетативных и генеративных органов В. Лист; Г. Цветок; Д. Клубень. Растение по своим размерам значительно превышает типовую C.marschalliana var. marschalliana. Что касается анатомического строения, то следует отметить, что лист имеет типичное дорзовентральное строение. На поверхности листовой пластинки имеются редко расположенные трихомы в виде простых одноклеточных волосков. Эпидерма верхней и нижней сторон покрыта кутикулой. Палисадная ткань состоит из двух рядов плотно прижатых клеток. В губчатом мезофилле листа расположены достаточно крупные друзы оксалата кальция (рис.22) [95].
Поскольку форма и локализация кристаллических включений может быть видоспецифичной, то их можно использовать использовать при диагностике сырья [132].
Нижняя эпидерма представлена клетками с сильно извилистыми антиклинальными стенками. Многочисленные устьица аномоцитного типа, окружены 4-5 околоустьичными клетками. Клетки верхней эпидермы имеют менее извилистые антиклинальные стенки (Рис.23).
Черешок листа на поперечном сечении имеет вытянутую форму, с двумя характерными выступами на абаксиальной стороне. Под эпидермой формируется пластинчатая колленхима, состоящая из 4-7 слоев клеток. Хло-ренхима чередуется с колленхимой, представлена 5-8 слоями клеток изодиа-метричной формы. Проводящие пучки коллатерального типа в количестве от 5 до 7, имеют многослойную паренхимную обкладку, что является диагностическим признаком.
В центральной части находится лакуна, в нижней части центрального тройчатого сегмента листа количество проводящих пучков варьирует от 12 до 16 (рис.24).
Стебель в поперечном разрезе имеет округлые очертания, в диаметре 16-18 мм, в центре он полый, при основании стебля лакуна значительно уменьшается в диаметре. (Рис. 25). Эпидермальные клетки имеют утолщенные наружные стенки, покрыты кутикулой.
