Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Ботаническая и фармакогностическая характеристика сафлора красильного (обзор литературы)
1.1. Этимология названия растения и историческая справка
1.2. Ботаническое описание растения
1.3. Ареал, культивирование сафлора красильного .
1.4. Лекарственное растительное сырье
1.5. Заготовка и сушка сырья
1.6. Химический состав сырья и препаратов сафлора красильного
1.7. Применение в медицине
1.7.1. Применение цветков сафлора красильного .
1.7.2. Применение сафлорового масла
Выводы к главе 1 .
Глава 2. Объекты и методы исследования .
2.1. Объекты исследования
2.2. Методы исследования .
2.2.1. Методики анатомо-гистологического анализа .
2.2.2. Физические методы
2.2.3. Химические методы
2.2.3.1. Качественные реакции .
2.2.3.2. Кислотный гидролиз .
2.2.3.3. Ферментативный гидролиз .
2.2.4. Хроматографические методы .
2.2.4.1. Тонкослойная хроматография (ТСХ)
2.2.4.2. Адсорбционная жидкостная колоночная хроматография
2.2.4.3. Газожидкостаная хроматография (ГЖХ)
2.2.5. Спектральные методы .
2.2.5.1. Метод УФ-спектроскопии
2.2.5.2. 1Н-ЯМР-и масс-сп ектрометрия
2.2.6. Методы медико-биологических исследований .
2.2.6.1. Изучение острой токсичности
2.2.6.2. Изучение диуретической активности .
2.2.7. Технологические методы
2.2.8. Статистические методы
Глава 3. Морфолого-анатомическое исследование различных органов сафлора красильного
3.1. Изучение морфологических особенностей сафлора красильного, культивируемого в Самарской области .
3.2. Анатомо-гистологическое исследование подземной части сафлора красильного
3.3. Анатомо-гистологическое исследование стебля сафлора красильного
3.4. Анатомо-гистологическое исследование плода сафлоракрасильного
3.5. Анатомо-гистологическое исследование цветка сафлоракрасильного .Выводы к главе 3 596471
Глава 4. Фитохимическое исследование сафлора красильного
4.1. Фитохимическое сравнительное ТСХ - исследование различныхорганов сафлора красильного
4.2. Изучение флавоноидного состава надземной части сафлоракрасильного, культивируемого в Самарской области Выводы к главе 4 737476 83
Глава 5. Изучение жирно-кислотного состава жирного масла сафлора красильного .
5.1. Технология получения жирного масла из семян сафлоракрасильного
5.2. Определение физико-химических констант жирного масла сафлоракрасильного, культивируемого на территории Самарскойобласти 5.3. Изучение жирно-кислотного состава масла сафлора красильногометодом газовой хроматографии .Выводы к главе 5 84 848590 94
Глава 6. Исследования по стандартизации сырья и препаратов сафлора красильного
6.1. Разработка методики качественного анализа цветков сафлоракрасильного .
6.2. Разработка методики количественного анализа суммыфлавоноидов в цветках сафлора красильного
6.2.1. Подбор оптимальных условий экстракции
6.2.2. Методика количественного определения суммы флавоноидов вцветках сафлора красильного пересчете на сафлорозид .
6.2.3. Изучение динамики накопления флавоноидов в цветках сафлоракрасильного .
6.3. Разработка методов стандартизации препарата «Сафлоранастойка»
6.3.1. Качественный анализ препарата « Сафлора настойка»
6.3.2. Количественный анализ препарата « Сафлора настойка»
6.4. Изучение острой токсичности масла семян сафлора красильного
6.5. Изучение диуретической активности препаратов сафлоракрасильного
Выводы к главе
Общие выводы Список литературы 114 116
Приложения 129
- Этимология названия растения и историческая справка
- Изучение морфологических особенностей сафлора красильного, культивируемого в Самарской области
- Фитохимическое сравнительное ТСХ - исследование различныхорганов сафлора красильного
- Разработка методики качественного анализа цветков сафлоракрасильного
Введение к работе
Актуальность темы. Сегодня растения являются одним из важнейших источников получения лекарственных препаратов (ЛП), используемых в различных областях медицинской практики. Это объяснятся тем, что растительные препараты имеют широкий спектр фармакологической активности и, как правило, не вызывают побочных действий при рациональном применении. Совокупность биологически активных соединений (БАС), входящий в состав лекарственного растительного сырья (ЛРС) оказывает комплексное и взаимодополняющее действие, в связи с чем проявляется все больший интерес к новым источникам биологически активных веществ растительного происхождения (Киселева Т.Л., 2009; Куркин В.А., 2009; Самылина И.А. и др., 2003; 2010). В этой связи, изучение новых видов ЛРС и их внедрение в научную медицину является одной из актуальных задач современной фармакогнозии.
Перспективным источником получения новых БАС является сафлор красильный (Carthamus tinctorius L.) семейство Астровые, или Сложноцветные (Asteraceae). В России сафлор появился в XVIII веке, а с 30-х годов XX в. осуществляются посевы и агротехническое изучение сафлора красильного на территории Самарской области (ГНУ Самарский НИИ сельского хозяйства им. Н.М. Тулайкова РАСХН, пгт. Безенчук и с. Пестравка).
На сегодняшний день отечественная официнальная медицина допускает использование сафлора только в качестве компонента для производства биологических активных добавок (БАД) и косметологических средств. В то же время сафлор красильный находится в списке лекарственных растений в Британской Травяной фармакопее, Европейской, Китайской и Французской фармакопеях. По литературным данным известно, что в мировой фармацевтической практике используются цветки и семена сафлора красильного. Сафлор используется в восточной народной медицине как ангиопротектор, нормализуя состояние артериального, венозного и микроциркуляторного русла, востребован в качестве средства, сокращающего матку, при послеродовых атонических кровотечениях. Известны также его контрацептивные и антисептические свойства. Растение позитивно влияет на лимфоток, способствуя выведению токсинов и уменьшению отечности. Цветки сафлора обладают мочегонным, слабительным, противовоспалительным и желчегонным действием.
Сафлоровое масло, полученное из очищенных семян, по наиболее важным показателям не уступает подсолнечному маслу и используется в кулинарии. В косметологии масло из семян сафлора входит в состав средств для сухих и поврежденных волос, солнцезащитных средств, для лечения и предупреждения купероза и для восстановления липидного слоя сухой и очень сухой кожи, в качестве антиоксиданта в антивозрастной косметике.
Таким образом, представляется актуальным фармакогностическое исследование сафлора красильного, культивируемого на территории Самарской области с целью введения и обоснования его использования в научной медицине и фармации в качестве источника новых видов ЛРС. Значимой является и возможность расширения сырьевой базы сафлора красильного с учетом актуальности проблемы комплексного использования данного растения. Решение обозначенных проблем будет способствовать реализации Стратегии лекарственного обеспечения населения Российской Федерации на период до 2025 г.
Цели и задачи исследования.
Цель работы: Фармакогностическое исследование сафлора красильного по обоснованию целесообразности использования его в качестве источника новых видов лекарственного растительного сырья.
Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:
-
Анатомо-гистологическое исследование различных органов сафлора красильного.
-
Сравнительное фитохимическое исследование различных органов сафлора красильного (трава, цветки, семена).
-
Изучение флавоноидного состава надземной части сафлора красильного, культивируемого в Самарской области.
-
Разработка методики качественного анализа цветков сафлора красильного.
-
Разработка методики количественного определения суммы флавоноидов в цветках сафлора красильного.
-
Изучение жирно-кислотного состава и физико-химических характеристик масла из семян сафлора красильного.
-
Разработка методик качественного и количественного анализа лекарственных препаратов сафлора красильного («Сафлора настойка», «Сафлоровое масло»).
-
Обоснование целесообразности создания лекарственных средств на основе цветков сафлора красильного.
-
Разработка проектов ФС « Сафлора цветки», «Сафлоровое масло» и
«Сафлора настойка».
Научная новизна. Впервые проведенное анатомо-гистологическое исследование строения надземных и подземных органов сафлора красильного позволило выявить диагностические признаки сырья данного растения, в частности, наличие на всей протяженности трубки венчика окрашенных в темно-бурый цвет сегментированных млечников, простых одно-двух клеточных трихом, расположенных над центральной жилкой лепестков, густо опушенного мелкими простыми трихомами гинецея, опушенного многочисленными волосками рыльца, пигментированного слоя клеток и многочисленных капель жирного масла в семенах данного растения.
В результате изучения химического состава водно-спиртовых извлечений из цветков сафлора красильного, культивируемого в Самарской области, впервые выделены и охарактеризованы 5 индивидуальных флавоноидов. В их числе сафлорозид, который охарактеризован как доминирующий компонент данного растения и является новым природным соединением, для которого с использованием данных масс-спектрометрии, УФ-, 1Н-ЯМР-спектроскопии, и результатов химических реакций (ферментативный и кислотный гидролиз) описано строение: 7-О--D-глюкопиранозид 3,7,31,41-тетрагидрокси-5-метоксифлавона. Кроме того, азалеатин (3,7,31,41-тетрагидрокси-5-метоксифлавон) и 5-метил-лютеолин впервые описаны для рода Carthamus, а цинарозид и лютеолин впервые для сафлора красильного, культивируемого в Самарской области.
Показана целесообразность проведения стандартизации сырья сафлора красильного по ведущей группе биологически активных веществ растения – флавоноидам, а конкретно, по содержанию доминирующего соединения сафлорозида.
Подобраны оптимальные условия для проведения качественной и количественной оценки суммы флавоноидов в цветках сафлора красильного с использованием хроматографических и спектрофотометрических методов, позволяющих определить качество и подлинность ЛРС. Разработаны методики анализа сырья и лекарственных препаратов сафлора красильного, основанные на определении суммы флавоноидов в пересчете на сафлорозид с применением методов тонкослойной хроматографии (ТСХ) и УФ-спектроскопии.
С помощью метода газовой хроматографии впервые определен жирно-кислотный состав жирного масла из семян сафлора красильного, культивируемого в Самарской области, и определены его физико-химические характеристики. Определено, что доминирующим компонентом в сафлоровом масле является линолевая килота, содержание которой составляет 78,5±0,05 % - 79,6±0,03 %. Впервые в сафлоровом масле определены маргариновая, невроновая, лигноцериновая, эйкозодиеновая жирные кислоты кислоты.
Практическая значимость. На основе результатов исследования разработаны проекты фармакопейных статей (ФС) «Сафлора цветки», «Сафлора настойка» и «Сафлоровое масло». Разработаны состав, способ получения, определены показатели качества и методы их оценки для лекарственных препаратов на основе сафлора красильного: «Сафлора настойка», «Сафлоровое масло».
Предложены методики качественного и количественного анализа флавоноидов в сырье сафлора красильного, отвечающие принципам унификации, предъявляемым к современному фармацевтическому анализу (Самылина И.А. и др. 1994; 2006). Разработано рационализаторское предложение № 263 «ГБОУ ВПО СамГМУ» от 27.06.2013 г. «Методика определения кислотного числа в жирном масле сафлора красильного» на усовершенствование методики определения кислотного числа для жирного масла в лабораторных условиях.
Результаты диссертационных исследований используются в учебных процессах на кафедрах: фармакогнозии с ботаникой и основами фитотерапии; фармацевтической технологии, химии фармацевтического факультета ГБОУ ВПО СамГМУ Минздрава России, ЗАО «Самаралектравы», ГНУ Самарский НИИ сельского хозяйства им. Н.М. Тулайкова РАСХН (пгт. Безенчук), ГБУЗ «Центр контроля качества лекарственных средств Самарской области». Результаты проведенного фармакогностического исследования позволят расширить ассортимент отечественного лекарственного растительного сырья за счет нового вида «Сафлора цветки», официнального за рубежом. Результаты анатомо-морфологических и фитохимических исследований нашли отражение в проектах ФС «Сафлора цветки», «Сафлора настойка» и «Сафлоровое масло», направленных на экспертизу в ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» с целью включения в Государственную Фармакопею Российской Федерации XII издания.
Связь задач исследования с проблемами фармацевтических наук. Диссертационная работа исполнена в соответствии с тематическим планом научно-исследовательских работ государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (№ Гос. регистрации 01200900658).
Положения, выдвигаемые на защиту:
-
Результаты анатомо-гистологических исследований различных органов сафлора красильного.
-
Результаты фитохимического исследования различных видов сырья сафлора красильного.
-
Результаты исследования флавоноидного состава из цветков сафлора красильного.
-
Результаты исследования жирно-кислотного состава масла из семян сафлора красильного.
-
Результаты исследований по изучению показателей качества сырья и лекарственных препаратов сафлора красильного «Сафлора цветки», «Сафлоровое масло» и разработке методик их качественного и количественного анализа.
Апробация работы. Материалы диссертационной работы представлены и обсуждены на Всероссийской молодежной научной школе «Биоматериалы и нанобиоматериалы: актуальные проблемы и вопросы безопасности» (г. Казань, 2012 г.); ХVII и ХVIII Всероссийском конгрессе «Экология и здоровье человека» (г. Самара, 2012; 2013 г.); VI Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы использования и охраны природных ресурсов России» (г. Самара, 2012 г.); ХI Международной конференции «Медико-социальная экология личности: состояние и перспективы» (г. Минск, 2013 г.); конференции дипломированных специалистов Аспирантские чтения «Молодые ученые – медицине» (г. Самара, 2012; 2013 г.); III Международной научной Интернет-конференции "Медицина в XXI веке: тенденции и перспективы" (г. Казань, 2014 г.).
Публикации. Основное содержание диссертации опубликовано в 17 научных работах, из них 5 статей в журналах, включенных в Перечень изданий, рекомендуемых ВАК Министерства образования и науки РФ.
Личный вклад автора. Все экспериментальные результаты, приведенные в диссертации, получены самим автором. Автором выполнены исследования по изучению морфологических и анатомо-гистологических особенностей строения различных органов сафлора красильного, выявлены основные диагностические признаки. Подобраны и апробированы оптимальные условия экстракции флавоноидов из цветков сафлора красильного. Автором разработаны методики анализа исследуемых видов лекарственного растительного сырья сафлора красильного, предложены состав и технология получения препаратов «Сафлора настойка» и «Сафлоровое масло». Автором разработаны методики качественного и количественного анализа предложенных препаратов с применением методов ТСХ, ГЖХ и УФ-спектрофотометрии. Автор провел исследование жирно-кислотного состава и определение физико-химических характеристик масла из семян сафлора красильного. Автором разработаны проекты ФС «Сафлора цветки», «Сафлоровое масло» и «Сафлора настойка».
Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 129 страницах машинописного текста, содержит 17 таблиц, 61 рисунок. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, собственных экспериментальных исследований и их обсуждение (главы 3-6), общих выводов, приложения и списка литературы, включающего 138 источников, из которых 48 – на иностранных языках.
Этимология названия растения и историческая справка
Сафлор (син. сафлор красильный, американский шафран, дикий шафран, желтяница, красильный чертополох, крокос (лат. Carthamus tinctorius L.) — однолетнее растение из семейства Астровые (Asteraceae) (рис. 1).
Латинское ботаническое название сафлора, Carthamus, происходит от арабского слова kurthum – желтая краска и связано с тем, что сафлор с древности выращивали как красильное растение [46, 58]. Аналогичное происхождение названия имеют куркума и шафран. Все три древних названия растений восходят к санскриту - kunkumam называли растения, дающие желтый краситель [46, 87]. Латинизированное название Carthamus перешло в некоторые романские языки – итальянский - cartamo, испанский - crtamo.
Арабское название сафлора usfur имеет те же корни, что и шафран и куркума и происходит от древнегреческого корня sfr – желтый цвет. Любопытно, что общее название сафлор или safflower в других европейских языках произошло от арабского usfur «желтый» через староитальянское asfiore или saffiore. По другой версии - от старофранцузского названия saffleur, которое получилось от слияния двух слов – saffron и flower – желтый цветок [47, 58].
Сафлор красильный (Carthamus tinctorius L.) является известным культурным растением. Основной ареал вида Carthamus лежит в степной зоне и полупустыни. Вопрос о географических истоках его происхождении является спорным. Известно, что родиной культуры сафлора является Абиссиния или Индия, и в качестве прародителя принимают Абиссинский или Индийский виды сафлора красильного, но все эти гипотезы не имеют достаточных достоверных доказательств и не считаются общепринятыми в науке [46, 86].
Возделывание сафлора красильного началось в глубокой древности, причем, очевидно, что первоначально это растение возделывалось, как красильное, а потом позднее началось применение семян с целью получения из них масла [46, 83]. В Египте с древних времен сафлор красильный известен как красильное растение, и краской, полученной из его цветков, окрашены большинство повязок, в которые завернуты мумии, а цветки сафлора были найдены в гробнице фараона Аменхотепа I (XVI век до н.э.) [46, 58].
Как культурное растение сафлор известен в странах Средней Азии и северной Африки, от Египта и Абиссинии до Индии, включая Афганистан, Туркестан, Закавказье, Малую Азию и Сирию с Палестиной. В южной Европе сафлор красильный привезен в 1551 года из Египта [8, 46, 53]. В странах южной Европы, посевы сафлора были сконцентрированы главным образом на Пиренейском полуострове, но встречается также на юге Франции, в Италии и странах Балканского полуострова [46, 58]. По имеющимся литературным указателям, культура сафлор, как красильное растение, до недавнего времени доходила до стран Восточной и Западной Европы (Венгрии, Германии) пока культура растения не утратила значение по причине повышения и развития производства анилиновых красителей [34, 58]. Следует отметить, что из Индии сафлор красильный попал в страны Индокитая и потом во II веке до н. э. в Китай, где массово культивировался в бассейне Ян-Дзы-Дзян до сегодняшних дней [58]. Китайская народная медицина знала о нем еще в 1061 году. И сейчас сафлор красильный используют при заболеваниях сердечнососудистой системы [32, 73, 77, 107].
Сафлор красильный (Carthamus tinctorius L.) принадлежит к семейству сложноцветные (Compositae) [2, 55, 61, 63, 66, 115, 122, 136]. Он представляет собой травянистое растение с резко выраженными внешними признаками обитателя засушливых регионов [1, 4, 9, 10, 44, 57, 66, 37] (рис. 1). Сафлор имеет характерные следующие морфологические признаки твердый, прямостоячий, голый и ветвистый стебель, достигающий в зависимости от сорта и условий произрастания свыше 100 см [44, 49, 68, 70]. Листья кожистые, продолговато-ланцетовидные или эллиптические, по краям с зубчиками, как правило, заканчиваются шипами, однако следует отметить что есть формы и без шипов [70, 74, 76, 85]. Окраска листа сафлора красильного наблюдается от светло-зеленой до темно-зеленой. Цветки мелкие, трубчатые, желтые или оранжевые [38, 46, 50, 61, 68, 89]. Венчик пятираздельный, рыльце закругленное, пыльники крепко и плотно прилегают к столбику. Для сафлора характерна овальная по форме завязь и длинный столбик. Отмечается что окраска венчика расположена в диапазоне от белой до красной. Соцветия у сафлора – многоцветковые, многосемянные корзинки по форме -конические, куполообразные или плоские. Цветочная корзинка от 1,5 до 4 см в диаметре, а количество корзинок на особи варьирует и зависит от сортовой принадлежности и от условий культивирования (от 14 до 60, и в среднем 18). Число семянок в корзинке насчитывается от 25 до 60. Обертка корзинок двойная, наружные чешуйки обертки имеют листовидную форму. В зависимости от сортовой принадлежности на краях имеются шипы, также есть формы и без шипов. Характер кроющих пленок относится к внутренним чешуйкам обертки, и с помощью плотного смыканиюя внутренних листочков не происходит осыпания семян [46, 98, 133]. Плодом сафлора является семянка [1, 8, 31, 38, 39, 65]. Семена белые, голые, обратнояйцевидные, глянцевитые, четырехгранные, удлиненные, со слабо выступающими ребрами. Вершина семян тупая, обычно, без хохолка. Также существуют семянки с хохолком из узких пленок. Семянки сафлора красильного все панцирные, следует отметить, что панцирный слой находится очень глубоко в тканях оболочки. По массе 1000 штук семян соответствуют 400 г. 50-60 % от массы всего семени составляет оболочка [46, 57, 58, 65]. Корневая система сафлора хорошо развита, стержневого типа. По данным П.И. Подгорного [57] строение корней сафлора мелкоклеточное. Главный корень располагается на глубине 15-20 см и достаточно хорошо разветвлен сильно, утончается далеко до 1,5-2 м в глубину почвы. От главного корня идут горизонтально боковые ответвления, почти под углом 90 к главному стержневому корню. Начинаются они достаточно близко от поверхности почвы (3-5 см) [57, 61, 104].
Сафлор красильный является перекрестноопыляющимся растением [8, 33, 32, 46, 69, 74, 89]. Опыление происходит при помощи насекомых (пчелы). В первую очередь зацветают центральные корзинки сафлора, затем боковые, цветение различных видов корзинок у одного растения по продолжительности длится около одного месяца. Вегетационный период (число дней от полных всходов до полного созревания) делится по сортам и находится в следующих пределах 93-152 дня [10, 32, 48, 57, 60].
Изучение морфологических особенностей сафлора красильного, культивируемого в Самарской области
Внедрение нового вида лекарственного растительного сырья (ЛРС) связано напрямую с необходимостью проведения комплексных фармакогностических исследований, включая морфологическое и анатомо-гистологическое изучение внедряемого растительного объекта.
В рамках разработки разделов нормативной документации (ФС) «Внешние признаки» и «Микроскопия» на ЛРС сафлора красильного нами проведено изучение морфологических признаков растения, а также изучены анатомические и гистологические особенностей вегетативных и генеративных органов надземной и подземной части сафлора.
В настоящей работе представлены результаты морфолого-анатомического исследования соцветий сафлора красильного, интродуцированного в Ботаническом саду СамГУ г. Самара и ГНУ Самарский НИИ сельского хозяйства РАСХН им. Н.М. Тулайкова (пгт. Безенчук).
Анализ литературных данных показал, что несколько зарубежных источников содержит описание морфологии растения [10, 31, 38, 46, 74, 97, 101], но отсутствует информация об анатомии и гистологии отдельных органов сафлора красильного. В связи с этим, знание особенностей морфологического и анатомического строения изучаемого растения позволит разработать наиболее адекватную методику анализа, внедряемого ЛРС, будет способствовать расширению сырьевой базы данного растения в нашей стране, а также позволит изучить возможности безотходного производства препаратов на основе сафлора красильного.
Морфология растительного объекта является одним из наиболее значимых критериев отличия его от других видов растений. Опираясь на данные литературы [38, 97, 108], нами были проанализированы и подтверждены особенности морфологического строения вегетативных и генеративных органов изучаемого растения.
Рисунок 2 – Образец сафлора красильного Carthamus tinctorius L. А – Гербарный образец кафедры; Б – Общий вид надземной части растения. Результаты морфолого-анатомического исследования показали, что стебель сафлора красильного голый, твердый, прямостоячий, ветвистый в верхней части, достигающий 80 см в высоту (рис. 2).
Листья сафлора красильного различной длины от 1,7 до 6,5 см. размеры их зависят от экологических факторов, условий произрастания, агротехнических характеристик возделывания, сорта растения. Листья очередные, сидячие, продолговато-ланцетовидные, зубчатые с резко выступающей снизу сетью жилок, по краю шиповатые, на верхушке заострнные. Цвет листовой пластинки от желто-зеленой до темно-зеленой.
Соцветие сафлора красильного - это коническая, куполообразная корзинка диаметром от 1,5 до 4 см (рис. 2). У изучаемых нами образцов число корзинок в среднем насчитывало 18 на одном экземпляре растения.
Обертка соцветий плотная двухслойная. Наружные листочки обертки листовидные, ланцетовидной формы, зеленого цвета (фотосинтезирующие), с шипами по краям листовых пластинок; имеют пленчатые расширенные основания. Длина оберток варьирует от 1,5 до 3 см (рис. 3). Характер жилкования краевых оберток пальчато-дуговой, при этом центральная жилка выражена сильнее: в основной части листовой пластинки дуговидно расположены еще по две жилки с каждого края (рис. 3).
Внутренние чешуйки обертки имеют характер кроющих пленок длиной от 1,5 до 2 см. С поверхности гладкие блестящие светло-зеленого, а к основанию почти белого цвета, они плотно сомкнуты. Верхушки пленчатых оберток, зауженные остро-оттянутые, колючек по краю не имеют (рис. 5). Благодаря плотному смыканию внутренних листочков обвертки семена почти не осыпаются.
Цветоложе корзинки плоское, слабо выпуклое, внутри выполнено плотной паренхимой. Плодоножка полая (рис. 5А). С поверхности цветоложе сильно опушено (рис. 5Б). Опушение густое, представлено пластинчатыми трихомами соломенного, светло-желтого, почти белого цвета. При микроскопировании опушения видно, что пластинки тонкие состоят из прозенхимных клеток со слабо выраженным протопластом. Клеточные стенки их тонкие, целлюлозные (рис. 6).
Фитохимическое сравнительное ТСХ - исследование различныхорганов сафлора красильного
Методом ТСХ нами проведен фитохимический анализ следующих образцов сырья сафлора красильного:
трава сафлора красильного, выращенная на фармакопейном участке СамГМУ заготовленная в июле 2012 г. и в период с июля по октябрь 2013 г.;
трава сафлора красильного, выращенного в ГНУ Самарский НИИ сельского хозяйства РАСХН (г. Безенчук) и заготовленная в августе 2011 г.;
трава сафлора красильного, выращенного в ГНУ Самарский НИИ сельского хозяйства РАСХН (с. Пестравка) и заготовленная в августе 2012 г.;
трава сафлора красильного, выращенного в Самарской области (г. Сызрань) и заготовленная в период с июля по сентябрь 2012 г.;
Анализ проводили методом ТСХ описанном в главе 2. В качестве образца сравнения использовали ГСО лютеолин, кверцетина, рутина и РСО кемпферола. При визуальной оценке хроматограммы водно-спиртовых извлечений из различных частей сафлора красильного, культивируемого в Самарской области, видно, что в цветках и листьях преобладают вещества фенольной природы, в том числе флавоноиды.
Результаты качественного хроматографического анализа различных органов сафлора красильного представлены на рис. 49. Рисунок 49 – ТСХ–анализ 70 % спиртовых извлечений различных органов сафлора красильного (фармакопейный участок СамГМУ): система растворителей хлороформ – этанол - вода (26:16:3). Обозначения: 1 – цветки; 2 – листья; 3 – стебель; 4 – корень; 5 – семена. Апробированный метод ТСХ-анализа для водно-спиртовых извлечений из сырья сафлора красильного является наиболее показательным, чувствительным, специфичным для обнаружения в объекте флавоноидов. Принимая во внимание полученные данные о наличии доминирующего пятна на уровне ГСО цинарозида, на наш взгляд, целесообразной является стандартизация по преобладающему флавоноиду. В результате спектрофотометрического анализа нами получены кривые поглощения в УФ-спектре спиртовых извлечений из различных органов сафлора красильного, которые свидетельствуют о различном химическом составе: с точки зрения содержания флавоноидов в наибольшей степени это выражено кривой поглощения раствора водно-спиртового извлечения из цветков сафлора красильного (рис. 50). Рисунок 50 - УФ-спектры водно-спиртовых извлечений из различных органов сафлора красильного
С целью изучения флавоноидного состава исследовано извлечение из цветков сафлора красильного, полученное экстракцией 70% этиловым спиртом. Исследования показали, что соединения флавоноидной природы содержаться во всех анатомических органах растения, однако наибольшее их количество отмечено в цветках. Поэтому именно цветки использовались в качестве исходного сырья. 100 г воздушно-сухих цветков сафлора красильного измельченные (5-10 мм), заготовленные в августе 2013 г., экстрагировали 70 % этиловым спиртом, осуществляя вначале две экстракции при комнатной температуре в течение 24 ч, а затем при нагревании на кипящей водяной бане в течение 30 мин. Объединенное водно-спиртовое извлечение упаривали под вакуумом до объема 50 мл, смешивали с 30 г силикагеля L 40/100 и высушивали. Высушенный порошок (сухой экстракт + силикагель) наносили на слой силикагеля (диаметр – 8 см, высота – 5 см), сформированный в виде взвеси в хлороформе. Хроматографическую колонку элюировали хлороформом и смесью хлороформ-этанол в различных соотношениях (99:1; 98:2; 97:3; 95:5; 93:7; 90:10; 85:15; 80:20; 70:30, 60:40, 50:50). Контроль за разделением веществ осуществляли с помощью ТСХ-анализа на пластинках «Сорбфил ПТСХ-АФ-А-УФ» в системах хлороформ-этанол (9:1), хлороформ-этанол-вода (26:16:3), а также н-бутанол ледяная уксусная кислота-вода (4:1:2). Фракции, содержащие доминирующее вещество 1, были объединены, выпавший из них осадок был отделен и перекристаллизован из спирта этилового. При этом получен флавоноид 1 с выходом 0,1 % от массы воздушно-сухого сырья. Фракции, содержащие соединения 2-5, наносили на полиамид «Wolem» с целью дальнейшей очистки. Сухой порошок (экстракт+полиамид) переносили в хроматографическую колонку (высота сорбента – 5,0 см, диаметр – 4 см). Соответствующую хроматографическую колонку элюировали водой и водным раствором спирта этилового (20%; 40%; 70%; 96%). В результате проведенной очистки на колонках с полиамидом были получены вещества 2 и 3 (элюент - 96% этиловый спирт), вещество 4 (элюент - 70% этиловый спирт) и вещество 5 (элюент - 40% этиловый спирт), дополнительную очистку которых удалось провести путем перекристаллизации из водного спирта.
Кислотный гидролиз соединения 1 осуществляли 2 % HCl при 100 оС в течение 30 мин, расщепление гликозида 5 проводили в более жестких условиях – в 10 % HCl при 100 оС в течение 2 ч. Осадки, полученные после охлаждения реакционной смеси, промывали водой очищенной и перекристаллизовывали из водного спирта. В результате из гликозидов 1 и 5 получены агликоны соответственно соединения 2 и 4.
Cпектры ЯМР 1Н получали на приборах «Bruker AM 300» (300 МГц), масс-спектры снимали на масс-спектрометре «Kratos MS-30», регистрацию УФ-спектров проводили с помощью спектрофотометра «Specord 40» (Analytik Jena).
В результате хроматографического разделения упаренного водно-спиртового извлечения из цветков сафлора красильного, последующей рехроматографии полученных фракций веществ выделили пять (1-5) соединений флавоноидной природы (табл. 4). В ПМР-спектре соединения 1 обнаруживаются сигналы ароматических протонов Н-21 при 7.78 м.д. (1Н, д, 2.5 Гц), Н-61 при 7.75 м.д. (1Н, дд, 2.5 и 9 Гц), Н-51 при 6.95 м.д. (1Н, д, 9 Гц), Н-8 при 6.86 м.д. (1Н, д, 2.5 Гц) и Н-6 при 6.43 м.д. (1Н, д, 2.5 Гц). Обнаружение трехпротонного синглетного сигнала при 3.83 м.д. свидетельствует о наличии в молекуле флавоноида 1 метоксигруппы, которая отнесена к кольцу А флавоноида на основании данных масс-спектра: пик иона с m/z 168, соответствующий фрагменту (А+Н)+. Данный вывод подтверждается и данными УФ-спектров. Выбор места метилирования в пользу 5-ОН группы сделан на основании отсутствия в ПМР-спектре сигнала данной группы как в случае соединения 1, так и агликона (2), полученного в условиях кислотного гидролиза, а также выделенного из цветков сафлора красильного в индивидуальном виде. Соединение 2 идентифицировано нами как 3,7,31,41-тетрагидрокси-5-метоксифлавон (азалеатин) [99]. Р-Конфигурация гликозидной связи соединения 1 подтверждается наличием в ПМР-спектре дублетного сигнала при 5.05 м.д. с КССВ 7 Гц, принадлежащего аномерному протону глюкозы. О гликозилировании 7-ОН-группы свидетельствуют данные УФ-спектров: отсутствие батохромного сдвига коротковолновой полосы электронного спектра в присутствии NaOAc [102] и появление данного эффекта в случае агликона (2). В отличие от азалеатина (2) в ПМР-спектре соединения 3 при 6.04 м.д. содержится дополнительный однопротонный синглетный сигнал, принадлежащий протону при С-3, что в совокупности с данными УФ-спектров, а также масс-спектра, в котором присутствуют пик иона с m/z 300 и 168, соответствующие молекулярному иону и фрагменту (А+Н)+, позволяет идентифицировать данный флавоноид как 5-О-метиллютеолин [114].
Соединения 4 и 5, идентифицированные как 5,7,31,41-тетрагидроксифлавон (лютеолин) и 7-О-Р-Dглюкопиранозид 5,7,31,41-тетрагидроксифлавона (цинарозид) (рис. 52), ранее были выделены из цветков сафлора красильного [131].
Таким образом, в результате изучения флавоноидного состава цветков сафлора красильного выделены и охарактеризованы с использованием Н-ЯМР -, УФ-спектроскопии и масс-спектрометрии пять флавоноидов, среди которых азалеатин (3,7,31,41-тетрагидрокси-5-метоксифлавон) и 5-О-метиллютеолин впервые описаны для данного растения, а 7-О-Р-0-глюкопиранозид азалеатина, названный нами сафлорозидом, является новым природным соединением (табл. 4 и рис. 51).
Разработка методики качественного анализа цветков сафлоракрасильного
На индивидуальном предприятии Валочкина А.В. Пестравского района Самарской области налажено производство сафлорового масла методом отжима семян [1, 65, 58].
Рисунок 53 – Технология получения сафлорового масла [37]. Очистка семян сафлора заключается в освобождении их от сорных и минеральных примесей. Семена очищают на ситовом сепараторе, затем взвешивают и направляют на сушку в шахтную сушилку. В результате сушки влажность семян снижается с 10-15 до 2-7%. Семена охлаждают с +50 С до +35 С. Для разрушения клеточной структуры семена измельчают на вальцовых машинах или станках путем раздавливания. В результате получают мятку. Ее подвергают гидротермической обработке (увлажняют насыщенным паром), затем обжаривают, с подогревом мезги до 60 С в электрожаровнях и подсушивают.
При обжаривании мезга приобретает необходимую пластичность, что облегчает отжим масла на прессах. При обжаривании влажность уменьшается до 5–7%, а ее температура повышается до +105-115 С. Затем мезгу подвергают прессованию на прессе с целью выделения масла.
В результате прессования на шнековом прессе М-8- МШП из обжаренной мезги образуются два продукта: масло, содержащее частицы ядра, и жмых, включающий до 23% масла. Масло фильтруют на фильтр-прессе. Получаемый в результате прессования жмых содержит от 4 до 13% масла. Отстой и хранение масла производят в темном помещении при t +10 С в алюминиевых флягах с негерметичными крышками.
Определение физико-химических констант жирного масла сафлора красильного, культивируемого на территории Самарской области Нами проведены исследования по определению показателей качества физико-химических констант жирного масла сафлора красильного, культивируемого в Самарской области (ГНУ Самарский НИИ сельского хозяйства РАСХН им. Н.М. Тулайкова, пгт. Безенчук). В ходе исследований использовались статистические методы, УФ-спектрометрии, физико химические методы [14, 16, 19, 20, 23]. Такие физико-химические константы, как эфирное число, йодное число, перекисное число, число омыления, индекс окисленности устанавливали методами, принятыми Государственной фармакопеей СССР XI издания [14, 19, 20, 26] и в соответствии с ГОСТ Р 52110-2003 [24]. Полученные данные обрабатывали статистически по методам вариационной статистики.
Нами были проанализированы органолептические свойства полученного разными способами сафлорового масла (табл. 5).
В результате исследований нами определены значения физико-химических констант, характерных для масла семян сафлора красильного, культивируемого в Самарской области (табл. 6). Индекс окисленности. Около 0,4 г (точная навеска) масла помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, прибавляют 15 мл гексана, перемешивают и объем раствора доводят до метки тем же растворителем и снова перемешивают. Измеряют оптическую плотность испытуемого раствора при длине волны 232 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. [19, 24]. Индекс окисленности рассчитывают по следующей формуле: CЛ где D - оптическая плотность испытуемого раствора; C.1 - концентрация препарата. Индекс окисленности должен быть не более 6,0. Полученные физико-химические константы сравнили с показателями сафлорового масла по ГОСТу [18].
На наш взгляд, методика определения кислотного числа в жирных маслах в соответствии с нормативной документацией нуждается в усовершенствовании [24]. В данной методике в качестве растворителя используется смеси равных объемов 95% спирта и эфира, что нельзя признать целесообразным с точки зрения безопасности (эфир легко воспламеняется, огнеопасен) и неудобства в условиях хранения эфира диэтилового т.к. он относится к списку Б в соответствии Приказа Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации от 23 августа 2010 г. N 706н г. г. Москва "Об утверждении Правил хранения лекарственных средств". Нами была разработана методика определения кислотного числа сафлорового масла, предусматривающая использование хлороформа вместо эфира диэтилового, являющийся более доступным и удобным в использовании в лабораторных условиях. Учитывая то обстоятельство, что по липофильности, полярности молекул и диэлектрической проницаемости оба растворителей имеют общие признаки, нами сделано предположение о возможности применения разработанных подходов к определению кислотного числа в растительном масле.
На наш взгляд, способ определения кислотного числа в лабораторных условиях с использованием хлороформа можно рассматривать как более безопасный и удобный. Ниже приведены методика определения кислотного числа жирного масла сафлора красильного.
Методика определения кислотного числа жирного масла из семян сафлора красильного. Около 10 г (точная навеска) масла помещают в колбу вместимостью 250 мл и растворяют в 50 мл смеси равных объемов 95% спирта и хлороформа, предварительно нейтрализованного по фенолфталеину раствором едкого натра (0,1 моль/л); если необходимо, нагревают с обратным холодильником на водяной бане до полного растворения. Прибавляют 1 мл раствора фенолфталеина и титруют при постоянном помешивании раствором едкого натра (0,1 моль/л) до появления розового окрашивания, не исчезающего в течение 30 с. Для вещества с небольшим кислотным числом (до 1) титрование проводят из микробюретки.
Кислотное число (Кч) вычисляют по формуле: де а - количество миллилитров раствора едкого натра, израсходованное на титрование; б - навеска вещества в граммах; 5,61 - количество миллиграммов едкого кали, соответствующее 1 мл раствора едкого натра (0,1 моль/л).
С использованием разработанной методики нами проанализирован ряд образцов сафлорового масла (табл. 7) и при этом определено, что кислотное число варьирует от 1,87% до 2,12 %, что позволяет говорить о соответствии по показателю кислотного числа сафлорового масла требованиям, предъявляемым к растительным маслам в нормативной документации (диапазон колебаний 0,78 -5,76).
Таким образом, полученные данные свидетельствуют о соответствии физико-химических характеристик сафлорового масла, получаемого в ГНУ «Самарский НИИ сельского хозяйства им. Н.М. Тулайкова РАСХН, (пгт. Безенчук и с. Пестравка)» требованиям, предъявляемым к растительным маслам.
