Введение к работе
Актуальность проблемы. Одной из важных задач современной фармацевтической химии является целенаправленный поиск соединений с заданными фармакологическими свойствами. С этой целью используют различные подходы, одним из которых является изучение закономерностей взаимосвязи структура - активность. При таком поиске обязателен учет данных биохимической фармакологии, указывающих на причинно-следственные связи между возникновением патохимических процессов и нарушением функционирования клеточной мембраны. Состояние последней, как известно, существенно зависит от уровня и скорости генерации активных форм кислорода (АФК) в организме. Вышедшая из-под лимитирующего контроля антиоксидантной системы организма чрезмерная генерация АФК является причиной оксидантного стресса клеток (увеличение перекисного окисления липидов) и, как следствие, приводит к формированию патологий.
Исходной активной формой кислорода в животном организме является супероксидный анион-радикал , на формирование которого в физиологической норме расходуется примерно 2% всего потребляемого кислорода. Большинство же остальных АФК (OH, NO, O2*, ClO и др.) в той или иной мере являются продуктами его биотрансформации.
Анализ данных литературы, посвященных антиоксидантам и изучению проявляемой ими активности свидетельствует о том, что их номенклатура ограничена преимущественно препаратами, относящимися к двум группам – донорам протонов (токоферол, пробукол, кислота аскорбиновая) и полиенам (ретинол, каротиноиды). Они не лишены недостатков, так как слабо защищают белки и нуклеиновые кислоты от окислительного повреждения.
Эндогенные антиоксиданты являются важнейшим звеном защитной системы организма, поэтому исследования по целенаправленному поиску индивидуальных веществ и/или суммарных композиций, проявляющих как антирадикальную активность, так и способных предохранять элементы собственной антиоксидантной системы, имеют важное значение.
В настоящее время существует четкая классификация известных антиоксидантов, основанная на структурных признаках молекул, ответственных за проявление антиоксидантных свойств. Учитывая это, можно проводить поиск новых антиоксидантов как путем целенаправленного синтеза, так и созданием оптимальных композиций антиоксидантов на основе природных соединений растительного происхождения.
Одним из таких перспективных и легкодоступных источников суммарных композиций антиоксидантов может служить мякоть плодов тыквы обыкновенной (Cucurbita pepo L.). В литературе до сих пор отсутствуют сведения о наличии в её составе фенольных соединений, однако применение в народной медицине в качестве гепатопротекторного, желчегонного, противовоспалительного средства свидетельствует о наличии данной группы соединений и является достаточным обоснованием для проведения химических и биохимических исследований.
Цель и задачи исследований. Целью наших исследований является химическое и биологическое изучение антиоксидантной активности сухого экстракта из мякоти тыквы обыкновенной, а также выявление взаимосвязи структура-активность 16 индивидуальных производных коричной кислоты, пять из которых являются компонентами данного сухого экстракта.
Для достижения поставленной цели мы сочли целесообразным решение следующих задач:
с помощью предварительного биохимического скрининга, обосновать выбор растворителя для получения сухого экстракта мякоти тыквы обыкновенной, характеризующегося наибольшей антиоксидантной активностью;
провести химический анализ сухого экстракта и количественно охарактеризовать в нем основные группы БАВ;
разработать методику количественного определения группы соединений, вносящих существенный вклад в проявляемую сухим экстрактом антиоксидантную активность;
полуэмпирическими квантово-химическими методами изучить основные индексы реакционной способности производных коричной кислоты в отношении АФК на примере (ОН) и на их основе обосновать структуру , характеризующуюся более высокой антиоксидантной активностью.
Научная новизна. На основе предварительного биохимического скрининга сухих экстрактов, полученных из мякоти тыквы обыкновенной, установлено, что наибольшей антиоксидантной активностью, а также СОД-протекторной активностью обладает сухой экстракт, полученный после обработки сырья спиртом этиловым 70%. Использование данного экстрагента обеспечивает наибольшую концентрацию антиоксидантов в целевом продукте – 174,9±2,4 мг/г (17,5%) в пересчете на кверцетин.
Впервые методом ВЭЖХ в мякоти тыквы обыкновенной определены галловая, изоферуловая, кофейная, цикоревая и коричная кислоты, а также кверцетин, апигенин, суммарное содержание которых в полученном сухом экстракте составляет 12,8%.
Предложена методика спектрофотометрического определения количественного содержания суммы производных коричной кислоты в исследуемом сухом экстракте (найдено 8,24±0,11% в пересчете на кофейную кислоту). По данным химического анализа в нём определены следующие групп БАВ: аминокислоты – 12,68 г/кг (1,27%); полисахариды: ВРПС – 3,36±0,12%, ПВ – 13,43±0,34%, ГцА – 9,89±0,21%, ГцБ – 5,44±0,14%; макро и микроэлементы – 48,78% (в золе); аскорбиновая кислота – 3,98±0,13%; каротиноиды – 1,42±0,04мг/% (0,0014%).
Экспериментально (in vivo) изучены иммунотропная и СОД-протекторная активности сухого экстракта мякоти тыквы. Установлено дозо-зависимое увеличение IgM-антителогенеза (в дозе 100 мг/кг в 1,71 раза; в дозе 500 мг/кг – 1,85 раза относительно контроля), уменьшение воспалительного эффекта при введении разрешающей дозы антигена (в дозе 100 мг/кг на 9,4%, в дозе 500 мг/кг – 37,5% по отношению к контролю). Выявлен дозо-зависимый эффект подавления воспалительных реакций, вызванных подкожным введением гистамина и декстрана (в дозе 500 мг/кг на 40,3% и 48,2% соответственно). В эксперименте in vivo установлена протекторная активность сухого экстракта мякоти тыквы обыкновенной по отношению к эритроцитарной Сu–, Zn– супероксиддисмутазе.
Полуэмпирическими квантово-химическими методами (PM3 и AM1) изучены индексы реакционной способности в ряду гидрокси- и метоксипроизводных коричной в отношении активных форм кислорода. По значениям величин порядков связей, связевых чисел и валентностей соответствующих атомов углерода в анализируемых структурах предложен новый показатель - суммарный индекс ненасыщенности (IUA). Он объективнее отражает способность структуры выступать в качестве «ловушки» свободных радикалов.
В эксперименте in vitro установлено, что антиоксидантная активность индивидуальных производных коричной кислоты достоверно, в среднем на 40%, превышает активность рутина, кверцетина и дигидрокверцетина. По результатам квантово-химических расчетов обоснована структура 4-гидрокси-3,5,-ди-трет-бутилкоричной кислоты, для которой экспериментально выявлен наибольший уровень антиоксидантной активности (С1/2=9,8±0,4 мкМ), который превышает аналогичный показатель для кофейной (С1/2=15,7±0,4 мкМ), синаповой (С1/2=17,0±0,3мкМ) и 3,4,5-тригидрокси-коричной (С1/2=12,0±0,6мкМ) кислот, а также дибунола (С1/2=21,2±0,8мкМ).
Сопоставление полученных экспериментальных значений уровня антиоксидантной активности производных коричной кислоты с рассчитанными на основе квантово-химического анализа показателями суммарной ненасыщенности молекулы, позволило выявить линейную зависимость между ними с коэффициентом корреляции 0,911. Такой подход может быть использован в исследованиях по целенаправленному поиску антиоксидантов в ряду других природных соединений.
Практическая значимость работы.
Предложен и обоснован способ получения сухого экстракта из мякоти тыквы обыкновенной. Разработана методика спектрофотометрического определения в нём суммы производных коричной кислоты.
Обоснована и экспериментально подтверждена антиоксидантная активность 4-гидрокси-3,5,-ди-трет-бутилкоричной кислоты, превосходящая таковую дибунола в 1,5 раза.
Исходя из количественного содержания суммы антиоксидантов, а также экспериментально установленной СОД-протекторной и имуннотропной активности, сухой экстракт из мякоти тыквы обыкновенной в перспективе может быть рекомендован для последующего исследования.
Внедрение результатов в практику.
Материалы по изучению тыквы обыкновенной и сухого экстракта, полученного из неё, переданы в НИИ питания РАМН для дальнейших совместных исследований. Для дальнейшего более глубокого фармакологического изучения антиоксидантной активности предлагаемый сухой экстракт мякоти тыквы обыкновенной передан в лабораторию микросомального окисления ГУ НИИ Биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН. По материалам исследования составлено учебно-методическое пособие «Активные формы кислорода и природные антиоксиданты», используемого в учебном процессе факультета последипломного образования ПятГФА.
Положения, выдвигаемые на защиту:
обоснование выбора растворителя для получения сухого экстракта мякоти тыквы обыкновенной, характеризующегося наибольшей СОД-протекторной и антиоксидантной активностью;
результаты исследования качественного и количественного состава сухого экстракта мякоти тыквы;
методика количественного определения суммы гидроксипроизводных коричной кислоты в целевом продукте;
квантово-химическое обоснование антиоксидантной активности 4-гидрокси-3,5,-ди-трет-бутилкоричной кислоты;
корреляционные зависимости между суммарной ненасыщенностью циннамоильного фрагмента в структуре производных коричной кислоты и проявляемой антиоксидантной активностью.
Связь задач с проблемным планом фармацевтических наук.
Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательской работ ГОУ ВПО «Пятигорской ГФА Росздрава», номер государственной регистрации 01.200101060.
Апробация работы и публикации.
Основные положения диссертационной работы изложены на:
четвертом международном симпозиуме "Компьютерные методы в токсикологии и фармакологии, включающие интернет-ресурсы CMTPI-2007" (Москва, сентябрь 2007 года);
конгрессе "Человек и лекарство" Краснодар -2008г.;
63-й и 64-й научной конференциях «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» (Пятигорск 2008-2009г.).
По теме диссертации опубликовано 9 работ, в том числе учебно-методическое пособие, используемое в учебном процессе факультета последипломного образования ПятГФА и 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Объем и структура диссертации.
Диссертационная работа изложена на 138 страницах текста компьютерного набора и состоит из обзора литературы, 3-х глав собственных исследований, общих выводов, списка литературы, включающего 160 источников, в том числе 65 иностранных; содержит 30 таблиц, 20 рисунков.
