Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 14
1.1. Что такое «идеальный» радиофармацевтический препарат? 14
1.2. Препараты для диагностики заболеваний легких 16
1.3. Препараты для исследования гемодинамики 20
1.4. Препараты для диагностики костной патологии 21
1.5. Получение изотопа технеция-99м ( шТс) 23
1.6. Получение РФП с технецием-99м 26
1.6.1. Методы восстановления Tc(VTI) и структура образующихся комплексов 26
1.6.2. Особенности получения зарубежных РФП с 99тТс 29
1.6.3. Получение отечественных РФП с 99шТс 31
1.7. Методы анализа реагентов и радиофармпрепаратов с шТс 33
1.7.1. Методы анализа микросфер альбумина; микросфер альбумина, модифицированных оловом(П); реагента и РФП на основе микросфер альбумина 33
1.7.1.1. Анализ микросфер альбумина 33
1.7.1.2. Анализ микросфер альбумина, модифицированных оловом(П) 37
1.7.1.3. Анализ реагента на основе микросфер альбумина 41
1.7.1.4. Взаимосвязь аналитических показателей качества и клинических требований для РФП 43
1.7.1.5. Анализ РФП на основе микросфер альбумина 47
1.7.2. Методы анализа реагента и радиофармпрепарата на основе альбумина 47
1.7.2.1. Анализ реагента на основе альбумина 47
1.7.2.2. Тест-методы анализа 48
1.7.2.3. Анализ РФП на основе альбумина 50
1.7.3. Методы анализа субстанции ОЭДФ, реагента и радиофармпрепарата на основе ОЭДФ 52
1.7.3.1. Анализ субстанции ОЭДФ 52
1.7.3.2. Анализ реагента на основе ОЭДФ 57
1.7.3.3. Анализ РФП на основе ОЭДФ 59
1.7.4. Краткие выводы к разделу 1-7 60
Экспериментальная часть 61
Материалы и методы исследования 61
1. Материалы 61
2. Методы исследования 63
ГЛАВА 2. Разработка методов анализа микросфер альбумина; микросфер альбумина, модифицированных оловом(п); реагента и рфп на основе микросфер альбумина 65
2.1. Анализ микросфер альбумина 65
2.1.1. Требования к контролю качества МСА : ;65
2.1.2. Внешний вид, размеры частиц, растворимость, подлинность, количественное определение 66
2.1.3. Потеря массы при высушивании, удельный объем, набухание, рН водных растворов 72
2.1.4. Краткие выводы к разделу 2.1 73
2.2. Анализ микросфер альбумина, модифицированных оловом(П) 75
2.2.1. Требования к контролю качества микросфер
альбумина, модифицированных оловом(П) 75
2.2.2. Определение олова(П) в MCA(Sn) 78
2.2.3. Определение общего олова (Sn(II)+Sn(TV)) в MCA(Sn) 83
2.2.4. Определение оптимального количества олова(П) в MCA(Sn), необходимого для получения качественного радиофармпрепарата 88
2.2.5. Краткие выводы к разделу 2.2 96
2.3. Анализ реагента на основе микросфер альбумина 98
2.3.1. Разработка требований и методик контроля качества реагента 98
2.3.2. Краткие выводы к разделу 2.3 107
2.4. Анализ препарата 99mTc-MCA(Sn) и корреляция с данными его биологического изучения 109
2.4.1. Требования к контролю качества препарата 109
2.4.2. Корреляция с биологическими исследованиями 110
2.4.3. Краткие выводы к разделу 2.4 125
2.4.4. Выводы к главе 2 127
ГЛАВА 3. Разработка методов анализа реагента и рфп на основе альбумина 130
3.1. Анализ реагента на основе альбумина 130
3.1.1. Разработка требований и методик контроля качества реагента , 130
3.1.2. Определение альбумина 132
3.1.2.1. Определение альбумина по биуретовой реакции 132
3.1.2.2. Определение альбумина по собственному поглощению в УФ области 134
3.1.3. Определение олова(П) 138
3.1.3.1. Спектрофотометрическое определение олова(П) по «рениевой» методике 139
3.1.3.2. Спектрофотометрическое определение олова(П) по «железной» методике 143
3.1.3.3. Спектрофотометрическое определение олова(П) в виде олова(1У) с пирокатехиновым фиолетовым 144
3.1.4. Разработка индикаторной трубки для определения олова(П)в реагенте 149
3.1.4.1. Выбор оптимального ГПС в качестве аналитического реагента 150
3.1.4.2. Подготовка ксерогеля, модифицированного реактивом Вавеле, к анализу 151
3.1.4.3. Определение способа ввода пробы в индикаторную трубку 153
3.1.4.4. Изучение влияния скорости потока пробы на длину окрашенной зоны 154
3.1.4.5. Выбор внутреннего диаметра индикаторной трубки 155
3.1.4.6. Определение условий стабилизации растворов олова(П) 156
3.1.4.7. Изучение влияния меди(П) на скорость восстановления иммобизиованного реактива Вавеле раствором олова(П) 157
3.1.4.8. Изучение влияния количества иммобилизованного молибдена(УІ) на глубину восстановления реактива Вавеле оловом(П) 159
3.1.4.9. Определение олова(П) в реагенте методом индикаторных трубок 160
3.1.5. Краткие выводы кразделу 3.1 164
3.2. Анализ препарата «Альбумин, 99тТс» и корреляция с данными его биологического изучения , 169
3.2.1. Требования к контролю качества препарата 169
3.2.2. Корреляция с биологическими исследованиями 175
3.2.3. Краткие выводы к разделу 3.2 180
3.2.4. Выводы к главе 3 181
ГЛАВА 4. Разработка методов анализа субстанции оэдф, реагента и рфп на основе ОЭДФ 183
4.1. Анализ субстанции ОЭДФ 183
4.1.1. Разработка требований и методик контроля качества субстанции ОЭДФ 183
4.1.2. Краткие выводы к разделу 4.1 200
4.2. Анализ реагента 204
4.2.1. Разработка требований и методик контроля качества реагента 204
4.2.2. Количественное определение ОЭДФ в реагенте 206
4.2.3. Количественное определение олова(П) в реагенте 210
4.2.3.1. Спектрофотометрическое определение олова(П) в реагенте 210
4.2.3.2. Использование индикаторных трубок для определения олова(П) в реагенте 213
4.2.4. Краткие выводы к разделу 4.2 215
4.3. Анализ препарата «ОЭДФ, 99тТс» и корреляция с данными его биологического изучения 219
4.3.1. Требования к контролю качества препарата 219
4.3.2. Корреляция с биологическими исследованиями 220
4.3.3. Краткие выводы к разделу 4.3 222
4.3.4. Выводы к главе 4 223
ГЛАВА 5. Краткое обсуждение итогов работы 226
Общие выводы 233
Литература
- Препараты для исследования гемодинамики
- Взаимосвязь аналитических показателей качества и клинических требований для РФП
- Внешний вид, размеры частиц, растворимость, подлинность, количественное определение
- Спектрофотометрическое определение олова(П) по «рениевой» методике
Введение к работе
Актуальность работы. Проблема своевременного и точного диагноза остается одной из основных проблем клинической медицины XXI века. В комплексе клинико-инструментальных средств диагностики различных органов и тканей одно из ведущих мест принадлежит радионуклидным (радиоизотопным) методам исследования [1].
Благодаря разнообразию радионуклидов и большому количеству «транспортных средств», доставляющих изотоп к органу-мишени, сегодня можно изучать любую систему организма.
Диагностика с использованием РФП позволяет обнаружить нарушения деятельности органов намного раньше анатомических изменений, выявляемых другими диагностическими тестами (рентген, компьютерная и ЯМР-томография, УЗИ). Такая ранняя диагностика позволяет осуществить раннее лечение, когда оно наиболее эффективно и возможен благоприятный прогноз, что особенно важно при онкологических, кардиологических и неврологических заболеваниях.
К важным преимуществам радионуклидного метода по сравнению с рентгеновским относятся его безопасность, низкие лучевые нагрузки на органы и организм исследуемого, более высокая разрешающая способность, возможность его использования у пациентов с индивидуальной непереносимостью рентгеноконтрастных препаратов [2].
Простота, скорость, безболезненность, надежность диагностики с помощью радиофармпрепаратов заслужили всеобщее признание.
Однако до настоящего времени российские клиники не имеют современных отечественных препаратов для радионуклидной диагностики заболеваний легких, костной системы, исследования гемодинамики. Так, например, применяемые в настоящее время РФП для диагностики легких «Макроагрегаты альбумина, I», «Макроагрегаты альбумина, 99v,Tc» (Россия) имеют ряд существенных недостатков:
• это препараты с нестабильным количеством частиц и их размерами, в то время как одним из основных требований, предъявляемых к диагностическому средству, предназначенному для сцинтиграфии легких, является стабильность размера и количества частиц; 131
• макроагрегаты с I создают высокую лучевую нагрузку на пациента за счет использования "жесткого" у-излучателя иода-131 (Е =364 кэВ, Ті/2=8}05 дня).
Лишенный этих недостатков препарат «ТСК-5» (CIS, Франция) практически недоступен для радиологических клиник России из-за высокой стоимости.
Аналогичная ситуация сложилась с РФП для диагностики костей и исследования гемодинамики. Так, в настоящее время российские клиники используют два отечественных препарата с технецием-99м для исследования костной системы - это «Пирфотех» и «Технефор» («Диамед»). Однако накопление этих препаратов в костях - невысокое (около 30-40%). За рубежом имеются РФП, позволяющие осуществлять качественную диагностику костной патологии: «ТСК-14», «ТСК-21» (CIS, Франция); «Techebon» (Hoechst, Германия); MDP (Amersham, Великобритания); Phosphon (Венгрия), «Osteoscan» (Proctor & Gamble, США) и другие. Однако они также являются малодоступными.
Для исследования гемодинамики в России используют препарат «Альбумин, ill I» (ФГУП «НИФХИ им. Л.Я. Карпова», Россия). Однако довольно большой период полураспада, "жесткое" у-излучение 1311 и медленное выведение радионуклида из крови затрудняют его применение при повторных диагностических процедурах, а также обуславливают повышенные лучевые нагрузки на организм. Этих трудностей удастся избежать, если в качестве метки для приготовления РФП использовать короткоживущие изотопы, например, 99мТс. Такие препараты за рубежом производят, один из самых известных - это «ТСК-2» (CIS, Франция), но и он малодоступен для российских клиник по указанной ранее причине.
В Медицинском радиологическом научном центре РАМН (ГУ МРНЦ РАМН) разработаны отечественные радиофармпрепараты и реагенты для их приготовления: «Микросферы альбумина, 99мТс», «ОЭДФ, 99мТс» и «Альбумин, 99мТс» для диагностики заболеваний легких, костной системы и изучения гемодинамики, соответственно.
Современное производство препаратов медицинского назначения в значительной мере определяется состоянием аналитического контроля на всех его стадиях. Выход и качество конечных продуктов зависят не только от строгого соблюдения технологического регламента, от качества сырья, но и от применения надежных аналитических методик постадийного контроля и оценки качества сырья и готовой продукции. Аналитический контроль должен проводиться в полном соответствии с нормативной документацией.
На новые диагностические препараты: «Микросферьг альбумина, 99ч Тс», «ОЭДФ, 99мТс» и «Альбумин, ""Тс» такая нормативная документация отсутствовала. Отсутствовали также и основные принципы и критерии фармакопейной оценки качества реагентов и получаемых из них радиофармпрепаратов. Это связано с тем, что за рубежом РФП получают на радиофармацевтическом предприятии, минуя стадию нерадиоактивного реагента («kit»), и затем доставляют в радиологические клиники («ready-for-use radiopharmaceuticals»), а в России РФП готовят непосредственно в клинике из нерадиоактивного реагента и пертехнетата натрия, мТс из генератора («kits or in-house radiopharmaceuticals»). Поэтому анализ реагентов для приготовления РФП с 99мТс не описан в зарубежных фармакопеях.
Работа проводилась в рамках проблемно-тематических планов НИР ГУ МРНЦ РАМН: "Разработка и биологические испытания радиофармпрепаратов на основе альбумина, комплексонов и боросодержащих соединений для диагностики и терапии" (номер государственной регистрации 01.20.0003061), "Разработка радиофар мпрепаратов, для диагностики и терапии" (номер государственной регистрации 01.9.40002470), «Разработка и биологические испытания наборов реагентов к генераторам мТс и 188Re на основе ксидифона и микросфер альбумина для радионуклидной диагностики и терапии" (номер государственной регистрации 01.20.0407146).
Цель и задачи работы. Исследование посвящено теоретическому и экпериментальному обоснованию разработки основных принципов и критериев анализа радиофармпрепаратов с технецием-99м на примере новых отечественных препаратов «Микросферы альбумина, 99мТс», «ОЭДФ, 99мТс» и «Альбумин, 99мТс» и реагентов для их получения, которые позволили бы проводить контроль их качества и создать нормативную документацию.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи.
1. Обосновать и сформулировать основные принципы и критерии оценки качества нерадиоактивных реагентов и получаемых из них радифармпрепаратов.
2. Разработать схемы химико-фармацевтического и радиохимического анализа: 1) МСА; MCA(Sn); реагента (смесь MCA(Sn), твина-80 и NaCl); и радиофармпрепарата «Микросферы альбумина, 99мТс»; 2) реагента и радиофармпрепарата «Альбумин, 99мТс»; 3) ОЭДФ, реагента и радиофармпрепарата «ОЭДФ, 99мТс».
3. Изучить физико-химические и радиохимические свойства: 1) МСА; MCA(Sn); реагента; радиофармпрепарата «Микросферы, 99мТс»; 2) реагента и радиофармпрепарата «Альбумин, 99мТс»; 3) ОЭДФ, реагента и радиофармпрепарата «ОЭДФ, 99мТс». ;
4. Разработать методики качественного и количественного анализа для: 1) МСА; MCA(Sn); реагента; радиофармпрепарата «Микросферы, 99мТс»; 2) реагента и радиофармпрепарата «Альбумин-99мТс»; 3) ОЭДФ, реагента и радиофармпрепарата «ОЭДФ-99мТс».
5. Разработать унифицированные методики анализа реагентов и радиофармпрепаратов с технецием-99м.
6. Исследовать стабильность свойств субстанций, реагентов и радиофармпрепаратов в процессе хранения.
7. Установить корреляцию результатов химико-фармацевтического и радиохимического анализа с данными биологических испытаний радиофармпрепаратов.
8. Разработать Стандарты предприятия ГУ МРНЦ РАМН "Микросферы альбумина", «ОЭДФ, субстанция».
9. Разработать ФСП на препараты "Микросферы альбумина, 99мт/с"5 «Альбумин,99мТс», «ОЭДФ,99мТс» и реагенты для их получения.
Научная новизна. Впервые разработаны способы и методики полного фармацевтического анализа и оценки качества новых отечественных препаратов для радионуклидной диагностики: "Микросферы альбумина, 99мТс», «Альбумин, 99мТс»; «ОЭДФ, 99мТс» и реагентов для их получения.
Впервые разработаны экспрессные тест-методы, анализа, с использованием индикаторных трубок для определения Sn(II) в реагентах для приготовления РФП.
Разработаны унифицированные методы анализа субстанций, реагентов и РФП с технецием-99м.
Разработаны методики количественного определения компонентов в постадийном контроле синтеза MCA(Sn).
Установлена корреляция результатов химико-фармацевтического анализа с данными биологических испытаний радиофармпрепаратов.
Практическая значимость работы. Разработаны ФСП на препараты "Микросферы альбумина, 99мТс» (ФСП 42-01670477-00), «Альбумин, 99мТс»; «ОЭДФ, 99мТс» и реагенты для их получения. Разработаны Стандарты предприятия (ГУ МРНЦ РАМН) "Микросферы альбумина" (СТП 19-01, от 08.05.01 г.), «ОЭДФ, субстанция» (СТП-32-05 от 14.04.05 г.).
Материалы работы вошли в документацию, на основании которой издан Приказ МЗ РФ № 128 от 30.04.97 г. о разрешении клинического применения препарата "Микросферы альбумина, 99мТс» (регистрационное удостоверение 97/128/7).
Результаты работы по определению олова(П) методом индикаторных трубок вошли в документацию при получении свидетельства о государственной метрологической аттестации УНИИМ Госстандарта РФ ТС-224.09/009-2004 на индикаторные трубки для фирмы ООО «МедЭкоТест» (Москва).
Методики оценки качества препаратов "Микросферы альбумина, 99мТс», «Альбумин, 99мТс», «ОЭДФ, 99мТс», реагентов для их приготовления; МСА, MCA(Sn), ОЭДФ внедрены в лабораторию технологии и методов контроля радиофармпрепаратов ГНЦ РФ-Институт биофизики и в лабораторию экспериментальной ядерной медицины ГУ МРНЦ РАМН.
Апробация работы. Результаты» работы представлены на II, VIII, IX Российских национальных конгрессах «Человек и лекарство» (Москва, 1995, 2001, 2002), Российской национальной конференции "Формирование приоритетов лекарственной политики" (Москва, 1995), Всеросийской конференции "Опухоли висцеральных локализаций: ранняя диагностика, профилактика, лечение" (Томск, 1995), Международном конгрессе «Euroanalysis X» (Базель, Швейцария, 1998), Международных конференциях «Современные проблемы ядерной медицины и радиофармацевтики» (Обнинск, 2000, 2002), I Евразийском конгрессе «Медицинская физика 2001" (Москва, 2001), III Российско-японском семинаре по технецию (Дубна, 2002), III Международном конгрессе «Энергетика-3000» (Обнинск, 2002), Международном форуме «Аналитика и аналитики» (Воронеж, 2003), X Международной конференции «Separations of ionic solutes» (Братислава, Словакия, 2003), Международных конференциях «Ломоносов 2004», «Ломоносов 2006» (Москва, 2004, 2006), Всероссийской конференции «Аналитика России» (Москва, 2004), II Всероссийской конференции «Аналитические приборы» (Санкт-Петербург, 2005), II Международном симпозиуме «Разделение и концентрирование в аналитической химии и радиохимии» (Краснодар, 2005), Международном конгрессе по аналитической химии «ICAS-2006» (Москва, 2006), XXXI годичной сессии научного совета РАН по аналитической химии (Звенигород, 2006), Международной научной сессии "Ядерная медицина и радиофармацевтика" (Обнинск, 2006)
Публикации. Основные результаты работы изложены в печатных работах.
Препараты для исследования гемодинамики
Радиофармпрепараты для диагностики костных заболеваний использовали уже в начале XX века. Как показали исследования ряда ученых, минеральная часть костной ткани представляет собой кристаллы оксиапатита, элементарная ячейка которого содержит Саіо(Р04)б(ОН)2 [34, 35]. Он обладает способностью обмениваться ионами с окружающими его тканевыми жидкостями, поэтому для получения изображения скелета первоначально использовали изотопы в «чистом виде» без «транспортного средства» - 45Са, 47Са, 85Sr, 87mSr, 135mBa, 131Ва, 140Ва, имеющие сродство к костной ткани: 10 85SrCl2+ Са10(РО4)6(ОН)2 = 85Sr10(PO4)6(OH)2 + 10 СаС12.
Указанные изотопы применяли на первых порах для визуализации таких процессов, как образование и рассасывание костной мозоли в процессе заживления переломов, в диагностике злокачественных новообразований[36].
Недостатком использования указанных изотопов является то, что они мало пригодны.для целей визуализации,скелета, поскольку при внутривенном введении они накапливаются не только в кости, но и в окружающих мягких тканях, а также во всех внутренних органах (преимущественно в толстом кишечнике), что не может обеспечить получение контрастного изображения из-за высокого тканевого фона. Также перечисленные изотопы, обладают высокой, энергией у-излучения, длительным-периодом полувыведения и, как следствие, относительно высокими поглощенными дозами. Эти радионуклиды применялись, в основном, в 60-70-х годах XX века и упоминание о них имеет в основном историческое значение [37].
Позже стали использовать позитрон-излучающий изотоп 18F [38, 39]. Атомы фтора-18 замещают гидроксильные группы в структуре оксиапатита костной ткани, сходные с атомами фтора по размеру: 2 18F + Са,о(Р04)б(ОН)2 = Са РС У + 2 ОН .
Этот радионуклид обладает высокой тропностью к костной ткани, однако, он имеет короткий период полураспада (1 = 1,8 часа), «жесткую» энергию у-излучения (510 кэВ), сравнительно высокую стоимость. Все это в целом затрудняет использование изотопа F в диагностических целях. Как уже отмечалось ранее, «идеальным» радионуклидом для 99m-r диагностических целей является Тс.
Для- того чтобы РФП с 99шТс поглощался костной системой, а не накапливался в щитовидной железе, слюнных железах, желудке, а также в мягких тканях (так происходит с пертехнетатом натрия, 99шТс), необходимо использовать «транспортное средство» для изотопа 1 с, имеющее сродство к костной ткани.
Принимая во внимание структуру оксиапатита, авторами [40, 41] было предложено использовать поли- и пирофосфаты в качестве носителя радиоактивной метки 99шТс. Subramanian G. и др. [40] использовали полифосфаты, a Perez R. и др. [41] - пирофосфаты, но накопление этих соединений в кости было невысоким из-за гидролиза связи Р-О-Р пирофосфатазой in vivo. Toll A.J. и др. [42] отметили, что полифосфаты подвержены как химическому гидролизу in vitro, так и гидролизу связи Р-О-Р пирофосфатазой in vivo. Кроме того при получении полифосфатов сложно провести синтез с получением постоянного числа
фосфатных групп в молекуле полифосфата. Поэтому очевидно, что использование поли- и пирофосфатов в качестве транспорта для 99шТс.не оптимально. Вскоре был найден путь решения этой проблемы.
Авторы [43-47] предложили использовать синтетические аналоги неорганического пирофосфата: - дифосфоновые кислоты (или их соли). Дифосфонаты отличаются от пирофосфатовтем что атом кислородау них заменен; на атом углерода (Р-С-Р). Благодаря этой особенности структуры дифосфонаты; химически стабильны in vitro, устойчивы к ферментативному гидролизу пирофосфатазой in vivo. Кроме этого, наличие углерода в группы Р-С-Р позволяет при разнообразной замене боковых цепей синтезировать дифосфонаты с различными биологическими свойствами. Таким образом, структура дифосфонатов обеспечивает их селективное накопление в костной ткани и метаболическую стабильность, поэтому накопление дифосфонатов в скелете выше, чем у пирофосфатов.
Ряд авторов [45, 46] изучали токсичность дифосфонатов (ОЭДФ), поли- и пирофосфатов на мышах и кроликах. Во всех.случаях LD5o составляет 40-70 мг/кг при быстрой и 70-100 мг/кг при медленной инъекциях.
В ГУ МРНЦ РАМН разработан отечественный радиофармпрепарат «ОЭДФ, 1с» и реагент для его приготовления для диагностики костной системы. 1.5. Получение изотопа технеция-99м(99мТс) Метастабильный радионуклид технеция-99м применяется в настоящее время в более чем 80 % всех исследований в ядерной медицине благодаря своим почти идеальным свойствам для сцинтиграфии [48].
Технеций-99м образуется в результате.р-распада изотопа молибдена-99 (рис. 1.2). Известно, что радиоактивный распад, сопровождающийся образованием "дочернего" радиоактивного продукта с иным атомным номером,- позволяет простым химическим способом разделить дочерний и: исходный продукты. Если дочерний радионуклид имеет необходимые для медицинской визуализации характеристики, а у исходного радионуклида достаточно большой период полураспада, чтобы его можно было использовать для получения, обработки и транспортировки, то разделение изотопов может проводиться непосредственно у потребителя и стать удобным источником короткоживущих радионуклидов медицинского назначения. Этот источник получения радионуклидов называют радионуклидным генератором [49-51].
Таким образом, радионуклидный генератор - это устройство для оперативного приготовления короткоживущего изотопа путем химического отделения дочернего изотопа от исходного. Такое разделение можно выполнить с помощью методов хроматографии, дистилляции или фазового разделения. В настоящее время первый из методов изучен лучше всего и используется в большинстве генераторов (рис. 1.3) [49].
Наиболее широко используемым в ядерной медицине изотопом, получаемым с помощью радионуклидного генератора, является технеций-99м. Исходный изотоп молибдена-99 имеет период полураспада около 66 ч, он может быть получен облучением природного молибдена или обогащенного урана-235 тепловыми нейтронами в ядерном реакторе. Молибден-99 наносится1 на сорбент, в качестве которого используют оксид алюминия или оксид марганца(ІУ). Полученный таким образом сорбент с нанесенным на него молибденом-99 помещается в хроматографическую колонку, являющуюся главным элементом генератора. Молибден-99 распадается на технеций-99м (87%) и технеций-99 (13%).
Взаимосвязь аналитических показателей качества и клинических требований для РФП
Внешний вид, размеры частиц, растворимость, подлинность, количественное определение
В литературе отсутствуют сведения по анализу микросфер альбумина, модифицированных оловом(П). Нами были выбраны параметры в MCA(Sn), которые необходимо контролировать, и разработаны методики их определения. Большинство параметров для MCA(Sn) совпадает с аналогичными для МСА, за исключением содержания олова. Известно, что олово на МСА содержится не только в виде Sn(II), от которого зависит качество РФП, но и в виде Sn(IV), которое появляется в процессе модификации в результате окисления Sn(II), и является балластом.
Определение олова(П) в альбуминовых микросферах является сложной задачей, поскольку, во-первых, оно содержится в очень малом количестве (около 3 7 мкг/мг микросфер); во-вторых, для одного анализа можно использовать всего 10 20 мг микросфер; в-третьих, имеет место совместное присутствие олова(П) и большого количества по сравнению с ним (по массе) белковой матрицы; в четвертых, олово(П) легко окисляется кислородом воздуха и гидролизуется. С другой стороны, используемые в анализе химические и физико-химические методы предполагают предварительное переведение анализируемой пробы в раствор, что в случае MCA(Sn) влечет за собой возможное окисление Sn(II) до Sn(IV), и поставленная цель - определение Sn(II) - достигнута не будет. Если провести предварительное отделение олова(И) от микросфер, то неминуема потеря определяемого элемента, принимая во внимание указанные выше концентрации Sn(II) в микросферах и количество пробы для анализа. Остается один путь , разработать способ определения Sn(II) при его совместном с микросферами присутствии. В литературе известны методы определения олова(П) в различных объектах s [123].
Однако в связи с приведенными выше соображениями круг методов, которые могут быть применены для определения олова(И) в MCA(Sn), ограничен. Так, для часто применяемого окислительно-восстановительного титрования растворов Sn(II) (с визуальным обнаружением точки эквивалентности) с использованием в качестве окислителей растворов иода, иодата и бромата калия потребуется 20-40 мг олова(П), что на порядок превышает его содержание, и выделения Sn(II). Более чувствительный потенциометрический метод обнаружения,точки эквивалентности также требует отделения олова(П) от белковой,матрицы. То же самое относится и к полярографическому методу определения Sn(II), получившему широкое распространение в последнее время. Определение Sn(II) во всех перечисленных методах проводят в инертной атмосфере. Наибольший интерес, с нашей точки зрения, представляет публикация [124], в которой описано титрование ряда окислителей, в частности, бихромата калия, хлорного железа, ванадата аммония, феррицианида калия, взятых на уровне десятков миллиграмм, с помощью растворов олова(П). Мы полагали возможным попытаться использовать реакции этих окислителей с оловом(П) для спектрофотометрического определения микрограммовых его количеств без отделения от микросфер альбумина. Такого типа реакции описаны и в других публикациях [125-128]. По аналогии с упомянутыми, выше окислителями определение олова(И), по-видимому, можно проводить также на основе реакций с хроматом натрия с применением дифенилкарбазида [125], с однохлористым иодом [126], с молибдатом натрия [127] и с перренатом калия [128] в присутствии роданида калия.
В микросферах, модифицированных оловом(П), предназначенных для получения РФП с технецием-99м, помимо содержания Sn(II) необходимо также оценить и общее его содержание Sn(II) + Sn(IV). Это требуется для того, чтобы знать, во-первых, соответствует ли найденное в MCA(Sn), а в дальнейшем и в реагенте, количество олова его количеству, взятому в переработку, и на основе этого установить возможные причины потерь в процессе синтеза; во-вторых, чтобы проследить,за изменением содержания олова(П) относительно общего содержания олова при хранении реагента.
В литературе известны методы определения Sn(IV) в различных объектах [123]. Однако в связи с тем, что, во-первых, большая часть олова на микросферах находится в двухвалентном состоянии (около 90%), и, следовательно,.содержание общего олова также мало (на уровне десятков микрограмм); во-вторых, предварительное выделение олова с микросфер с целью последующего его определения, как и в случае с Sn(II), трудновыполнимо из-за малого содержания олова; в-третьих, при определении общего олова в растворе без его выделения с микросфер неминуемо влияние белковой матрицы на результаты определения, круг методов, которые можно использовать для определения общего олова в виде Sn(IV), ограничен. В данной ситуации мы полагали возможным выбрать следующий путь: устранить влияние белковой матрицы без предварительного выделения олова и после этого разработать подходящий способ определения олова.
Для решения первой задачи в аналитической химии традиционно используются различные методы разложения органических веществ [129-132].
Часто применяемое разложение веществ без изменения степени окисления элементов с использованием хлороводородной и бромоводородной кислот, с нашей точки зрения, неприемлемо для MCA(Sn) из-за возможных потерь Sn(IV) в виде летучих галогенидов, которые могут достигать 10-52%. То же относится- и к неокислительному разложению серной кислотой, в условиях которого возможны потери олова(ГУ) до 4,9% [129].
В анализе широко используются-окислительные методы разложения: "сухое" и "мокрое". Для сухого озоления, предполагающего нагревание пробы в открытом сосуде на воздухе, масса анализируемой пробы обычно составляет 1-10 г, что неприемлемо для MCA(Sn) по указанным выше причинам. Кроме того, метод сухого озоления редко используют при определении олова в органических материалах, поскольку возможно его улетучивание в виде SnCli [129].
Спектрофотометрическое определение олова(П) по «рениевой» методике
Содержимое флакона с реагентом растворяли в 0,3 мл ЗМ раствора хлороводородной кислоты (раствор реагента солянокислого). Отбирали 4,3 мл ЗМ раствора хлороводородной кислоты и помещали в пробирку вместимостью 5 мл с притертой пробкой, прибавляли 0,3 мл 0,005М раствора перрената калия, ОД мл 2,5 М раствора роданида калия и 0,3 мл раствора реагента солянокислого.
Сразу измеряли оптическую плотность полученного раствора на спектрофотометре в максимуме поглощения при 353 нм в кювете с толщиной поглощающего слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения использовали раствор, содержащий все компоненты в указанных количествах, кроме раствора реагента солянокислого, вместо которого вносили 0,3 мл ЗМ раствора хлороводородной кислоты.
Содержание олова двухвалентного во флаконе (Gsn ) в миллиграммах вычисляли по формуле: где А - оптическая плотность испытуемого раствора; 118,69 - атомная масса олова; 0,3 - объем раствора реагента солянокислого, мл; 5 - объем испытуемого раствора, мл; 15731 - молярный коэффициент погашения, л/моль-см; 0,3 - объем раствора реагента солянокислого, взятый для анализа, мл. Результаты определения олова(П) в реагенте представлены в табл. 3.3. Таким образом, разработана простая, точная и воспроизводимая «рениевая» методика спектрофотометрического определения олова(П) в реагенте для приготовления радиофармпрепарата «Альбумин, 99мТс».
Вторая реакция [124], используемая для количественного определения Sn(II), основана на восстановлении Fe(III) стандартным раствором Sn(II) в сильном солянокислом растворе. Мы решили попытаться применить эту реаіщию для определения олова(П).
При этом имелось ввиду, что эквивалентное количество образующегося в результате реакции Fe(II) может быть определено спектрофотометрически, например, с помощью о-фенантролина [236], дающего с духвалентным железом окрашенный комплекс с широкой полосой поглощения, имеющей максимум при 510 нм (раздел 2.2.2).
Прежде всего был построен градуировочный график для определения олова(П) в стандартных растворах. Методика приготовления стандартных растворов для построения градуировочного графика, градуировочный график, результаты определения олова(П) в растворах с известным его содержанием представлены в разделе 2.2.2 (рис. 2.6, табл. 2.4). Установлено, что линейная зависимость оптической плотности растворов комплекса Fe(II) с о-фенантролином от концентрации олова(П) наблюдается в интервале 0,5-7,0 мкг/мл в измеряемом растворе (рис. 2.6). Рассчитан условный молярный коэффициент погашения, который составляет 19800±594 (п=5, Р=0,95). Результаты определения олова(П) в растворах с известным его содержанием (табл. 2.4) показывают, что методика дает правильные и хорошо воспроизводимые результаты. Затем была разработана спектрофотометрическая методика определения олова(П) в реагенте по реакции восстановления им Fe(III) до Fe(II) с последующим образованием окрашенного комплекса Fe(II) с о-фенантролином. Методика спектрофотометрического определения Sn(II) в реагенте («железная» методика)
Во флакон с реагентом вносили 1,0 мл воды, перемешивали до растворения.
После этого прибавляли 1,0 мл раствора железоаммонийных квасцов с концентрацией Fe(III) 1,0 мг/мл и перемешивали в течение 10 минут. После этого во флакон прибавляли 0,7 мл З М раствора натрия уксуснокислого, 0,5 мл 1% спиртового раствора о-фенантролина, 7,0 мл воды и перемешивали. Через 20 минут измеряли оптическую плотность полученного раствора при 510 нм в кювете с толщиной поглощающего слоя 1 см, применяя в качестве раствора сравнения раствор, приготовленный аналогичным образом и содержащий все компоненты в указанных количествах, кроме определяемого вещества.
Содержание G олова(П) во флаконе (в миллиграммах) вычисляли по формуле: где А - оптическая плотность анализируемого раствора; 118,69 - атомная масса олова; 10,2 - общий объем испытуемого раствора, мл; 19 800 - условный молярный показатель погашения, л/моль-см. Содержание олова(П) во флаконе с реагентом изменялось от 0,012 до 0,018 мг.
Для доказательства правильности разработанных методик определения олова(П) мы попытались разработать также методику определения олова(П) в виде олова(ІУ).
Известно, что при определении олова(Р/) в растворе без его отделения от альбумина неминуемо влияние белковой матрицы на результаты определения. В данном случае мы сочли необходимым действовать следующим образом: 1) устранить влияние белковой матрицы без предварительного выделения олова; 2) окислить имеющееся в реагенте Sn(II) до Sn(IV); 3) разработать подходящий способ определения общего олова. Наиболее приемлемым способом решения двух первых задач является "мокрое" окислительное озоление реагента (раздел 2.2.3).
При выборе метода определения олова(П) в виде Sn(IV) мы взяли за основу реакцию Sn(IV) с пирокатехиновым фиолетовым с образованием окрашенного комплекса, для определения которого мы разработали спектрофотометрическую методику.
Прежде всего мы воспроизвели разработанную нами ранее спектрофотометрическую методику определения олова(И) в виде Sn(IV) на стандартных растворах олова(ГУ) с пирокатехиновым фиолетовым (раздел 2.2.3).
Был построен градуировочный график зависимости оптической плотности окрашенного комплекса олова(ГУ) с пирокатехиновым фиолетовым от содержания олова(ГУ). Закон Бугера-Ламберта-Беера выполняется в интервале от 0,2 до 1,6 мкг/мг олова(ІУ). Погрешность определения не превышает П5,0%. Далее была разработана методика определения Sn(IV) в модельных смесях реагента, содержащих 10 мг альбумина и 15 мкг олова(П).
