Содержание к диссертации
Введение
глава. Обзор литературы. 18
глава. Материалы и методы. 62
глава. Анализ и моделирование современной эпидемиологической ситуации по туберкулезу .
3.1. Формулирование определения "Эпидемический генотип". 76
3.2. Оценка глобального распределения отдельных генотипов МБТ и эпидемиологическая концепция, отражающая пути распространения инфекции на территории СССР .
3.3. Моделирование процесса распространения генотипа "Пекин" в Евразии в XX веке по молекулярно-генетическим данным
глава. Оценка ситуации по туберкулезу на примере региона эпидемического неблагополучия - иркутской области, выявление доминирующих эпидемических генотипов Mycobacterium tuberculosis.
4.1. Оценка эпидемической ситуации в регионе с использованием интегрального показателя.
4.2. Филогенетическая модель распространения генотипов МБТ в Иркутской области по результатам ERIC-PCR генотипирования.
4.3. Филогенетическая модель распространения генотипов МБТ в Иркутской области по результатам MIRU-VNTR генотипирования. Выявление эпидемических генотипов .
Глава. Исследование генетического полиморфизма кандидатных генов устойчивости к туберкулезу .
5.1. Сравнение генетического полиморфизма кандидатных генов устойчивости к туберкулезу (ACE, AT1R, AT2R, DC-SIGN, INF-, MCP-1) у больных туберкулезом легких и здоровых людей.
5.2. Распределение генотипов человека и генотипов M. tuberculosis у больных туберкулезом легких
5.3. Выявление "летального синергизма" между генотипом "Пекин" M. tuberculosis и аллелем -336G CD209 у больных туберкулезом легких.
Глава. Сравнительная оценка активности передачи различных генотипов mycobacterium tuberculosis у больных туберкулезом легких .
Глава. Обсуждение результатов исследования. 186
Выводы. 199
Практические рекомендации. 201
Список литературы
- Оценка глобального распределения отдельных генотипов МБТ и эпидемиологическая концепция, отражающая пути распространения инфекции на территории СССР
- Моделирование процесса распространения генотипа "Пекин" в Евразии в XX веке по молекулярно-генетическим данным
- Филогенетическая модель распространения генотипов МБТ в Иркутской области по результатам MIRU-VNTR генотипирования. Выявление эпидемических генотипов
- Распределение генотипов человека и генотипов M. tuberculosis у больных туберкулезом легких
Введение к работе
Актуальность темы. Туберкулез (ТБ) является одной из злободневных проблем практического здравоохранения во всем мире. По данным Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ) за 2012 год в мире зарегистрировано 8,7 млн. новых случаев, заболеваемость составила 125 случаев на 100 тыс. населения (WHO, 2012). Подъем заболеваемости, характерный для двух последних десятилетий, имел место не только в экономических отсталых странах, но и в развитых государствах Западной Европы, а также в США (Онищенко, 2008). Эта неблагоприятная тенденция наблюдается и в настоящее время при наличии эффективных схем лечения и методов диагностики.
Россия находится на 11-м месте среди 22-х стран с наиболее высоким уровнем заболеваемости туберкулезом (Atun at al., 2005). В последние десятилетия для России был характерен рост всех основных эпидемиологических показателей по туберкулезу (Перельман, 2007). В 2012 году по сравнению с 2011 годом в РФ улучшились показатели заболеваемости по туберкулезу, произошло снижение с 73,0 до 68,1 на 100 000 населения, пик последнего подъема пришелся на 2008 год 85,1 на 100 000 населения (Нечаева, 2012а). Несмотря на снижение, общая смертность от туберкулеза в 2012 составила 12,5 на 100 тыс. населения, что соответствует 56% смертности от всех инфекционных и паразитарных заболеваний (Нечаева, 2012а). Приведенные показатели все еще далеки от показателей 1990 года (смертность 9,5 на 100 000), соответствовавшим началу подъема заболеваемости (Перельман, 2007). В свою очередь, заболеваемость и смертность от туберкулеза в Сибирском федеральном округе (СФО) является одними из наиболее высоких в стране (Нечаева, 2012б). В 2012 г. заболеваемость туберкулезом в СФО снизилась до 109,5 на 100 000 населения (2011 год – 120,4). В Иркутской области в 2012 г. заболеваемость туберкулезом составила 137,9 на 100 000 населения (2011 год - 152,5) (Нечаева, 2012б). Иркутскую область, как и весь СФО, отличает крайне высокий показатель смертности от туберкулеза - 41,5 на 100 000 населения (ТБ в РФ, 2011), что во много раз превышает аналогичные показатели в более западных областях страны.
Неэффективность современных противоэпидемических мероприятий на фоне пандемии туберкулеза свидетельствует об острой необходимости изменения стратегии и тактики эпидемиологического надзора по отношению к этой инфекции.
Распространение туберкулеза приобрело в последние десятилетия характер пандемии (Bifani et al., 2002), важнейшим этиологическим агентом которой является генетически близкая группа штаммов, получившая название генотип “Пекин”. Само открытие семейства штаммов генотипа "Пекин" (Beijing) было одним из наиболее ярких примеров применения методов молекулярной эпидемиологии (Van Soolingen et al., 1995). Под влиянием этих работ был разработан ряд математических моделей возникновения и исчезновения генотипов туберкулеза. Опираясь на результаты исследования генетического полиморфизма возбудителя туберкулеза по всему миру (Tanaka et al., 2006), была предложена модель возникновения и персистенции эпидемических генотипов микобактерий туберкулеза (МБТ). В рамках модели эпидемический генотип МБТ описывается как "кластеризующийся", т.е. имеющий минимальные генетические различия между штаммами, в большом количестве циркулирующими на какой-то определенной территории.
Генотипическая характеристика возбудителя туберкулеза до настоящего времени проводится только в единичных отечественных научных исследованиях и не применяется ни в клинической, ни в эпидемиологической работе противотуберкулезной службы. В тоже время, страны Евросоюза уже используют методы молекулярного генотипирования в эпидемиологической практике борьбы с туберкулезом. Например, на ежегодном совещании Европейского бюро ВОЗ и Европейского Центра по борьбе с болезнями (ЕЦББ) в 2009 в Хорватии метод генотипирования туберкулеза MIRU-VNTR рекомендован как референс-метод в молекулярном эпидемиологическом надзоре за туберкулезом (WHO, 2009).
Рассматривая эпидемический процесс при туберкулезе как саморегулирующийся процесс взаимодействия двух генетически гетерогенных популяций возбудителя МБТ и хозяина (H. sapiens) (Беляков и др., 1987), для полноценного прогнозирования нельзя остановиться только на этапе наблюдения за циркуляцией возбудителя и изменчивости его генотипов. Не менее важным вопросом является восприимчивость человеческой популяции к туберкулезу, а именно географическая, национальная и половая неоднородность распределения чувствительных к туберкулезу индивидуумов. Полноценный анализ и прогнозирование развития эпидемии туберкулеза должен учитывать количество иммунных (устойчивых к инфекции) и чувствительных индивидуумов в исследуемой популяции.
Для туберкулезной инфекции наличие в анамнезе БЦЖ вакцинации не является синонимом полной защиты от инфекции (Перельман, 2007). Более того, ряд исследователей считает, что именно внедрение массовой БЦЖ вакцинации явилось толчком для пандемического распространения генотипа "Пекин" (Parwati et. al., 2010). C другой стороны, необходимость вакцинации неоспорима, поскольку именно с началом вакцинации произошло существенное снижение заболеваемости рядом опасных форм туберкулеза у детей (Перельман, 2007). Безусловно, вопрос о разработке критериев оценки восприимчивости к туберкулезу людей на популяционном уровне является в значительной степени задачей современной эпидемиологии. Перспективным подходом для такого рода оценки является применение методологии популяционной генетики в эпидемиологическом анализе. Изучение генетического полиморфизма кандидатных генов устойчивости к туберкулезу в качестве инструмента позволит эпидемиологам и фтизиатрам получить прогностически значимые результаты, отражающие восприимчивость человеческой популяции к туберкулезу на уровне врожденной (неспецифической) устойчивости, что при данной инфекции зачастую более важно, чем наличие специфического иммунитета.
Цель работы – изучить молекулярно-генетические характеристики популяционного полиморфизма возбудителя и хозяина для оптимизации системы мониторинга и прогнозирования эпидемического процесса туберкулезной инфекции.
Задачи исследования
1. Проанализировать эпидемиологическую ситуацию по туберкулезу на территории Иркутской области.
2. Изучить распределение основных генотипов возбудителя туберкулеза на территории Иркутской области, выявить эпидемические генотипы M. tuberculosis.
3. Провести исследование генетического полиморфизма больных туберкулезом легких по отдельным кандидатным генам устойчивости к туберкулезу, выявить сцепленность генотипа "Пекин" (M. tuberculosis) с генотипом хозяина (H. sapiens) по исследуемым генам.
4. Осуществить ретроспективный анализ распространения различных генотипов M. tuberculosis в аутопсийных образцах от больных туберкулезом легких, выявить сцепленность генотипа "Пекин" (M. tuberculosis) с генотипом хозяина (H. sapiens) по исследуемым генам у умерших.
5. Сравнить распространение различных генотипов возбудителя M. tuberculosis и его лекарственной устойчивости среди ВИЧ-негативных и ВИЧ-позитивных больных туберкулезом легких.
6. Сформулировать эпидемиологическую концепцию, объясняющую современную ситуацию распространения туберкулеза в России и мире.
7. Провести филогенетическое моделирование процессов образования основных эпидемических генотипов M. tuberculosis в России.
Научная новизна
Впервые сформулирована научная концепция, объясняющая причину высокого распространения пандемического генотипа "Пекин" M. tuberculosis на территории России и постсоветского пространства, исходя из политических и экономических событий ХХ века.
Изучено влияние генетического полиморфизма микроорганизма и макроорганизма на паразитарную систему эпидемического процесса туберкулезной инфекции.
На основании данных молекулярно-генетических исследований по выявлению сочетаний в генах паразита и хозяина показано наличие "летального синергизма" при совпадении определенного генотипа возбудителя (M. tuberculosis) и одного из вариантов гена CD209 у человека.
Сформулировано молекулярно-генетическое определение генотипа "Урал" M. tuberculosis.
Впервые основные генотипы возбудителя туберкулеза из Сибири были представлены в глобальной базе штаммов ТБ SITVIT.
Практическая и теоретическая значимость работы
Разработанные подходы и полученные данные позволяют оптимизировать систему эпидемиологического надзора за туберкулезной инфекцией. Представлена концепция о "взрывообразном" распространении генотипа "Пекин" по территории СССР. Использование результатов молекулярно-генетического мониторинга при работе в очагах туберкулезной инфекции позволит за относительно короткий период времени при небольших материальных затратах максимально точно, на уровне генотипа, установить источники возбудителя инфекции, пути и факторы его передачи, а также временные и пространственные границы очагов.
Полученные данные о "летальном синергизме" между генотипом “Пекин” и аллелем -336G CD209 гена человека у больных туберкулезом легких могут лечь в основу алгоритма установления эпидемиологического диагноза и прогнозирования клинических исходов туберкулеза легких.
Положения, выносимые на защиту
-
Соотношение эпидемических и неэпидемических генотипов возбудителя туберкулеза, циркулирующих в популяции населения, наиболее значительно изменяется при глобальных миграционных процессах и социальных катаклизмах
-
Важнейшим эпидемическим генотипом на территории Иркутской области является генотип "Пекин", MIT17 является наиболее трансмиссивным субтипом данного генотипа является .
-
Среди исследованных кандидатных генов устойчивости к туберкулезу легких (ACE, AT1R, AT2R, CD209, INF-, MCP-1) из Иркутской области и генотипов микобактерий, выделенных от этих же больных, только аллелель -336G гена CD209 обнаружил протективные свойства относительно генотипа "Пекин" для мужчин. Сочетание мужского пола, генотипа "Пекин" M. tuberculosis и наличие аллеля -336G CD209 в случае заболевания туберкулезом легких значимо повышает вероятность летального исхода заболевания.
-
Различия в распространенности генотипов и субтипов M. tuberculosis среди ВИЧ-позитивных и ВИЧ-негативных больных туберкулезом легких в Иркутской области свидетельствуют о наличии "сверх-трансмиссивного" высоковирулентного субтипа MIT17 генотипа "Пекин". В тоже время, активность передачи всех остальных субтипов семейства "Пекин" и других генотипов возбудителя не различается.
Внедрение в практику. Результаты исследований внедрены в практику работы ГБУЗ "Иркутский областной противотуберкулезный диспансер".
Материалы исследований использовались при разработке пособия для врачей "Лабораторная диагностика туберкулёза" (Иркутск, 2011. – 41с., ГБО ДПО ИГМАПО), которые были внедрены в учебный процесс Иркутской Государственной Медицинской Академии последипломного образования.
Материалы исследований использовались при разработке пособия для врачей "Генетическая диагностика туберкулёза у ВИЧ-позитивных и ВИЧ-негативных больных" (Иркутск, 2013. – 21с., ГБО ДПО ИГМАПО), которые были внедрены в учебный процесс Иркутской Государственной Медицинской Академии последипломного образования.
Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе при чтении лекций и проведении практических занятий со студентами, интернами, ординаторами и врачами на кафедре эпидемиологии и кафедре туберкулеза ГБО ДПО ИГМАПО, студентами и бакалаврами кафедры микробиологии ИГУ.
Апробация работы и публикации
Основные результаты диссертационной работы были доложены и обсуждены на следующих конференциях: VII и IX съездах фтизиатров России (Москва, 2003, 2011); 5-ой и 6-ой Всероссийских научно-практических конференциях "Генодиагностика инфекционных заболеваний" (Москва 2004, 2007); "Генодиагностика инфекционных болезней" (Новосибирская обл., 2005); IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008); 8th Nordic Baltic Congress On Infectious Diseases (St. Peterburg, 2009); Научной конференции с международным участием "Этиологические, эпидемиологические и клинические аспекты инфекционных болезней" (Иркутск, 2010); IX Российско-немецкой научно-практической конференции "Новые горизонты: инновации и сотрудничество в медицине и здравоохранении" (Новосибирск, 2010); Межрегиональной научно-практическая конференция "Современная микробиологическая диагностика туберкулеза" (Владивосток 2010); VII Всероссийской научно-практической конференция с международным участием "Молекулярная диагностика - 2010" (Москва, 2010); Научно-практической конференции с международным участием "Мониторинг туберкулеза и сопутствующие заболевания" (Иркутск, 2011); Научно-практической конференции "Актуальные проблемы противотуберкулезной помощи и перспективы ее совершенствования" (Улан-Удэ, 2011); 3rd Asia PaCific Region Conference of the International Union Against Tuberculosis and Lung Disease (Hong-Kong, 2011); на заседании Иркутского областного общества эпидемиологов (Иркутск, 2011); на заседании Иркутского областного общества фтизиатров (Иркутск, 2011); 15th International Congress on Infectious Diseases (Bangkok, Thailand, 2012); Научной конференции с международным участием "Фундаментальные и прикладные аспекты инфекционной патологии" (Иркутск, 2012); IV Ежегодном Всероссийском конгрессе по инфекционным болезням (Москва, 2012); Межрегиональной научно-практической конференции "Совершенствование организации противотуберкулезных мероприятий в условиях Крайнего Севера и Дальнего Востока" (Якутск, 2013); Международной конференции "Молекулярная эпидемиология актуальных инфекций" (Санкт-Петербург 2013).
По теме диссертации опубликована 51 работа, из них одна монография и 25 статей в журналах, включенных в перечень, рекомендуемых ВАК для публикации основных результатов диссертаций на соискание ученой степени доктора и кандидата наук.
Место выполнения работы и личный вклад автора. Основные результаты получены лично автором, которым генерирована идея исследования, сформулированы цели, задачи и выводы. Самостоятельно проведено большинство лабораторных исследований, анализ и интерпретация полученных результатов, моделирование изучаемых процессов. Выделение штаммов и определение их чувствительности к противотуберкулезным препаратам было проведено в ГБУЗ Иркутский областной противотуберкулезный диспансер, в том числе и самим автором во время работы в данном учреждении. Клинические образцы были получены в Иркутском областном диагностическом центре, как самим автором во время работы в данном учреждении, так и В.В. Синьковым (автор являлся соруководителем его кандидатской диссертации). Аутопсийные образцы тканей получены в Иркутском областном патологоанатомическом бюро при совместной работе с сотрудником данного учреждения С.Л. Антипиной. Сполиготипирование штаммов из Иркутской области выполнялось в Институте Пастера в Санкт-Петербурге и Институте Пастера в Гваделупе. Молекулярно-генетические исследования по MIRU-VNTR и генетическому полиморфизму генов человека, компьютерный и статистический анализ данных были проведены автором в лаборатории эпидемически и социально значимых инфекций НЦ ПЗСРЧ СО РАМН и на кафедре эпидемиологии ГБОУ ДПО ИГМАПО. Мутации, отвечающие за лекарственную устойчивость штаммов туберкулеза, определялись секвенированием в Медицинской Школе Университета Вирджинии, США.
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 304 страницах машинописного текста, состоит из введения, главы обзора литературы, главы материалов и методов, четырех глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, который включает 312 наименований, в том числе 71 отечественных и 241зарубежных авторов. Работа содержит 21 таблицу, иллюстрирована 15 рисунками.
Оценка глобального распределения отдельных генотипов МБТ и эпидемиологическая концепция, отражающая пути распространения инфекции на территории СССР
Начиная с 90-х годов прошлого века, методы молекулярной эпидемиологии стали активно внедряться в работу научно-исследовательских лабораторий. В качестве молекулярного маркера генетического полиморфизма микобактерий туберкулеза важное значение имеют IS-элементы генома. Их длина обычно составляет около трех тысяч пар нуклеотидов. Эти нуклеотидные последовательности способны к миграции и дупликации (удвоению) в пределах одного генома. Они способны переносить информацию, необходимую им для транспозиции (перемещения). Транспозиция IS-элементов представляет собой спонтанный процесс и способна нарушать целостность генов (Safiet et al., 2004) Предполагается, что в процессе транспозиции IS элементов изменяется экспрессия генов у микроорганизмов, что, в конечном итоге, расширяет возможности адаптации микроба к неблагоприятным факторам внешней среды (Blot, 1994). У всех представителей M. tuberculosis complex в геноме был обнаружен элемент IS6110, определение которого легло в основу первого метода генетической классификации M. tuberculosis complex - IS6110-ПДРФ (Thierry et al., 1990; Hermans et al., 1990) и со временем стало "золотым стандартом" молекулярной эпидемиологии туберкулеза Первым описанием метода "молекулярной дактилоскопии", примененного к штаммам туберкулеза, стало использование ПДРФ анализа (анализ длины рестрикционных фрагментов ДНК) с зондом IS986 для штаммов ТБ, выявленных в Нью-Йорке (Hermans et al., 1990). С января 1989 по апрель 1990 г. было выявлено 18 случаев лекарственно-устойчивого (ЛУ) туберкулеза (резистентного к изониазиду и стрептомицину) среди ВИЧ- инфицированных больных (Edlin et al., 1992). Затем вспышки ЛУ туберкулеза были зарегистрированы в других 23 штатах США.
Принцип был заимствован из метода "геномной дактилоскопии", применяемого как для эукариотических организмов, так и для прокариотов. Наличие двух высокомолекулярных полос в электрофорезе в области 9,2 и 7,1 т.п.н. является ключевым признаком для определения паттерна В0/W148 генотипа "Пекин", субтип MIT17 по глобальной базе данных SITVIT (Приложение 1).
Данный метод впервые позволил провести классификацию микобактерий на генетическом уровне и заложил основу молекулярной эпидемиологии туберкулеза. Однако из-за существенных недостатков его применение в исследованиях глобального движения штаммов возбудителя туберкулеза было ограничено. Ключевыми недостатками данного метода является необходимость выращивания в больших объемах в жидких средах культуры микобактерий. Кроме того, достаточно сложно проводится унификация и стандартизация исследуемых генотипов. На получение конечного результата уходит несколько месяцев (Hermans et al., 1990). Кроме того, работа с жидкой культурой микобактерий требует оснащения лаборатории оборудованием с высоким уровнем биологической защиты. Именно поэтому явные успехи первой генетической классификации микобактерий и ее существенные методологические недостатки потребовали разработки новых специфических маркеров и новых подходов для идентификации и классификации микобактерий.
Следующим, широко используемым методом, стал метод сполиготипирования (англ. Spacer oligonucleotide typing). Было установлено, что все представители M. tuberculosis complex, в своем геноме, имеют специфический DR-регион, образованный тандемно расположенными последовательностями ДНК, длиной 36 пар нуклеотидов. Сами повторы, в свою очередь, разделены небольшими уникальными последовательностями ДНК -спейсерами длиной, варьирующей от 35 до 41 пар нуклеотидов (Mathema et al., 2006). Известно, что DR-регион относится к группе коротких палиндромных повторов, регулярно расположенных группами (CRISP), играющими важную роль в борьбе бактерий с инвазией чужеродных фрагментов ДНК (фагов). Спейсеры CRISPR системы, в большинстве своем, уникальны и представляют собой небольшие участки фаговой ДНК, оставшейся от предыдущих фаговых инвазий (Mojica et al., 2005). При сполиготипировании определяется 43 уникальных спейсера M. tuberculosis complex (Kamerbeek et al., 1997; Kato-Maeda et al., 2010). Специфические профили (сполиготипы) представлены в виде SIT (англ. Spoligotype sharedype international type) в глобальной базе данных SITVIT (ранее SpolDB4), насчитывающей на 2012 год около 2000 уникальных профилей, полученных из более чем 120 стран мира (Demaya et al., 2012). Cполиготипирование лишено основных недостатков ПДРФ-анализа и допускает использование любого материала, содержащего ДНК микроба, включая образцы парафиновых срезов (Qian et al., 1999). Однако его разрешающая способность находится ниже ПДРФ-анализа. Штаммы, имеющие идентичные сполигопрофили, в то же время могут принадлежать к различным группам при IS6110 ПДРФ анализе (van Embden et al., 2000). Например, семейству "Пекин", обширной группе генотипов МБТ, соответствуют сотни различных ПДРФ профилей, в то время как сполиготипирование определяет только двадцать один паттерн (Приложение 2), характеризующийся протяженной делецией спейсеров 1-34 и отсутствием или минорными делециями в остальных спейсерах (Van Embden et al., 2000).
Моделирование процесса распространения генотипа "Пекин" в Евразии в XX веке по молекулярно-генетическим данным
Классическим примером влияния естественного отбора на человеческую популяцию является малярия. Естественная резистентность к малярии проявляется в виде так называемого гетерозиготного супердоминирования, когда в популяции людей наблюдается высокая частота доминантного (протективного) аллеля, сформированная за счет большого числа гетерозиготных носителей. Все это происходит, несмотря на то, что гетерозиготное носительство аллеля проявляется, как патология в виде серповидно-клеточной анемии. Рецессивный аллель при гомозиготном носительстве в этом случае является летальным (Allison, 1954). Дополнительными факторами, усиливающими это явление, могут служить, например, пол (мужской или женский) или возраст.
Восприимчивость к туберкулезной инфекции, как к мультифакторному заболеванию подвержена влиянию многих генов с различным вкладом каждого из них в формирование того или иного исхода болезни. При этом один и тот же ген может участвовать в формировании чувствительности/резистентности к нескольким инфекционным заболеваниям. Сочетания генов предрасположенности к болезни могут быть неодинаковыми в популяциях, обусловливая различия в подверженности заболеванию у разных народов. В связи с этим перспективным направлением исследований генетических основ предрасположенности к ТБ является изучение вкладов конкретных генетических полиморфизмов в различающихся как по расовой, так и по этнической принадлежности в популяциях (Пузырев, 2003). Поиск генетических факторов, ответственных за подверженность инфекционным заболеваниям, включая ТБ, начался в середине прошлого века с изучения ассоциаций групп крови и других фенотипических признаков с заболеванием (Hill, 2012). С развитием молекулярно-генетических технологий началась эра ассоциативных исследований, заключающаяся в поиске ассоциаций полиморфных вариантов различных генов-кандидатов с исследуемым фенотипом методом "случай – контроль". Этот подход позволил обнаружить ассоциации ТБ с десятком генов, однако основным его недостатком является противоречивость результатов, полученных в различных популяциях, что может быть обусловлено рядом причин: дизайном исследования, объемом и однородностью исследуемых выборок, этнической специфичностью частот аллелей генов подверженности, влиянием эпигенетических факторов (Azad et al., 2012). На фоне успехов изучения генома человека все большую популярность приобретают полногеномные ассоциативные исследования (genome-wide association study – GWAS), обладающие высокой мощностью и позволяющие идентифицировать новые гены-кандидаты на основе их геномной локализации без знания о биологическом эффекте или типе наследования этих генов (Пузырев, 2011; Рудко и др., 2011,2013; Hill, 2012). Исходя из концепции общих патогенетических механизмов, результаты GWAS, установившие локусы восприимчивости разных иммунных патологий, могут быть использованы для поиска генов подверженности ТБ.
По данными HuGENet (анг. Human Genome Epidemiology Network) информационного портала, созданного Центром по контролю и профилактике заболеваний США для сбора и анализа информации по генам предрасположенности к заболеваниям у людей, на сегодняшний день известно более 180 генов-кандидатов, связанных с восприимчивостью к туберкулезной инфекции. При этом, в многочисленных работах, различные авторы, изучая одни и те же гены, приходят зачастую к противоположным выводам. Одной из причин этого феномена могут быть, как указано выше, расовые различия в устойчивости к туберкулезу. Однако популяционные и расовые различия, связанные с восприимчивостью к этой инфекции, являются не единственно возможным объяснением. Другим весьма важным фактором, влияющим на результат взаимодействия чувствительной популяции хозяина с возбудителем, может быть генетическая гетерогенность инфекционного агента. Другими словами, влияния отдельных генов-кандидатов устойчивости к ТБ в популяции людей, проживающих на конкретной территории на вероятность заболеть туберкулезом, может напрямую зависеть от спектра генотипов M. tuberculosis, циркулирующих в данном регионе.
На сегодняшний день практически не уделяется внимания проблеме взаимодействия гетерогенной по чувствительности к инфекции популяции человека со штаммами эпидемически значимых генотипов возбудителя. При этом в подавляющем большинстве работ, посвященных изучению генетической вариабельности населения по кандидатным генам устойчивости к ТБ, этиологический агент заболевания M. tuberculosis рассматривается как гомогенный фактор, действующий однонаправлено. Однако это далеко не так, например, воздействие МБТ генотипа "Пекин" на иммунную систему человека значимо отличается от воздействия микобактерий других генотипов, как на уровне фагоцитирующих макрофагов, так и по спектру цитокинов продуцируемых в результате инфекции (Wang et al., 2010b). Было обнаружено, что во Вьетнаме больные с сочетанием
Филогенетическая модель распространения генотипов МБТ в Иркутской области по результатам MIRU-VNTR генотипирования. Выявление эпидемических генотипов
В европейских странах, включая страны соцлагеря, несмотря на общие неблагоприятные послевоенные социально-экономические условия, отсутствовал резервуар штаммов генотип "Пекин", что позволило "спектру" генотипов туберкулеза в Западной Европе остаться на довоенном уровне, характеризующемся минимальным присутствием МБТ этого генетического семейства (Kinander et al., 2009; Groenheit et al., 2012). Следует помнить, что Российская Империя свыше трех веков являлась ключевым игроком в геополитических процессах Европы и присоединила в свой состав ряд приграничных территорий и государств. Так, после трехвекового (XVII-XIX вв.) противостояния на севере Европы со Швецией, к Российской Империи была присоединена Финляндия (Осмо, 2009). По всей видимости, циркулировавшие в то время на территории Российской империи МБТ имели спектр генотипов, схожий с европейским, который, с тех пор, претерпел гораздо меньшие изменения, чем российский.
Рассматривая процессы эпидемического распространения штаммов туберкулеза на территории России, нельзя не остановиться на модели, описывающей распространение высокотрансмиссивного субтипа B0/W148 генотипа "Пекин" (в глобальной базе данных SITVIT этот субтип имеет номер MIT17) с волнами миграции населения в СССР в 60-80-е годы ХХ века, после освоения целинных земель (Mokrousov, 2013). Важное свойство этого подсемейства генотипа "Пекин" заключается в широкой распространенности на территории России и некоторых стран бывшего СССР (Украина, Абхазия) и практически полном отсутствии на территории других исследованных европейских стран. Как указано в обзоре литературы, штаммы этого субтипа обладают наибольшей вирулентностью и трансмиссивностью среди всех известных генотипов возбудителя туберкулеза, поэтому исследование их происхождения является важным этапом построения модели распространения туберкулеза на территории России в последние десятилетия. Предлагаемая И.В. Мокроусовым модель имеет целью локализовать место происхождения данного высоковирулентного субтипа и предположить время и направление его распространения. Утверждается, что после распространения по территории СССР МБТ генотипа "Пекин" в 50х-60х годах, на территории России, а точнее в Новосибирской области возник наиболее высокотрасмиссивный и опасный субтип B0/W148/MIT17 генотипа "Пекин" M. tuberculosis. В рамках этой гипотезы, заражение значительной массы людей произошло во время освоения целинных земель, а в дальнейшем в 60-х - 80-х годах потоком переселенцев, возвращавшихся с целины и из Западной Сибири, данный генотип распространился по всей территории России. На рис.3.3 приведена интегрированная схема данной модели (Mokrousov, 2013).
Предложенная И.В. Мокроусовым модель современного распространения наиболее эпидемического субтипа МБТ согласуется с описываемым в настоящей работе сценарием общего распространения штаммов генотипа "Пекин" в ХХ столетии. Однако вызывает сомнение постулируемое автором место возникновения субтипа B0/W148/MIT17. Действительно, существует определенная неравномерность распределения этого субтипа по территории России в виде увеличения доли штаммов МБТ субтипа MIT17 от западных областей страны к восточным (Балабанова и др., 2006; Баранов и др., 2007; Нарвская и др., 2002; Kovalev et al., 2005; Lasunskaia et al., 2010; Mokrousov et
al., 2002; 2005; 2013; Toungoussova et al., 2002). Однако, по данным тех же авторов (Mokrousov et al., 2009b), вклад штаммов субтипа MIT17 генотипа "Пекин" в г. Калининграде достигает 30% от общего числа изолятов, что соответствует наибольшей распространенности этого субтипа не только на территории России, но и в мире. Тем не менее, в рамках опубликованной гипотезы автором эти данные не рассматриваются (Mokrousov et al., 2013). С другой стороны, вышеупомянутая модель весьма последовательно и логично обосновывает время первичного распространения генотипа по территории России – начало 60-х годов прошлого века, и с этим выводом, безусловно, следует согласиться. Рассматривая представленные аргументы относительно места возникновения высоковирулентного и трансмиссивного субтипа MIT17 МБТ и причины укоренения этих штаммов на территории России, можно предположить иной исторический и эпидемиологический сценарий событий.
Объяснение феномена распространения штаммов субтипа MIT17 генотипа "Пекин", как и в случае распространения МБТ других субтипов этого генетического семейства на территории России, следует основывать на исторических фактах. Безусловно, миграционные процессы в середине ХХ века в СССР должны были оказать влияние на распределение штаммов генотипа "Пекин" и других генотипов на территории СССР.
Рассмотрим фактические данные распределения МБТ субтипа MIT17: Архангельская область -16,8% (Toungoussova et al., 2002), Калининградская область - 30,0% (Mokrousov et al., 2009b), Западная Сибирь - 19,4% (Surikov et al., 2005; Dymova et al., 2011; Норкина и др., 2003; Сурикова и др., 2005), Тува – 21,9% (Матрашкин и др., 2004); Иркутская область -15,9% (настоящее исследование). По выше приведенным результатам нельзя сказать, что существует однозначная тенденция.
Распределение генотипов человека и генотипов M. tuberculosis у больных туберкулезом легких
Показано, что генотип ID+C- у мужчин, больных туберкулезом, встречается более чем в два раза чаще, чем у здоровых (OR=2,4; 2=9,7; 0,01), что позволяет рассматривать данный генотип как существенный фактор риска развития туберкулеза у мужчин. Примечательно, что среди мужчин, больных гипертонией, данное сочетание генов так же встречается значимо реже (см. табл. 5.10). У женщин, вопреки ожиданиям, единственная значимая разница приходится на генотип ID +AA между больными туберкулезом и гипертонией. Проведенное исследование не выявило однозначной роли какого-либо одного из исследованных генотипов в качестве протективного или, наоборот, фактора риска для туберкулезной инфекции. Более того, наблюдается выраженный плейотропный эффект сочетаний генотипов и аллелотипов. Тем не менее, явный "дефицит" DD генотипа среди больных туберкулезом при сравнении с когортой больных гипертонической болезнью может свидетельствовать о правильности исходных предпосылок о возможной роли ACE гена, как составляющей части "запасливого генотипа" и возможной толерантности этого гипотетического генотипа к туберкулезу. К сожалению, в доступных нам источниках литературы практически не встречаются популяционные исследования по сравнению распространения гипертнонической болезни и туберкулеза в одной и той же человеческой популяции. Вероятно, одной из основных причин отсутствия таких исследований может крыться в раздельном ведении (по крайней мере, в России) медицинского статистического учета по данным нозологическим формам.
Вызывает интерес тот факт, что наиболее существенная разница между контрольной группой здоровых индивидуумов и группой больных туберкулезом получена для комбинации генотипов ID + C- (гены ACE и AT2R), что явилось полной неожиданностью. Исходя из вышеизложенной гипотезы, было бы логично предполагать, что наиболее подвержеными туберкулезу должны были быть носители II генотипа по гену ACE и сочетанные с ним генотипы AT1R и AT2R, т.е. люди однозначно не склонные к гиперхолестеринемии, гипертонии и т.д. Обращает на себя внимание и отсутствие статистически значимых различий между генотипами у женщин, больных туберкулезом, и контрольной группы, что подтверждает большую роль метаболических особенностей, связанных с полом (женщины болеют туберкулезом в три раза реже чем мужчины).
В заключение следует отметить, что исследованные генотипы, особенно генотип DD гена ACE, вероятно, являются вполне оправданным кандидатами для включения в гипотетический "запасливый генотип". Однако, может ли "thrifty genotype" быть протективным при туберкулезной инфекции во многом остается открытым, особенно если учесть повышенную чувствительность к туберкулезу у больных сахарным диабетом. Вероятно, для дальнейшей проверки данной гипотезы целесообразно исследовать полиморфизм генов человека, отвечающих за липидный и углеводный обмен, а также транспортировку липидов, т.е. генов, определяющих спектр и уровень липидов в органах и тканях.
Первой линией обороны человеческого организма от патогенов являются механизмы неспецифического иммунитета, отвечающие за раннее распознавание и утилизацию микроорганизмов. В первую очередь к эффекторам этого звена иммунной системы относятся фагоциты - макрофаги и дендритные клетки. Фагоцитирующие клетки экспрессируют ряд клеточных рецепторов, известных как паттерн-распознающие (pattern recognition receptors). На одном из таких рецепторов – CD209 (ген DC-SIGN, или ген CD209) в последнее время сосредоточено внимание многих исследователей в связи с его важной ролью при туберкулезе (Tailleux et al., 2003) и ряде других инфекционных заболеваний (Neyrolles et al., 2006). Несмотря на то, что для жителей Южной Африки была обнаружена протективная роль от туберкулезной инфекции генотипов -871G и -336A, гена CD209 (Barreiro et al. 2006) аналогичное, исследование -336A/G полиморфизма у жителей Колумбии (Южная Америка) не выявило существенных различий между когортой больных туберкулезом и здоровым контролем (Gomez et al., 2006).
Помимо указанного выше, в настоящем исследовании были дополнительно выбраны еще два гена, полиморфизм которых у больных туберкулезом в ряде популяций людей значимо отличался от контрольной группы – гены MCP1 -2518A/G и INFy +874A/T. Для двух популяций – жителей Мексики и Кореи было показано выраженное различие в распределении генотипов между больными легочным туберкулезом и здоровым контролем в промоторе гена монцитарного хемоатрактивного белка 1 (MCP1 -2518A/G) (Flores-Villanueva et al., 2005), а для больных легочным туберкулезом из Хорватии было показано, что у пациентов-носителей аллеля +874A гена интерферона гамма значимо чаще встречается микробиологически подтвержденный туберкулез (Etokebe et al., 2004).
