Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 10
1.1. Бактериозы насекомых 10
1.1.1. Энтомопатогенная кристаллообразующая бактерия Bacillus thuringiensis 10
1.1.2. Токсины и другие метаболиты Bacillus thuringiensis 11
1.1.2.1 Кристаллический 8-эндотоксин 11
1.1.2.2 Термостабильный р-экзотоксин 15
1.1.2.3 а-экзотоксин 16
1.1.2.4 Ферменты 17
1.1.2.5 Антибактериальные вещества Bacillus thuringiensis 19
1.1.3. Этапы бактериоза насекомых 20
1.2. Вторичные метаболиты растений 25
1.2.1. Роль вторичных метаболитов растений в системе "насекомое-растение хозяин" 26
1.2.2. Основные группы вторичных метаболитов 30
1.2.3. Фенол ьные соединения 31
1.3. Антиоксидантная система насекомых 35
1.3.1. Характеристика основных форм активированных кислородных метаболитов 36
1.3.2. Перекисное окисление липидов 37
1.3.3. Антиоксидантные ферменты 41
1.3.4. Неспецифические эстеразы 45
1.3.5. Неферментативные антиоксиданты 47
1.4. Изменение активности антиоксидантной системы у насекомых при патогенезе и воздействии ксенобиотиков 50
1.4.1. Роль активированных кислородных метаболитов и антиоксидантов при патогенезах насекомых 50
1.4.2. Изменения в антиоксидантной системе насекомых при воздействии вторичных метаболитов растений 52
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 57
2.1. Насекомые 57
2.2. Бактерии 57
2.3. Экстракты растений 57
2.4. Реактивы 59
2.5. Заражение насекомых бактериями 59
2.6. Скармливание экстрактов растений насекомым 59
2.7. Приготовление гомогенатов внутренних органов 60
2.8. Определение активности супероксиддисмутазы 60
2.9. Определение активности каталазы 60
2.10. Определение активности глутатион-Б-трансферазы 61
2.11. Определение концентрации тиолсодержащих соединений 61
2.12. Определение активности неспецифических эстераз 62
2.13. Определение концентрации малонового диальдегида 62
2.14. Определение антиоксидантных свойств вторичных метаболитов растений 63
2.15. Определение концентрации белка 63
2.16. Статистическая обработка экспериментальных данных 64
ГЛАВА 3. Активность антиоксидантной системы личинок G.mellonella при бактериозе 65
3.1. Бактериоз личинок большой пчелиной огневки G.mellonella, вызываемый Bacillus thuringiensis 65
3.2. Изменение концентрации малонового диальдегида при бактериозе личинок G.mellonella 67
3.3. Влияние бактериоза на активность антиоксидантов в кишечнике личинок G.mellonella 69
3.3.1. Активность супероксиддисмутазы и каталазы 69
3.3.2, Активность глутатион-Б-трансферазы 73
3.3.3. Концентрация окисленных и восстановленных тиолов 74
ГЛАВА 4. Активность антиоксидантной системы личинок G.mellonella при антагонистическом воздействии вторичных метаболитов растений ... 79
4.1. Влияние экстрактов растений на структурные показатели популяции G.mellonella 79
4.2. Изменение концентрации малонового диальдегида при воздействии вторичных метаболитов растений 86
4.3. Изменение соотношения окисленных и восстановленных тиолов при воздействии вторичных метаболитов растений 90
4.4. Изменение активности ферментативных антиоксидантов и неспецифических эстераз при воздействии вторичных метаболитов растений 93
4.4.1. Активность глутатион-5-трансферазы 93
4.4.2. Активность неспецифических эстераз 95
4.4.3. Активность супероксиддисмутазы и каталазы 97
4.5. Влияние экстрактов растений на развитие бактериальной инфекции Bacillus thuringiensis у личинок G.mellonella 99
Заключение 103
Выводы 107
Список литературы 108
- Вторичные метаболиты растений
- Скармливание экстрактов растений насекомым
- Определение активности глутатион-Б-трансферазы
- Изменение концентрации малонового диальдегида при бактериозе личинок G.mellonella
Введение к работе
В окружающей среде существует большое количество бактерий способных поражать насекомых. При развитии бактериальной инфекции происходит взаимодействие метаболитов бактерий и защитных систем насекомых. При этом особое значение играет состав кормового субстрата, компоненты которого могут оказывать влияние как на организм насекомого, в частности на функционирование защитных механизмов, так и на активность метаболитов энтомопатогенных бактерий.
Бактерии Bacillus thuringiensis (БТ) хорошо известны благодаря их патогенности к насекомым различных отрядов [Simpson et al., 1997; Rausell et al., 2000; Zhong et al., 2000]. Патогенное действие БТ на насекомых связано с токсинами и другими метаболитами, которые синтезируют данные бактерии [Бурцева и др., 2001]. В настоящее время общепризнано, что основным фактором инсектицидного действия БТ является кристаллический белковый эндотоксин, образующийся в клетках в виде параспоровых включений или кристаллов [Obukowitz et al., 1986; Lampel et al., 1994].
Важнейшую роль в формировании взаимоотношений растений с насекомыми играют вещества вторичного обмена — вторичные метаболиты растений (ВМ) или аллелохемики [Шапиро и др., 1986; Чернышов, 1996]. Особый интерес представляет антагонистическое действие ВМ растений на организм насекомого. Среди сотен тысяч известных ВМ растений, несомненно, наиболее распространенным классом веществ, играющим ведущую роль в защите против фитофагов, являются фенольные соединения, обладающие разнообразным действием на насекомых [Geibel et al. 1994, Feucht, Treutter 1999; Gatehouse, 2002], однако исследования, посвященные действию этих веществ на физиологическое состояние насекомых пока не многочисленны [Martin et al., 1987; Harborne, 1991; Appel, 1992].
Следует отметить, что действие 8-эндотоксина и других метаболитов БТ на эпителиальные клетки кишечника сопряжено с нарушением целостности и функциональной активности клеточных мембран, что может приводить к неконтролируемому усилению радикальных окислительных процессов за счет развития реакции перекисного окисления липидов (ПОЛ) и нарушения окислительного фосфорилирования [Travers et al., 1976; Harvey et al., 1983; Boctor, Salama,1983; Knowles, Ellar, 1987; Штерншис, 1995]. Вторичные метаболиты растений могут оказывать токсическое воздействие на насекомых, связываясь с эпителиальными клетками кишечника, а также за счет проявления прооксидантных свойств. В частности, окисление фенолов до хинонов может инициировать образование активированных кислородных метаболитов в кишечнике [Appel, Martin, 1990; Summers, Felton, 1994; Appel, 1994, Зенков и др., 2001]. Не исключено, что описанные нарушения при действии ВМ растений на насекомых могут влиять на развитие бактериальной инфекции БТ, так как эти процессы сопряжены с нарушением целостности и функциональной активности пищеварительной системы.
Известно, что контроль над активностью радикальных окислительных процессов в организме насекомых осуществляет антиоксидантная система [Felton, Summers, 1995]. Участие компонентов антиоксидантной системы в стабилизации радикальных окислительных процессов на начальном этапе развития бактериоза и/или при воздействии ВМ растений может являться одним из важнейших механизмов, защищающих насекомых от повреждающего действия радикалов. Существуют единичные работы по изучению влияния инфекций, вызванных энтомопатогенными грибами, вирусами и микроспоридиями на процессы генерации АКМ и активность антиоксидантной системы в организме насекомых [Серебров, 2000; Wang et al., 2001а; Лозинская и др., 2003]. В большинстве работ, посвященных изучению влияния ВМ растений и других ксенобиотиков на организм
насекомых рассматривается изменение активности и спектра эстераз [Cohen et al, 1992; Snyder, Feyereisen, 1992; Cuevas, Niemeyer, 1993; Xu, Bull, 1995; Conyers et al., 1998; Mukanganyama et al., 2003]. Немногочисленные исследования антиоксидантной системы насекомых проводили при питании кормом с повышенным содержанием фенолов [Jonson, Felton, 2001; Barbehenn et al., 2001; Barbehenn, 2002; Barbehenn et al., 2003], а так же при развитии на менее предпочитаемом кормовом растении [Peric-Mataruga et al., 1997]. К сожалению, работы по изучению антиоксидантной системы насекомых при бактериозе встречаются редко, а воздействие растительных аллелохемиков на активность антиоксидантов практически не изучено.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось изучение влияния бактериоза и вторичных метаболитов растений на антиоксидантную систему кишечника личинок большой вощиной огневки Galleria mellonella L. Для успешного выполнения указанной цели необходимо было решить следующие задачи:
1. Изучить влияние бактериальной инфекции В. thuringiensis на
активность процессов ПОЛ в кишечнике личинок G .mellonella;
Исследовать влияние бактериальной инфекции В. thuringiensis на активность ферментативных и неферментативных антиоксидантов в кишечнике личинок G. mellonella;
Изучить влияние экстрактов растений, подавляющих развитие личинок G. mellonella, на активность процессов ПОЛ в кишечнике;
Исследовать влияние экстрактов растений, подавляющих развитие личинок G. mellonella, на активность ферментативных и неферментативных антиоксидантов.
»
Научная новизна. Впервые изучено изменение активности
антиоксидантов - супероксиддисмутазы, катал азы, глутатион-Э-транферазы и
концентрации тиол-содержащих веществ при развитии бактериальной
инфекции В. thuringiensis. Впервые установлено, что скармливание
экстрактов растений, подавляющих развитие личинок G. mellonella,
приводит к снижению активности процессов ПОЛ на фоне повышения
окисления тиол-содержащих веществ. Установлено, что развитие бактериоза,
а так же воздействие экстрактов ряда растений подавляющих развитие
насекомых сопровождается изменением баланса "оксиданты-антиоксиданты"
'+1 в кишечнике личинок G. mellonella, при этом ферментативные и
неферментативные компоненты антиоксидантной системы могут выступать одним из защитных механизмов предотвращающих разрушающее действие высокореакционных радикалов.
Практическая значимость. Результаты, полученные в ходе
исследований, позволяют оценить активность радикальных окислительных
процессов и защитную роль антиоксидантной системы насекомых при
бактериозе и воздействии аллелохемиков растений. Данные результаты могут
служить основой для поиска веществ, в частности ВМ растений,
нарушающих баланс "оксиданты-антиоксиданты" у насекомых, что можно
41 использовать для совершенствования биопрепаратов на основе БТ,
применяемых для регуляции численности фитофагов.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на Всероссийской конференции "Беспозвоночные животные Южного Зауралья и сопредельных территории" (Курган, март 1998), на конференции "Паразиты в природных комплексах и рисковые ситуации" (Новосибирск, июнь 1998), на VI Европейском энтомологическом конгрессе (Чехия, август 1998), на
*
Международном симпозиуме "Сохранение и защита горных лесов" (Ош, октябрь 1999), на XII съезде Русского Энтомологического общества (Санкт-Петербург, август 2002), на VII Европейском энтомологическом конгрессе (Греция, октябрь 2002), на отчетных сессиях ИСиЭЖ СО РАН (апрель 2002), на заседаниях микробиологического общества (ноябрь 2004).
По материалам диссертации опубликовано 16 работ.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 139 страницах машинописного текста; состоит из введения, 4 глав, заключения, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 33 рисунками и 2 таблицами. Список литературы включает 300 работ, из них 254 на иностранных языках.
Благодарности. Автор выражает глубокую благодарность д.б.н. В.В. Глупову за руководство научной работой, к.б.н. Л.И. Бурцевой за представленные штаммы Bacillus thuringiensis, к.х.н. М.П, Половинке (ИОХ СО РАН, Новосибирск) за предоставление экстрактов растений и последующую их очистку и разделение, О.А. Олиференко, Е.А. Боярищевой, Е.В. ГризановоЙ (ИСиЭЖ СО РАН) за помощь в проведении исследований, к.х.н. И.А. Слепневой, Д.Н. Комарову (ИХКиГ СО РАН, Новосибирск) за помощь в выполнении работ, связанных с ЭПР-спектроскопией, к.б.н. Я. Л. Воронцовой, к.б.н. С. А. Бахвал ову, В.В. Марте мьянову (ИСиЭЖ СО РАН) за обсуждение рукописи и ценные критические замечания.
Вторичные метаболиты растений
Длительные и тесные связи объединяют две прогрессивно развивающиеся линии широко распространенных организмов - растений и насекомых. Насекомые сыграли важную роль в эволюции растений, у которых под воздействием фитофагов и различных патогенов формировались черты, обеспечивающие защиту их структурной и функциональной целостности. Защита растений против фитофагов проявляется в у антагонистическом воздействии кормового растения на насекомое [Шапиро и др., 1986]. В качестве причин антибиоза могут выступать: структурные особенности основных биополимеров, синтезируемых растениями, и степень их доступности для усвоения; пищевая ценность растения; анатомо-морфологические особенности растения, затрудняющие доступ фитофага к оптимальным местам питания; ростовые процессы растений, нарушающие условия нормального развития фитофага. Кроме того, важнейшую роль в формировании антибиотических взаимоотношений растений с насекомыми играют вещества вторичного обмена - вторичные метаболиты растений (ВМ) или аллелохемики [Шапиро и др., 1986; Чернышов, 1996]. Как известно, ВМ являются биологически активными соединениями, которые содержаться в каждом растении и с которыми сталкивается любой консумент. Многообразие взаимоотношений растений и насекомых включает в себя как антагонистическое действие ВМ на организм насекомого, так и адаптацию насекомых — фитофагов к аллелохемикам кормовых растений. Примеры адаптации насекомых к ВМ растений можно разделить на несколько категорий, которые характеризуются определенными поведенческими, физиологическими и биохимическими реакциями. Известны факты поведенческой адаптации, когда насекомое при питании избегает участки локализации ВМ. Например, гусеницы непарного шелкопряда избегают питаться распускающимися листьями березы, расположенными у основания растущих ауксибластов, из-за повышенного содержания эфирных масел в интенсивно растущих тканях этих листьев [Баранчиков, 1983]. Личинки младших возрастов хвойных шелкопрядов рода Dendrolimus Germ., начиная питаться на сосне и кедре, скусывают ребра хвоинок до глубины смоляного канала не повреждая его [Баранчиков, 1982].
Питаясь на листьях табака, тля Myzus persicae вводит хоботок только во флоэму, где полностью отсутствует характерный аллелохемик этого растения - никотин [Guthrie et al., 1962]. Кроме того, известны примеры физиологической изоляции, при которой поглощенные с кормом ВМ почти в неизменном виде накапливаются в организме насекомых: в гемолимфе, как у некоторых медведиц [Nishio, 1980], во внутрикишечной жидкости, как у волнянок [Blum et al.,1981], в специальных железах и выростах глотки, как у некоторых кузнечиковых и пилильщиков [Euw et al., 1967; Eisner et al., 1974]. Подавляющее большинство фитотрофных насекомых, в частности, почти все виды дендрофильных чешуекрылах, в той или иной степени трансформируют потребленные с пищей ВМ растений и либо утилизируют их, либо выводят с экскрементами. Например, при питании хвоей ели личинки пилильщика Gilpinia hercynia Htg. утилизируют шикимовую и хинную органические кислоты на 97 и 80%, а галлокатехин и гликозид пицеин - на 64 и 74% соответственно [Schopf et al., 1982], Также известно о значительном изменении количественного и качественного состава ВМ листвы эвкалиптов при прохождении ее через кишечник листогрызущих пилильщиков [Morrow, Fox, 1980]. Также следует отметить, что ряд летучих ВМ растений используются насекомыми как пищевые аттрактанты [Bolter et al., 1997; Pichersky, Gershenzon, 2002; Harborne, 1988; Modde, 1984].
Рассматривая антагонистическое действие ВМ растений на организм насекомого, следует отметить, что ВМ могут оказывать на фитофагов прямое токсическое действие с летальным исходом или вызывать у них различную степень расстройства пищеварительной, нервной, половой, кровеносной и других физиологических систем [Шапиро и др., 1986]. Например, колхицин, выделенный из безвременника осеннего Colchicum automonale, известен как вещество обладающее резко выраженными мутагенными свойствами [Salehzadeh et al., 2003]. Дегидрокверцин и кверцетин, содержащиеся в водных экстрактах молочая Ricinus communis, оказывают ярко выраженное инсектицидное действие на жуков Callosobruchus chinensis [Upasani et al., 2003]. Никотин, анабазин и пиретрин широко известны как высокоэффективные инсектициды [Шапиро и др., 1986]. Значение веществ вторичного обмена в защите растений от фитофагов может усиливаться после разрушения растительной клетки. При
Скармливание экстрактов растений насекомым
Пероральное заражение G.tnellonella проводили при содержании личинок на питательной среде, в состав которой была добавлена спорокристаллнческая суспензия Bacillus thuringiensis ssp.galleriae (БТ) (1 мл суспензии, содержащей 1х108 бактерий, смешивали с 3 г среды) Насекомых содержали в чашках Петри по 20 личинок при 28С, в темноте на искусственной питательной среде. Для изучения влияния экстрактов растений на вес и смертность насекомых использовали 0,1% концентрации веществ на 1г корма. Бес и смертность фиксировали в течении 9-11 дней с интервалом 2-3 дня. Для приготовления гомогенатов кишечника насекомых препарировали в 10 мМ фосфатном буфере рН 7.2 с 150 мМ NaCl (ФБ). Извлеченные органы растирали в стеклянном гомогенизаторе с холодным ФБ в соотношении 0,1 г на 1 мл буфера. Затем гомогенаты центрифугировали при 4С в течение 15 мин при 10000 g. Полученный супернатант использовали для определения активности ферментов, концентрации тиолов и МДА. Активность супероксиддисмутазы определяли спектрофотометрически при 560 нм по подавлению скорости восстановления нитросинего тетразолия супероксид-анионом, образующимся в процессе окисления ксантина ксантиноксидазой [McCord, Fridovich, 1969]. К 500 мкл реакционной смеси (5 мг/мл БСА, 70 мкМ НСТ, 125 мкМ ксантина в ФБ), добавляли образец 80 мкл гомогенатов кишечника, после чего реакцию инициировали добавлением 20 мкл раствора ксантиноксидазы (КО) (100 мкл КО (5.87 ед. акт./мл) в 2мл ФБ) и инкубировали при 28С в темноте в течение 20 мин. Удельную активность фермента выражали в единицах изменения оптической плотности инкубационной смеси при 560 нм в ходе реакции в расчете на 1 мин и 1 мг белка Активность каталазы определяли спектрофотометрически при 240 нм по скорости разложения Н202 [Wang et al., 2001]. К 500 мкл реакционной смеси (150 мкл 3 % Н20з в 450 мкл ФБ) добавляли образец - 5 мкл гомогената кишечника и инкубировали 10 мин при 28С. Удельную активность фермента выражали в единицах изменения оптической плотности инкубационной смеси при 240 нм в ходе реакции в расчете на 1 мин и 1 мг белка.
Активность глутатион-8-трансферазы определяли спектрофотометрически при 340 нм по скорости увеличения концентрации 5-(2,4-динитрофенил)-глутатиона, продукта реакции ДНБ и востановленного глутатиона, катализируемой ГТ [Habig et al., 1974]. Инкубацию проводили при 28С в течение 5 мин в 500 мкл ФБ, содержащем 1мМ глутатиона, 1мМ ДНБ и образец 20 мкл гомогената кишечника. Удельную активность фермента выражали в единицах изменения оптической плотности инкубационной смеси при 340 нм в ходе реакции в расчете на 1 мин и 1 мг белка. Для определения концентрации восстановленных (RSH) и окисленных (RSSR) тиолов использовали спектрофотометрический метод, основанный на окислении RSH 2-нитро 5-тиобензойной кислотой [Khramtsovet al., 1997; Khramtsov et al., 1989]. RSSR предварительно разрушали до RSH IN соляной кислотой (HC1) следующим образом: к 50 мкл гомогенатов кишечника добавляли 10 мкл IN НСІ и инкубировали в течении 20 мин при 37С, после чего рН образца доводили до 7 водным раствором NaOH (10%). Концентрацию RSH и RSH+RSSR измеряли при 412 нм после 10 мин инкубации 50 мкл образца в 500 мкл 0,1% раствора ДНТБ в ФБ при 37С.
Концентрацию RSH и RSSR определяли согласно калибровочной кривой. Для построения калибровочной кривой использовали восстановленный глутатион. Спектрофотометрическое определение активности эстераз в гомогенатах кишечника проводили по К. Асперену [Asperen, 1962] с незначительными изменениями. Инкубационная смесь содержала 1 мл 0.54 мМ 1-нафтилацетата в ФБ и образец 10 мкл гомогената кишечника или 5 мкл образца лимфы. После инкубации в темноте в течение 30 мин при 28С реакцию останавливали путем добавления 0.25 мл красяще-фиксирующего раствора (0.25% прочного синего РР и 3.125% додецилсульфата натрия в ФБ). Оптическую плотность измеряли при длине волны 600 нм. Удельную активность фермента выражали в единицах изменения оптической плотности инкубационной смеси при 600 нм в ходе реакции в расчете на 1 мин и 1 мг белка. Концентрацию малонового диальдегида в гомогенатах кишечника определяли с помощью колориметрического метода определения МДА в реакции с 2-тиобарбитуровой кислотой (ТБК), или МДА-метода предложенного в 1944 году Коном и Ливерсейджем [Карган и др., 1986]. В данной реакции образуется окрашенный хромофор (максимум поглощения 532 нм), определяемый спектрофотометрически. Для определения концентрации МДА к 250 мкл образца (гомогенат кишечника) добавляли 125 мкл 20 % трихлоруксусной кислоты (ТХУ) и центрифугировали при 10.000g 10 минут. К 300 мкл полученного супернатанта добавляли 200 мкл 0,8 % ТБК, и выдерживали на водяной бане 60 минут. Концентрацию мапонового
Определение активности глутатион-Б-трансферазы
Антиоксидантную активность усниновой кислоты оценивали по способности взаимодействовать с Ог". В качестве источника супероксид-радикала использовали насыщенный раствор К02 в DMSO ( 0,2 мМ). Количество 02 определяли с помощью спиновой ловушки СР-Н [Slepneva et al., 1999], которая неспецифично окисляется различными АКМ (супероксид-радикалом, гидроксильным радикалом, пероксинитритом и другими высокореакционными метаболитами) с образованием стабильного нитроксильного радикала, СР. Количество образовавшегося СР в образцах определяли методом ЭПР, тестируя интенсивность низкопольной компоненты спектра. Концентрацию радикала определяли, используя зависимость амплитуды спектра ЭПР от концентрации СР. Образцы готовили в ФБ (рН 7,4), содержащим 50 мкМ DTPA. Рабочий раствор усниновой кислоты (2 мМ) готовили в DMSO. В 200 мкл образца, содержащего 1 мМ СР-Н и различные концентрации усниновой кислоты (0 — 0,4мМ), добавляли 5 мкл раствора КОг в DMSO. Для ЭПР измерений образцы помещали в стеклянные капилляры объемом 100 мкл с внутренним диаметром 1 мм. ЭПР измерения проводили при комнатной температуре, используя спектрометр ER 200D-SRC Х-диапазона (Bruker, Германия) при следующих условиях: поле, 3474 Гс; развертка, 50 Гс; СВЧ-мощность, 20 мВт; частота модуляции магнитного поля, ] 00 кГц; амплитуда модуляции, 1 Гс. Концентрацию белка в гомогенатах кишечника определяли по методу Бредфорда [Bradford, 1986]. Для построения калибровочной кривой использовали БСА. Полученные данные обрабатывали статистически, рассчитывая среднее арифметическое и его ошибку. Для проверки нормальности распределения данных использовали W критерий Шапиро-Уилка. Статистическую значимость различий определяли по t-критерию Стъюдента [Доспехов, 1985].
Бактерии Bacillus thuringiensis (БТ) хорошо известны благодаря их патогенности по отношению к насекомым различных отрядов [Rausell et al.s 2000; Simpson et al., 1997; Zhong et a]., 2000]. В наших исследованиях мы использовали бактерии Bacillus thuringiensis ssp.galleriae штамм 69-6, обладающий высокой вирулентностью по отношению к насекомым отряда Lepidoptera, в первую очередь к огневкам (Pyrallidae) [Бурцева Л.И. и др., 1973]. При питании личинок G.mellonella 5-6 возрастов на корме, содержащем споро-кристаллическую смесь Bacillus thuringiensis ssp.galleriae штамм 69-6, обнаружено значительное отставание в весе зараженных насекомых по сравнению с контрольными - в 1,2-1,5 раза в течение всего опыта (Рис. 5). Личинки были малоподвижны. В течение трехдневного эксперимента максимальная гибель отмечалась на первые сутки и составляла 30±2,1%, в последующие дни гибель снижалась до 15±2,5% и 0,6±0,6%, соответственно. В Полученные результаты свидетельствуют о том, что бактерии БТ штамма 69-6 обладают ярко выраженной энтомопатогенной активностью. Наиболее острым периодом развития бактериальной инфекции являются первые сутки. Вероятно, столь быстрый эффект, а также высокая смертность, связаны с деятельностью кристаллического белкового эндотоксина, который образуется в клетках в виде параспоровых включений или кристаллов и является основным фактором инсектицидного действия БТ [Obukowitz et al., 1986; LampeletaL, 1994].
Отмеченная гибель и снижение веса личинок G.mellonella при заражении БТ могут быть сопряжены с нарушением целостности и функциональной активности клеточных мембран эпителия кишечника, поскольку известно, что при заражении насекомых бактериями БТ мишенью для поражения вторичными метаболитами являются клетки кишечника [Бурцева и др., 2001]. Эндотоксин, который образуется после активации протеазами, воздействует на клетки эпителия средней кишки зараженных личинок, при этом происходят патологические изменения клеточных органелл, в том числе нарушение проницаемости мембраны клеток, что, в конечном счете, приводит к осмотическому лизису клеток [Rausell et al., 2000; Gill et al., 1992]. Следует отметить, что важную роль в структурной организация мембран играет ПОЛ, поэтому всякого рода повреждения клеточной мембраны неизбежно сопровождаются активацией ПОЛ [Зенков и ДР-, 2001]. Согласно полученным нами данным, в первые сутки после скармливания БТ личинкам G.mellonella отмечено достоверное (р 0,01)
Изменение концентрации малонового диальдегида при бактериозе личинок G.mellonella
Вероятно, увеличение концентрации МДА является следствием усиления процессов ПОЛ. Аналогичные результаты были получены при заражении личинок Galleria mellonella, капустной белянки Pieris brassicae и хлопковой совки Spodoptera littoralis бактериями БТ [Штерн ши с, 1995; Boctor, Salama,1983]. В частности, было обнаружено уменьшение общего числа липидов и количества мононенасыщенных жирных кислот при увеличении количества полиненасыщенных жирных кислот, а также увеличение концентрации МДА и диеновых коньюгатов, что свидетельствовало об изменении состава мембран, характерного для перекисного окисления липидов и накоплении конечных продуктов ПОЛ. Возможно, действие активированного 5-эндотоксина на клетки эпителия кишечника при развитии бактериоза может приводить к усилению реакции ПОЛ, которая является источником АКМ. Неконтролируемое усиление радикальных окислительных процессов может вызвать разобщение процессов окислительного фосфорилирования, нарушение ионного транспорта, образование литических пор в плазматической мембране и как следствие гибель клеток [Travers et al„ 1976; Harvey et al., 1983; Knowles, Ellar, 1987]. На вторые сутки развития бактериоза концентрация МДА достоверно (р 0,01) снижалась в 2 раза по сравнению с контрольными значениями, с последующей нормализацией до контрольного уровня на третьи сутки (Рис. 6). Не исключено, что данные изменения возможны за счет действия антиоксидантной системы, которая может играть значительную роль в поддержании окислительно-восстановительного гомеостаза в кишечнике при развитии бактериоза на фоне усиления реакции ПОЛ и индукции АКМ. Для подтверждения этого предположения было изучено изменение активности ферментативных антиоксидантов (СОД, Кат, ГТ), а также неферментативных (тиолы) во время бактериоза. В результате проведенных экспериментов было обнаружено, что при инфицировании личинок G. mellonella высокопатогенным штаммом БТ 69-6 происходит достоверное (р 0,05; р 0,01) увеличение активности СОД в течение всего опыта (Рис. 7). Установлено, что на первые сутки после контролем)
Активность этого специализированного антиоксиданта зависит от концентрации в среде супероксидного анион-радикала, продукция которого может увеличиваться при нарушениях в цепи транспорта электронов митохондрий и микросом, сопутствующих развитию деструктивных процессов в клетках кишечника [Зенков и др., 2001]. СОД катализирует реакцию дисмутации супероксидного анион-радикала (О ) в перекись водорода (Н2О2) [Felton, Summers, 1995]. В наших опытах, активность каталазы, разлагающей Н202, существенно снижалась (в 3,3-9 раз) на 1, 2 и 3 сутки после заражения (Рис. 8). В немногочисленных исследованиях антиоксидантной системы при патогенезах насекомых супероксиддисмутазы рассматриваются как один из основных компонентов ферментативных антиоксидантов [Wang et al., 2001а; Лозинская и др., 2003]. Отмеченное нами увеличение активности СОД может свидетельствовать о накоплении О2", который является индуктором большинства радикальных окислительных процессов. СОД и каталаза преимущественно работают в комплексе, специализируясь на поэтапном восстановлении кислорода [Munday, Winterboume, 1989; Sies, 1991], поэтому мы предположили, что увеличение активности СОД приведет к наработке большего количества Нг02, а, следовательно, и к повышению активности каталазы, специализирующейся на инактивации этого вещества.
Однако, в наших экспериментах активность каталазы оказалась достоверно (р 0,01) ниже контрольной в течении всего опыта (Рис.8). Сходные результаты были получены при изучении активности СОД и каталазы у личинок Lymantria dispar, питающихся на неблагоприятном для них растении [Peric-Mataruga et aL, 1997]. Авторы зафиксировали на фоне 1,5-2 кратного увеличения активности СОД снижение активности каталазы. Следует отметить, что в некоторых работах [Kono, Fridovich, 1982; Pritsos et al., 1988] зарегистрировано ингибирование каталазы супероксид анионом, который может накапливаться при нарушениях в процессах метаболической регуляции вследствие развития деструктивных процессов в кишечнике. Кроме того, в многочисленных исследованиях антиоксидантной системы животных обнаружено снижение активности этих ферментативных антиоксидантов при
