Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. ЭКОЛОГИЧЕСКАЯ РЕГУЛЯЦИЯ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ И БИОХИМИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ В ЛЕКАРСТВЕННЫХ РАСТЕНИЯХ НА ПРИМЕРЕ РОДА ЭХИНАЦЕЯ -ECHINACEA MOENCH.
1.1. Экологическая регуляция физиологических и биохимических процессов в растениях
1.2. Адаптивная стратегия растений и вещества вторичного метаболизма
1.3. Влияние эколого-физиологических факторов на накопление вторичных метаболитов.
1.3.1.Влияние климатических факторов на накопление фенольных соединений
1.3.2. Влияние эдафических факторов на накопление вторичных метаболитов
1.4. История изучения эхинацеи
1.5. Ботаническая характеристика рода Echinacea
1.6. Химический состав Е. purpurea (L.)
1.6.1. Алкиламиды, их распространение и биологическая активность
1.6.1.1. Распространение алкиламидов
1.6.1.2. Биологическая активность алкиламидов
1.7. Фармакологическое действие эхинацеи пурпурной
1.8. Использование Echinacea purpurea в сельском хозяйстве
ГЛАВА 2. УСЛОВИЯ ВЫРАЩИВАНИЯ, ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Климатические условия региона
2.2. Почвы 43
2.3. Объекты исследования
2.4. Условия закладки посевов 44
2.5. Отбор растительного материала 45
2.6. Анализ растительного материала 45
2.6.1. Морфофизиологические показатели 47
2.6.2. Фитохимический анализ 47
2.6.2.1. Товароведческие показатели 47
2.6.2.2. Биохимический состав и зольные элементы растений и почвы 47
2.6.2.3. Определение алкиламидов
48 2.6.2.4. Определение суммы флавоноидов ноидов
2.7. Изучение фармакологической активности Е. purpurea
2.8. Статистическая обработка результатов
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Влияние климатических и почвенно-экологических факторов на продуктивность Е. purpurea
3.2. Адаптивная стратегия Е. purpurea
3.3. Влияние климатических и почвенно-экологических факторов на накопление вторичных метаболитов растениями Е.
3.3.1. Алкиламиды
3.3.2. Флавоноиды
3.3.3. Анализ различий биохимических показателей растений Е.
4. Фармакологическая активность Е. purpurea, выращенной в Башкортостане 75
3.4.1. Экстракция биологически активных веществ 75
3.4.2. Клинические испытания иммуностимулирующего и протвовоспалительного средства
Заключение 80
Выводы 83
Литература 85
Приложение 107
- Экологическая регуляция физиологических и биохимических процессов в растениях
- Условия закладки посевов
- Влияние климатических и почвенно-экологических факторов на продуктивность Е. purpurea
Введение к работе
Актуальность темы.
Интродукция лекарственных растений в новые экологические условия ведет, как правило, к разнонаправленным изменениям накопления вторичных метаболитов и, в том числе, биологически активных лекарственных веществ. Североамериканский вид Echinacea purpurea (L.) Moench семейства Asteraceae популярен на родине как эффективный иммуностимулятор. Многие авторы связывают фармакологическое действие эхинацеи с наличием полисахаридов, фенолкарбонових кислот и ненасыщенных алкиламидов (Середа и др., 1998; Molina-Torres, 1999; Awang, 1999; Percival, 2000). Все три класса соединений используют для стандартизации препаратов из эхинацеи (Bauer, 1999). Закономерности эколого-климатической регуляции накопления вторичных метаболитов, в том числе и алкиламидов в условиях Южного Урала ранее не изучались. Цель работы.
Целью работы было изучение особенностей жизнедеятельности растений Е. purpurea на Южном Урале. Для осуществления этой цели необходимо было решить следующие задачи:
1. Изучить особенности формирования продуктивности морфофи-
зиологических параметров, накопления вторичных метаболитов, в том
числе алкиламидов в различных почвенно-климатических условиях.
2. Провести изучение взаимосвязи содержания флавоноидов и
алкиламидов с морфологическими параметрами Е. purpurea
3. Оценить биологическую активность сырья Е. purpurea, выращенной
на Южном Урале.
Научная новизна.
Впервые в условиях степной зоны Южного Урала проведено комплексное изучение Е. purpurea. Изучено влияние климатических условий, состояние почвы на накопление биомассы, морфофизиологические
показатели Е. purpurea. Изучено накопление алкиламидов растениями Е. purpurea, выращенных на Южном Урале. Предложено и изучено иммуностимулирующее и противовоспалительное средство на основе травы эхинацеи пурпурной.
Теоретическое значение работы. Результаты исследований могут быть использованы для понимания характера влияния почвенно-экологических факторов на рост и развитие Е. purpurea в условиях Южного Урала.
Практическое значение работы.
Материалы диссертации, сформулированные в ней положения и выводы, могут стать основой для разработки технологии выращивания Е. purpurea в условиях Республики Башкортостан, как промышленного источника получения лекарственных препаратов иммуностимулирующего и противовоспалительного действия.
Связь темы диссертации с плановыми исследованиями. Работа является частью комплексных исследований кафедры физиологии растений Башкирского государственного университета по изучению накопления вторичных метаболитов лекарственными растениями в разных почвенно-климатических условиях.
Реализация результатов исследования. Результаты исследования и практические рекомендации по выращиванию Е. purpurea в Республике Башкортостан легли в основу двух методических пособий: «Методические рекомендации по постановке интродукционных экспериментов с Echinacea purpurea в Республике Башкортостан», «Методические рекомендации по опытнической работе с лекарственными растениями на пришкольных участках в условиях Башкирского Зауралья» и брошюры «Эхинацея пурпурная (биология, фармакология и вопросы интродукции в Республике Башкортостан)». На препарат на основе Е. purpurea получен патент РФ №
2180586 от 20 марта 2002 г. «Иммуностимулирующее и противовоспалительное средство и способ его получения».
Апробация работы.
Результаты работы по теме диссертации докладывались на юбилейной научной конференции, посвященной 5-летию ассоциации молодых ученых Башкирского государственного медицинского университета (Уфа, 1999г.), VII молодежной конференции ботаников в Санкт-Петербурге (С.-Пб., 2000), 12 th Congress of the Federation of European of Plant Physiology (Budapest, 2000), республиканской межведомственной научно-практической конференции «Природные факторы здоровья, профилактики и лечения болезней» (Уфа, 2001 г.).
Декларация личного участия автора.
Автор лично провел в 2000-2003г.г. посев и сбор растительного материала. Все работы, связанные с обработкой растительного материала, интерпретацией фактических данных и написанием текста диссертации осуществлялись автором по плану, согласованному с научным руководителем. Автором написан итоговый текст диссертации. В диссертации использованы работы, опубликованные в соавторстве. Доля личного участия автора в написании и подготовке этих публикаций пропорциональна числу участников.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту.
1. Растения Е. purpurea успешно перенесли интродукцию в условия
Южного Урала.
2. Растения Е. purpurea, выращенные в разных почвенно-
климатических районах отличаются по накоплению биомассы и
морфофизиологическим параметрам.
3. Разные почвенно-климатические условия вызывают изменение
вторичного метаболизма растений Е. purpurea.
4. На основе результатов исследования биологической активности Е. purpurea предложено иммуностимулирующее средство.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 13 работ и получен патент РФ.
Структура и объем диссертации.
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов, методов исследований, результатов и их обсуждения, выводов, списка литературы и приложений. Работа изложена на 126 страницах машинописного текста, включает 10 таблиц, 18 рисунков и 10 приложений. Список литературы содержит 197 источников, в том числе 88 иностранных.
***
Автор выражает искреннюю признательность своему научному руководителю профессору И.Ю. Усманову, доценту кафедры физиологии растений Башировой P.M. и старшему преподавателю Федяеву В.В., старшему преподавателю кафедры фармакогнозии с курсом ботаники и основ фитотерапии БГМУ Шайдуллиной Г.Г. за неоценимую помощь, дружеское участие и постоянную поддержку на всех этапах работы. Благодарит старшего научного сотрудника Института органической химии Уфимского научного центра РАН Шитикову О.В., начальника патентного отдела БГУ Даукаева Р.С., ученого секретаря НИИ сельского хозяйства Ахтямова Н.А., директора АНО «Башкирское метеоагенство» Волобуеву О.В., коллектив кафедр пульмонологии и урологии Республиканской клинической больницы им. Куватова за помощь в работе.
Экологическая регуляция физиологических и биохимических процессов в растениях
Большинство лекарственных веществ растительного происхождения образуется в результате вторичного, или специализированного обмена (Biochemistry and molecular biology of plants, 2001). Вторичные метаболиты отличаются от первичных тем, что образуются на ответвлениях основных метаболических путей и, в силу таксономической принадлежности и экологической специализации, могут образовываться в одних видах (родах) и не образоваться в других. Последнее обстоятельство позволило назвать вторичные метаболиты веществами специализированного обмена. Это обширная группа соединений разной химической природы (фенольные соединения, алкалоиды, терпены и терпеноиды, эфирные масла, гликозиды и многие другие), которых сейчас открыто и описано более 30 000 (Носов, 1994).
Сформулировано множество гипотез, объясняющих биологический смысл и механизмы синтеза веществ специализированного обмена. Основная цель этих гипотез - объяснить, «зачем всё это нужно растениям». В результате многолетних исследований и обобщений был пройден путь от представлений о вторичных веществах как о метаболических «тупиках», своеобразных аналогах экскрементов животных, до признания важнейшей роли веществ специализированного обмена при адаптациях к факторам окружающей среды как биотического, так и абиотического происхождения. К настоящему времени центральное ядро представлений о природе веществ специализированного обмена связано с их участием в адаптации растений к большому числу факторов окружающей среды. По-видимому, можно утверждать, что вторичные метаболиты участвуют в адаптациях к изменениям по всем существенным осям многомерной экологической ниши.
Давно известны факты, интерпретируемые как «географичность природных веществ» (Георгиевский и др., 1990). Так, синтез некоторых веществ (кумарины, фенольные соединения и др.) зависит от «солярных зон», сменяющихся по широтам от зон ультафиолетового дефицита (высокие широты) до зон УФ-избытка на юге. Вторичные метаболиты образуются в ответ на изменения температуры (тепловой и холодовой стресс), влажности, инсоляции, наличии или отсутствии эдафических факторов, включая микроэлементы (табл. 1.1.) (Усманов и др., 2001). Накопление вторичных метаболитов в экологических градиентах носит, как правило, нелинейный характер (Лекарственные растения Башкортостана, 2002). Как видно из таблицы, под влиянием экологических факторов может меняться и количество, и качественный спектр Аридность Gentianceae (Горечавковые) ГЛИКОЗИДЫ, возрастают Усиление синтеза более сложных глико-зидов (тригликози-дов) Solanaceae (Пасленовые) Алкалоиды, возрастают Увеличение разнообразия Lamianaceae (Губоцветные) Терпеноиды, возрастают Увеличение разнообразия
Fe, Си в почве Asteraceae (Сложноцветные) Фенолкарбоно-вые кислоты, возрастают Увеличение разнообразия
Mg в почве Lamianaceae (Губоцветные) Терпеноиды, возрастают Увеличение разнообразия
Велико разнообразие веществ, синтезируемых при взаимодействии растений с микроорганизмами, насекомыми и высшими животными (Харборн, 1985). Большая группа веществ участвует в контроле взаимодействия между растениями, микроорганизмами и насекомыми в сложных почвенных системах. Эти взаимодействия описываются в рамках «аллелопатии» (Миркин и др., 1991).
Многообразие экологических функций вторичных метаболитов связано и с тем, что эти вещества обладают различными механизмами действия: одни - снижают доступность растительного материала для поедания (горечи, ингибиторы пепсина и трипсина, кутикулы), другие направлены на подавление «противника» - ингибируются ключевые ферменты «проникновения» (целлюлазы фитопатогенов), нарушается онтогенез и, в частности, репродуктивная функция насекомых через синтез гормонов, известны случаи прямого влияния на дифференциальную экспрессию генов.
Распространение вдоль одного из экологических градиентов (например, более южные и более северные популяции) не отменяет для растений необходимости адаптироваться к другим экологическим факторам: так, приспосабливаться к засухе растениям необходимо как на средних, так и южных широтах, в разных «солярных» или иных зонах. В силу этого в растениях должны синтезироваться какие-то функциональные аналоги тех соединений, синтез которых затруднен дефицитом УФ-света или иных факторов среды. Должны существовать специфические механизмы адаптивного замещения одних вторичных метаболитов другими. Такое адаптивное замещение изучено для очень небольшой группы вторичных метаболитов. По-видимому, можно думать о своеобразных «гомологических рядах» физиологически эквивалентных вторичных метаболитах. Однако сведений о том, как именно будет меняться та или иная молекула в экологических градиентах, очень мало.
Условия закладки посевов
Критерием успешной интродукции лекарственных растений является не только их успешное выращивание в новых климатических условиях, но и накопление достаточного количества биологически активных веществ, позволяющее использовать растение в качестве источника лекарственных средств. Из приведенного в аналитическом обзоре материала видно, что Е. purpurea успешно интродуцирована как за рубежом, так и в странах СНГ.
Исследования по интродукции Е. purpurea в Республике Башкортостан ведутся с 1993 года. Нами в течении трех лет, с 2001-2003 г.г проводилось выращивание растений в градиенте «северо-запад - юго-восток» на территории республики, в районах с разными почвенно -климатическими условиями. В условиях Южного Урала для Е. purpurea характерен растянутый период цветения и созревания плодов. Во всех изученных районах Е. purpurea ежегодно цветет и плодоносит. В каждой корзинке завязывается 178 + 20 семянок.
Проведенные исследования позволяют отнести Е. purpurea по шкале интродукционной устойчивости растений к группе высокоустойчивых (Трулевич, 1991) на основании следующих признаков: проходят полный годичный цикл развития побегов; характеризуются стабильностью ритмических процессов и их приспособленностью к местным климатическим и погодным условиям; их жизненное состояние высокое; продуктивность и размеры соответствуют природным; жизненная форма сохраняется; растения интенсивно размножаются и образуют самосев.
Сравнение роста, развития и накопления биологически активных веществ растениями из разных регионов республики показало, что в условиях Южного Урала происходит изменение не только анатомо морфологических параметров, но и вторичного метаболизма эхинацеи, способствующих поддержанию нормальных физиологических процессов растений в условиях атмосферной засухи. Пластичность морфологических, аллометрических и биохимических показателей Echinacea purpurea в эколого-географическом градиенте
Изучение влияния эдафических факторов на морфофизиологические показатели и накопление биологически активных веществ показало, что параметры роста в большей степени зависят от эдафических факторов , чем синтез флавоноидов. Максимальный вес растений, увеличение параметров роста, накопление флавоноидов происходит при значениях рН 6,2-6,4. Установлено, что положительное влияние на параметры роста оказывают ионы кобальта. Диаметрально противоположное влияние на показатели роста оказывают ионы меди.
Метеорологические факторы оказывают воздействие как на параметры роста Е. purpurea, так и на синтез вторичных метаболитов. Максимальную массу растения накапливают в годы с достаточным количеством осадков и среднемесячной температурой вегетационного сезона 16,5 -17 С.
Проведение химических исследований Е. purpurea, выращенных в исследованных экорегионах также меняется в зависимости от почвенно-климатических условий. Так, различно общее накопление флавоноидов, качественный состав алкиламидов также отличается. Растения накапливают достаточное количество биологически активных веществ и соответствуют требованиям ВФС.
Изучение фармакологической активности Е. purpurea, показало иммуностимулирующий эффект. Разработанное на основе травы Е. purpurea иммуностимулирующее и противовоспалительное средство обладает выраженной фармакологической активностью и может быть рекомендовано для профилактики иммунологических нарушений. выводы
1. Вид Echinacea purpurea хорошо перенес интродукцию в условия Южного Урала: растения проходят полный жизненный цикл от семени до семени, нормально переносят уральские зимы, формируют полноценную вегетативную массу и жизнеспособные семена. Адаптивный потенциал Е. purpurea определяется как смешанная CR-стратегия. В силу этого можно рекомендовать выращивание растений эхинацеи во всех почвенно-климатических зонах Республики Башкортостан.
2. Выращивание растений в градиенте «северо-запад - юго-восток» протяженностью более 500 км показало, что растения весьма пластично реагируют на особенности климата и состава почв: меняются морфологические, аллометрические и др. показатели, меняются и коррелятивные связи между параметрами растений. Так, анализ структуры корреляций морфофизиологических параметров Е. purpurea с агрохимическими показал, что накопление биологической массы растений определяется рН почвы, содержанием гумуса и микроэлементов.
3. Биохимический состав растений Е. purpurea, выращенных в исследованных экорегионах также меняется в зависимости от почвенно-климатических условий. Так, различно общее накопление алкиламидов и флавоноидов, различается фракционный состав алкиламидов. В то же время общее содержание физиологически активных веществ в растениях из всех экорегионов соответствует требованиям ВФС.
Влияние климатических и почвенно-экологических факторов на продуктивность Е. purpurea
Нами в течение трех лет проводились наблюдения за ростом и развитием Е. purpurea в регионах республики Башкортостан. Для проведения наиболее полного изучения биологии Е. purpurea в условиях Башкортостана были заложены опытные участки в разных по климатическим и экологическим условиям районах. Семена Е. purpurea были высеяны в 2000 году в эколого-географическом градиенте северо-запад, юго-восток РБ в пунктах: пос. Кушнаренково (Кушнаренковский район), д. Ракитов куст (Кармаскалинский район), пригород г. Сибая (Баймакский район).
В каждом пункте растения размещали на 2-5 участках. Для посева использовали семена башкирской репродукции.
Всего было заложено 11 опытных площадок с разными типами почв: выщелоченные и типичные, солонцеватые и слабооподзоленные черноземы; темно-серые лесные почвы (Башкортостан, 1996; Гареев A.M., 2001). Диапазон варьирования показателей почв пахотного горизонта по рН был в пределах 5,79-7,25; гумуса 4,05-8,44; гидролитической кислотности 1,09-4,05 мг-экв/ЮОг; фосфора 5,14-7,22 мг на 100 г почвы; калия 12,03-12,91 мг на ЮОг почвы; меди 1,05-1,42 мг/кг; молибдена 0,07-0,20 мг/кг; кобальта 2,09-2,48 мг/кг; бора 1,79-3,20 мг/кг. Агрохимические показатели почвы представлены в приложении 3, 4.
Проведенное нами сравнение морфологических показателей 2001-2003г растений Е. purpurea., выращенной в трех районах Башкирии показало, что растения нормально развивались и достигали обычных размеров (табл. 3.1.1.).
Средняя масса 1000 семянок колебалась по годам от 1,7 г до 3,4 г в зависимости от гидротермических условий. Е. purpurea ежегодно цветет и плодоносит. В каждой корзинке завязывается 178 ± 20 семянок.
На первом году вегетации растения образуют розетку прикорневых листьев. Первые листья растений второго и третьего годов вегетации появляются сразу после схода снега и имеют красно-коричневую окраску. Фаза полного цветения наступает примерно в один период, в третьей декаде июля, и не зависит от гидротермических условий. Результаты, .представленные в таблице 3.1 Л., показывают, что надземная биомасса эхинацеи из Баймакского района наибольшая, хотя теоретически должно быть наоборот, так как район характеризуется засушливым климатом. Это можно объяснить тем, что в наиболее засушливые периоды в Баймакском районе имел место эпизодический полив. Анализ морфофизиологических показателей выборки, составленной на основании трехлетних наблюдений за Е. purpurea показал, что среднее значение высоты растений было максимальным в 2002 году, характеризовавшимся большим количеством осадков и составило 92,99+4,70 см, тогда, как в менее обеспеченные осадками годы - 2001 г. высота растений составляла - 92,06±4,93 см и 2003 г. - 79,18±6,25 см. Максимальное значение высоты черешка, длины листовой пластинки было также в 2002 году и составило 23,1 и 14,7 см (приложение 5).
Наибольшее количество розеточных листьев наблюдалось у растений из Кармаскалинского района (табл. 3.1.1.)- Число стеблевых листьев определяется прежде всего высотой цветоносного побега, что видно по растениям из Баймакского района. Возраст растений и гидротермические условия на данный показатель не влияют.
Изучение количества цветоносных корзинок показало, что максимальное их число характерно для растений третьего года вегетации и Кушнаренковского района (рис.3.1.1).
Максимальная высота цветоносных побегов Е. purpurea наблюдается у растений из Баймакского и Кушнаренковского районов и составляет 89,1 и 88,6 см (табл. ЗЛ.1). У всех растений Е. purpurea к периоду плодоношения наблюдается снижение количества розеточных и стеблевых листьев. Деградация нижних старых листьев сопровождается перераспределением вторичных метаболитов, пластических веществ и является результатом приспособления к условиям недостаточного увлажнения (Физиология и биохимия сельскохозяйственных растений, 1998).
Изучение аллометрических показателей выявило, что наиболее стабильным показателем является соотношение вес/высота. По отношениям побег/корень и масса соцветий/вес растения (репродуктивное усилие) максимальные значения отмечены для растений Баймакского района. Выявлены максимальные значения по отношениям масса листьев/масса растения и масса корня/масса растения для растений Е. purpurea Кушнаренковского района.
Проведенные исследования позволяют отнести Е. purpurea по шкале интродукционнои устойчивости растений к группе высокоустойчивых (Трулевич, 1991) на основании следующих признаков: проходят полный годичный цикл развития побегов; характеризуются стабильностью ритмических процессов и их приспособленностью к местным климатическим и погодным условиям; их жизненное состояние высокое; продуктивность и размеры соответствуют природным; жизненная форма сохраняется; растения интенсивно размножаются и образуют самосев.
С целью выяснения взаимосвязи морфофизиологических показателей с агрохимическими факторами проведен корреляционный анализ (приложение 7, табл. З.1.З.).
Вопрос, с какими эдафическими факторами теснее всего коррелирует продуктивность эхинацеи пурпурной, имеет практическое значение при разработке технологии выращивания Е. purpurea, включающей выбор участков с оптимальными агрохимическими характеристиками.
