Введение к работе
Актуальность проблемы.
Вопросы, связанные с механизмами формирования осевых структур организма в период раннего эмбриогенеза, являются важнейшими вопросами классической биологии развития. На сегодняшний день на модели зародышей амфибий показано, что разметка будущих осевых структур обеспечивается благодаря возникающим еще до начала гаструляции градиентам растворимых факторов, таких как noggin, chordin, follistatin, BMP и др. [De Robertis et al., 2009]. Кроме того, важную роль в данных процессах играют клеточные движения конвергентной интеркаляции, основным центром которых является область, расположенная над дорсальной губой бластопора, или супрабластопоральная область (СБО). Движения конвергентной интеркаляции совершаются клетками зародыша в направлении, перпендикулярном средней линии СБО, и приводят к его продольному вытяжению. При этом если бы к началу гаструляции направление клеточной дифференцировки было определено окончательно, функция данных движений сводилась бы лишь к распределению клеток, в зависимости от их свойств, в пределах организма. Однако, судя по результатам ряда работ [Beloussov et al., 1988; Keller and Danilchik, 1988; Zaraisky, 1991], в действительности ситуация представляется значительно сложнее, а вопрос о том, каким образом определяется направление интеркаляционных движений, все еще остается открытым.
Относительно новой областью в биологии развития стало исследование механических факторов, которые, как показано в многочисленных исследованиях [Reilly and Engler, 2010; Farge, 2003; Beloussov et al., 2006; Yang et al., 2000; Allioux-Guerin et al., 2009 и др.], наряду с химическими участвуют в пространственной организации и дифференцировке клеточных структур. Моделью в таких работах служат как отдельные клеточные культуры, так и развивающиеся организмы в целом. При этом клетка рассматривается как механически напряженная система, способная оказывать силовое воздействие на окружающие структуры, а также воспринимать подобный сигнал извне [Mammoto and Ingber, 2009]. В настоящее время описаны пути передачи силового сигнала с поверхности клетки или его создания самой клеткой, а также взаимосвязь этих процессов с генетической экспрессией [Wang et al., 2009]. В связи с вышеизложенным, большой научный интерес представляет экспериментальное изучение роли механо-геометрических изменений, сопровождающих развитие организма и дифференцировку его клеток.
Исследования по передаче клетками механических сигналов имеют не только фундаментальное, но и прикладное значение. Во-первых, нарушения данных систем могут служить причинами разного рода патологий [Ingber, 2003], в том числе заболеваний сердечнососудистой системы, нарушений опорно-двигательного аппарата, онкологической
трансформации и др. Кроме того, продемонстрирована решающая роль механических условий при определении направления дифференцировки стволовых клеток [McBeath et al., 2004].
Основной задачей настоящей работы было исследование классических вопросов биологии развития, связанных с дифференцировкой осевых зачатков, принимая во внимание возможную роль механических факторов в регуляции данных процессов. Хорошо известно, что начальные этапы формирования осевых зачатков сопровождаются сложной структурной реорганизацией тканей зародыша. В первую очередь, это латеро-медиальная интеркаляция клеток и интенсивное продольное вытяжение нейроэктодермы, хордомезодермы и мезодермы сомитов. Во-вторых, это последовательные активные и пассивные сокращения и растяжения участков данных тканей в ходе образования нервной трубки [Jacobson and Gordon, 1976].
Касательно первой группы процессов необходимо отметить исследования, в которых наблюдали нарушения упорядоченности осевых структур у зародышей амфибий вследствие релаксации напряжений на стадии гаструлы [Beloussov et al., 1994], а также переориентацию интеркаляционных движений в ответ на искусственное растяжение СБО в направлении, перпендикулярном передне-заднему [Beloussov et al., 1988]. Относительно второй группы процессов, в научных публикациях не раз встречались свидетельства формирования у различных экспериментальных образцов нейральных закладок в направлении вогнутых и, возможно, подвергавшихся сжатию областях, а мезодермальных - в направлении выпуклых, возможно, подвергавшихся растяжению [Spemann et al., 1936; Saxen and Toivonen, 1963; Saint-Jeannet et al., 1994 и др.]. Данные наблюдения порождают вопрос о зависимости дифференцировки тканей осевых структур от механо-геометрических условий, в которых находятся их клетки-предшественники. В частности, важно выяснить, какова роль механических факторов при определении направлений движений конвергентной интеркаляции и взаимного расположения и ориентации осевых зачатков в пространстве.
В качестве удобной модели для изучения и оценки молекулярных и физических факторов, участвующих в морфогенезе и дифференцировке клеток, в экспериментальной эмбриологии успешно используется зародыш шпорцевой лягушки Xenopus laevis. С одной стороны, для данного объекта разработан обширный ряд методик, позволяющих исследовать эти процессы. С другой стороны, в силу высокого консерватизма базовых механизмов раннего эмбриогенеза, результаты, полученные на Xenopus, могут быть в той или иной степени перенесены на других представителей группы позвоночных.
Цели и задачи исследования.
I. Выяснение роли механических напряжений при определении направления клеточных движений конвергентной интеркаляции, а также пространственной ориентации осевых дифференцировок на модели зародышей шпорцевой лягушки X. laevis с релаксированной СБО. П. Изучение зависимости характера перемещения и изменения формы клеток, а также взаимного расположения нейро-мезодермальных закладок от сжатого/растянутого состояния участка СБО на модели изогнутых двойных эксплантатов СБО зародышей шпорцевой лягушки X. laevis.
Исходя из I цели, были сформулированы следующие задачи:
Оценка основных градиентов механических напряжений у зародышей после релаксации СБО.
Наблюдение за направлением движений конвергентной интеркаляции у зародышей с релаксированной СБО.
Изучение расположения осевых дифференцировок (определяемых по паттернам экспрессии тканеспецифичных генов и гистологически) у зародышей с релаксировнной СБО.
Для достижения II цели работы были поставлены следующие задачи:
Оценка изменения напряжения на поверхности изогнутых двойных эксплантатов СБО по сравнению с интактными (неизогнутыми).
Исследование активных клеточных реакций (таких, как изменение формы или перегруппировка) в ответ на искусственную деформацию двойных эксплантатов СБО.
Изучение расположения осевых дифференцировок (определяемых по паттернам экспрессии тканеспецифичных генов и гистологически) в изогнутых и интактных двойных эксплантатах СБО.
Научная новизна работы.
Впервые на зародышах шпорцевой лягушки показано, что направления движений конвергентной интеркаляции клеток на стадии гаструлы зависят от полей механических напряжений. В результате релаксации СБО, которая сопровождалась перемещением основного узла натяжений с дорсальной на вентральную губу бластопора, интеркаляционные движения наблюдались не в СБО, как при нормальном развитии, а в направлении вентральной средней линии и в области боковых губ - в направлении возникших после релаксации основных градиентов натяжений.
Также впервые с помощью современных молекулярно-биологических методов показано, что полнота и упорядоченность осевых дифференцировок четко коррелирует с ориентацией клеточных движений и, прежде всего, с конвергенцией клеток к некоторой оси. В СБО
подавление данных движений нарушало формирование хорошо развитых и четко ориентированных осевых структур. Возникновение интеркаляционных движений в боковых губах, напротив, этому способствовало. Таким образом, конвергентная интеркаляция клеток осуществляется перпендикулярно основным градиентам натяжений и это определяет ориентацию и нормальный морфогенез осевых зачатков.
Кроме того, впервые исследовали зависимость взаимного расположения нейро-мезодермальных дифференцировок от сжатого/растянутого состояния участков СБО. Показано, что искусственное растяжение или сжатие участков СБО может в течение достаточно коротких временных сроков вызывать активный ответ (в частности, изменение формы или перемещение) со стороны их клеток. Такие краткосрочные реакции сопровождались на более поздних сроках изменением классического распределения нейральных и мезодермальных закладок: наблюдали статистически значимое преимущественное расположение нейральных дифференцировок на вогнутых, подвергавшихся сжатию, сторонах. В свою очередь, мезодермальные закладки формировались в направлении выпуклых, подвергавшихся растяжению, областей, подковообразно огибая нейральные.
Апробация работы.
Основные результаты диссертационной работы были доложены на Междунородной конференции Европейского общества исследователей в области эволюции и эмбриологии «3rd Euro Evo Devo Conference» (Париж, 2010), Международной конференции по морфогенезу и клеточному поведению «Morphogenesis and cell behavior» (Барселона, 2008), Международной конференции, посвященной клеточной подвижности «Biological motility: achievements and perspectives» (Пушино, 2008), Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам "Ломоносов" (Москва, 2009), XV Школе «Актуальные проблемы биологии развития» (Звенигород, 2008), Симпозиуме с международным участием «Клеточные, молекулярные и эволюционные аспекты морфогенеза» (Москва, 2007).
Публикации.
По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, включая 3 журнальные статьи.
Структура и объем диссертации.
Похожие диссертации на Роль механо-геометрических факторов в пространственной организации осевых дифференцировок у зародышей шпорцевой лягушки
