Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Куриный эмбрион, как адекватная биологическая модель эмбрионального развития 9
1.1. Экспериментальное и практическое использование куриного эмбриона в биологии, медицине и промышленности 9
1.2. Основные сведения о закономерностях эмбрионального развития кур( и-специфические особенности адаптации и патологии куриного эмбриона в онтогенезе 18
1.2.1. Особенности иммунного реагирования птиц в онтогенезе. Неспецифические и иммунные факторы защиты у куриного эмбриона 25
1.3. Искусственное и естественное воздействие внешних факторов на эмбриогенез птиц. Пути управления эмбриогенезом 35
Глава 2. Материалы и методы 43
Глава 3. Изменения показателей роста, развития и иммуногенез куриных эмбрионов под влиянием амброзийного антигена (собственные исследования) 54
3.1. Выживаемость, общее состояние и морфометрические показатели эмбрионов 54
3.2. Патологоанатомические и морфометрические особенности иммунных органов 73
3.3. Результаты гематологических и иммунологических показателей эмбрионов 119
3.4. Цитохимические показатели крови развивающихся эмбрионов .135
Обсуждение результатов собственных исследований 142
Выводы 155
Практические предложения 158
Список литературы 159
- Основные сведения о закономерностях эмбрионального развития кур( и-специфические особенности адаптации и патологии куриного эмбриона в онтогенезе
- Искусственное и естественное воздействие внешних факторов на эмбриогенез птиц. Пути управления эмбриогенезом
- Патологоанатомические и морфометрические особенности иммунных органов
- Цитохимические показатели крови развивающихся эмбрионов
Введение к работе
Актуальность темы. Наиболее адекватной моделью, позволяющей в динамике изучить у позвоночных закономерности преобразований на протяжении эмбриогенеза без ущерба для материнского организма, являются эмбрионы птиц. Их особенностью является доступность и управляемость в процессе эксперимента, возможность получения и фиксирования результа-тов практически с помощью всех известных методов: эмбриологических, гистологических, цитологических, генетических, биохимических, гематологических, микрохирургических и многих других. Работа с куриным эмбрионом (КЭ), как объектом промышленного инкубирования, сопровождается неизбежными потерями, но они не противоречат принципам биоэтики и, в отличие от работы с эмбрионами млекопитающих и человека, может быть реализована на любом этапе онтогенеза, являющемся предметом интереса исследователя.
В вирусологии и микробиологии куриный эмбрион используется для определения патогенности и степени вирулентности микроорганизма, в иммунологии — для изучения толерантности, аллореактивности, онтогенеза В-и Т-лимфоцитов и пр. (Вирусология. Методы, 1988; Ветеринарная вирусология, 1991; Ветеринарная вирусология, 1999; Косик Н.В., Ржепаковскии И.В., Булгакова И.В., 2003).
В биотехнологии и медицине куриный зародыш применяют в качестве основной сырьевой субстанции для производства биологически активных -препаратов, иммунотропных и косметических средств (Тимченко Я'. Д., Косик Н.В., 2004). Это обусловливает необходимость изучения особенностей реагирования, в том числе иммунного ответа организма КЭ на многочисленные естественные и искусственно созданные внешние факторы, окружающие птицу в процессе жизни и влияющие на яйцо во время инкубации.
Одним из малоизученных и интересных аспектов развития куриного эмбриона является изучение особенностей его реакции на многочисленные аллергены, вероятность контакта с которыми в процессе жизни у птицы
4 велика. Имеется скудная информация (Болотников И.А., 1982; Болотников
И.А., Михкеева B.C., Олейников Е.К., 1983), свидетельствующая о специфике реагирования взрослой птицы на общеизвестные аллергены: отсутствие аллергической реакции по классическому типу, отсутствие IgE, признаки гиперчувствительности замедленного типа и др.
Однако сведений об исследованиях, связанных- с изучением особенностей развития, в том числе иммунокомпетентных органов КЭ под действием известных аллергенов, в доступной литературе найти не удалось. Этот факт приобретает особое значение в связи с имеющимися сообщениями о возможности накопления продуктов эндогенного происхождения в желточном мешке, вещества которого используется эмбрионом в качестве источника питания (Отрыганьев Г.К., Бессарабов Б.Ф., Исаев Ю.В., 1981). К таким эндогенным веществам можно отнести наиболее агрессивные аллергены растительного происхождения, в частности, повсеместно распространенную на территории Южного федерального округа амброзию, с которыми курица может контактировать в процессе жизни.
В связи с вышеизложенным, изучение особенностей развития и иммуногенеза эмбриона в процессе экспериментального воздействия амброзийного аллергена представляется крайне актуальным.
Цель исследования. Изучить влияние аллергена пыльцевого амброзии полыннолистной на показатели развития и иммуногенез куриного зародыша при его экспериментальном введении на разных этапах эмбриогенеза.
Задачи исследования:
изучить особенности реакции куриного эмбриона на разных этапах его развития при введении амброзийного аллергена с учетом результатов общего осмотра, динамики роста и массы тела;
исследовать уровень иммуноглобулинов у куриных эмбрионов в норме и под воздействием амброзийного аллергена;
изучить в сравнительном аспекте морфофункциональные показатели крови куриного эмбриона в норме и под воздействием амброзийного аллергена;
исследовать цитохимические особенности лимфоцитов и нейтро-филов куриного зародыша в разные периоды инкубации в норме и под воздействием амброзийного аллергена;
изучить влияние амброзийного аллергена на процесс гистогенеза иммунных органов эмбрионов в отдельные периоды развития.
Научная новизна. Впервые изучены особенности роста, развития и состояния иммунных органов КЭ под влиянием амброзийного аллергена при его экспериментальном введении в различные периоды инкубации.
Впервые изучены закономерности аллометрического, конформного, гомономного типов роста у эмбрионов в норме и под воздействием аллергена.
Получены новые данные по влиянию амброзийного аллергена на разных этапах развития на гистогенез иммунных органов куриного эмбриона.
Впервые изучены в различные сроки развития КЭ гематологические, иммунологические, цитохимические показатели лимфоцитов и нейтрофи-лов крови при однократном введении амброзийного аллергена в желточный мешок. Установлена взаимосвязь этих показателей с особенностями развития.
Установлены наиболее критические сроки развития куриного эмбриона по отношению к влиянию аллергена.
Получены новые данные, дополняющие гистологию и эмбриологию, биологию развития и размножения, иммунологию, сведениями об особенностях эмбрионального развития птицы и иммунной реактивности зародышей под влиянием аллергена.
Теоретическая и практическая значимость. Проведенные исследования позволили выявить закономерности развития куриных зародышей в отдельные периоды эмбриогенеза в искусственно смоделированных небла-
гоприятных условиях и выявить роль аллергического фактора в нарушении развития.
Результаты исследования позволяют судить о качестве эмбриона в це
лом и его иммунной системе на отдельных этапах онтогенеза, в-том числе о
вероятности сенсибилизации и специфике ответных реакций организма, что
может представлять интерес для биотехнологов при целенаправленном от
боре эмбриональных тканей, для разработки биологически активных и ле
карственных препаратов. . ;.
Полученные данные дополняют и расширяют общеизвестные представления об эмбриогенезе птиц и могут быть использованы в учебном процессе при чтении лекций и проведении лабораторных занятий по биологии развития и размножения, гистологии и эмбриологии.
Апробация работы. Основные положения работы доложены на научной конференции «Университетская наука - региону» (Ставрополь, 2006; 2007); Международной научно-практической конференции (Ставрополь, 2006); в рамках Российской школы-конференции молодых ученых (Пушино, 2006); на Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные аспекты жизнедеятельности человека на Севере» (Архангельск, 2006); на Третьей ежегодной конференции студентов и аспирантов базовых кафедр ЮНЦ РАН (Ростов-на-Дону, 2007); в рамках 16-й Всероссийской научно-методической конференции «Современные проблемы патологической анатомии, патогенеза и диагностики болезней животных» (Ставрополь, 2007).
Положения, выносимые на защиту.
Аллерген пыльцевой амброзии полыннолистной оказывает негативное влияние на морфометрические, гематологические, гистологические показатели роста и развития и иммуногенез куриного эмбриона в зависимости от сроков введения в желточный мешок.
Специфичность влияния аллергена на организм куриного эмбриона в разные сроки инкубации различна и проявляется гипоксией, гипотрофией,
7 нарушением тканевой дифференцировки, а также изменением иммунной
реактивности.
Реализация результатов исследований. Работа проведена в соответствии с тематическим планом КИР Южного научного центра РАН по теме № 00-05-06 от 2005 г. «Разработка концепций комплексной защиты здоровья человека и животных при иммунопатологиях», выполняемой совместно со Ставропольским государственным университетом. Результаты исследований включены в научные отчеты ЮНЦ РАН и СГУ за 2005-2007 гг. и используются в деятельности сектора иммуномониторинга и иммунокоррек-ции научно-исследовательской лаборатории биологически активных веществ и новых материалов ЮНЦ РАН, в проблемной научно-исследовательской лаборатории экспериментальной- иммуноморфологии, иммунопатологии и иммунобиотехнологии СГУ при разработке новых биологически активных препаратов, в том числе аллерготропинов.
По заявке, основанной на результатах исследований, выигран грант на участие в работе Российской школы-конференции молодых ученых «Эко-токсикология: современные биоаналитические системы, методы и технологии».
Результаты используются учебном процессе при чтении лекций и проведении лабораторных занятии по биологии развития и размножения, гистологии и эмбриологии, иммунологии в Ставропольском государственном университете, Ставропольском филиале Московского государственного гуманитарного университета им. М.А. Шолохова, Кубанском государственном аграрном университета, Кабардино-Балкарской государственной сель-скохозяйственной академии, Башкирском государственном аграрном университете и в научной работе Ставропольского научно-исследовательского института животноводства и кормопроизводства.
Публикации результатов исследования. По теме диссертационного исследования опубликовано 13 работ, в том числе две из них в периодических изданиях из перечня ведущих рецензируемых научных журналов, ут-
8 вержденных ВАК Министерства образования и науки России и рекомендованных для публикации основных научных результатов диссертации на соискание искомой ученой степени.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения результатов собственных исследований, выводов, практических предложений, списка литературы. Список литературы включает 238 источников, в том числе 50 — иностранных авторов. Работа изложена на 181 странице компьютерного текста, иллюстрирована 47 фотографиями, 19 таблицами, 7 диаграммами.
Основные сведения о закономерностях эмбрионального развития кур( и-специфические особенности адаптации и патологии куриного эмбриона в онтогенезе
Проблеме исследования раннего онтогенеза птиц посвящено большое количество работ, которые внесли весомый вклад в развитие разделов орнитологии (Дьяконов Ю.В., 1981; Мянд Р., 1988; Климов СВ., 1994; Benes Г., 1991; Turan L.S., 1990; Inglisa М. et al, 1993; Keller L.F., Noordwijk A., 1994). К основным темам, над которыми работают исследователи, можно отнести вопрос о размножении и развитии птиц, изучение систематических групп, использование ооморфологии для изучения экологической изменчивости птиц (Микляева М.А., Скрылева Л.Ф:, 2001). Однако наибольшее количество работ посвящено исследованию закономерностей развития; зародыша при оптимальных условиях инкубации. Основной биологической модельюв этом случае выступает куриный эмбрион.
B ходе таких исследований накопилась информации, описывающая морфометрические, гематологические, гистологические, иммунологические и многие другие сведения (Задарновская Р.Ф., 1966; Токин БЛЇЇі, 1970; Горышина Е.Н:, Чага О.Ю., 1990; Фролов И.Ю;, 1993; Гладков Б;А., 1997; Мащенко.А.С, Сорокина А.А., 1999). Эти данные помогают прослеживать развитие возможных патологических процессов в организме КЭ под воздействием-различных факторов..
Одним из наиболее изученных показателей развития КЭ является рост. Бодемер Ч. (1971) определял рост как увеличение общей массы в процессе развития, приводящее к постоянному увеличению размеров организма. Рост — это одна из характеристик, позволяющая судить о способах и путях адаптации эмбриона, к условиям окружающей среды (Микляева М.А., Скрылева Л.Ф., 2001). Рост эмбрионов начинается с момента прохождения желтка по яйцеводу. Необходимо заметить, что увеличение размеров различных органов в эмбриональный период не равномерно. В начале эмбриогенеза изменение массы тела происходит интенсивнее по сравнению с конечными этапами развития. Отклонение в скорости роста эмбрионов прямопропорционально зависит от качества яиц и условий инкубации. Как замедленный, так и интенсивный рост эмбриона приводит к патологическим изменениям (Отрыганьев Г.К., Бессарабов Б.Ф., Исаев Ю.В., 1981).
В процессе роста, по мнению Белоусова Л.В. (2005), изменение массы и размеров тела организма не находятся в строгой зависимости. Этот факт обуславливает необходимость рассматривать рост массы и линейных размеров тела по отдельности. Увеличение массы тела организма в эмбриональный период происходит за счет синтеза веществ цитоплазмы и накопления неорганических веществ. Существует два вида изменения массы тела. Первый — абсолютный рост (выражается в весовых единицах) — увеличение массы тела за определенный промежуток времени. Абсолютная масса эмбриона с возрастом увеличивается. Второй — относительный — прирост массы тела в процентах к первоначальной массе. С возрастом относительная масса уменьшается (Отрыганьев Г.К., Бессарабов Б.Ф., Исаев Ю.В., 1981). Изменение массы тела эмбрионов зависит от качества яйца и условий инкубации. Например, по данным Левина Г.М. (1971) масса тела эмбрионов зависит от породы кур. Исследователи считают, что вес суточных цыплят прямо пропорционален весу яйца до инкубации (Ветеринар; ные препараты: Справочник, 1981. Результаты экспериментальной работы Затона Е.Г (2006) свидетельствуют о том, что обработка инкубируемых яиц лазером на ранних стадиях развития оказывает стимулирующее действие на увеличение массы тела эмбрионов.
Рост может происходить или за счет увеличения размеров тела, или в ходе интенсивного клеточного деления (Белоусов Л.В., 2005). Рост эмбриона связан с его развитием и качественными возрастными изменениями. Развитие эмбриона сопровождается морфологическими изменениями всего тела и отдельных органов. В разные периоды эмбриогенеза критерием развития служат разнообразные признаки. Например, в течение 4-8 суток инкубации у КЭ интенсивно растет голова и спина, сам эмбрион погружен в желток (Буртов Ю.З., Голдин Ю.О., Кривопишин И.П., 1990).
Основываясь на данных, описывающих особенности развития куриных зародышей, исследователи пытались разделить весь период эмбриогенез на стадии для упрощения работы с данной биологической моделью в лабораторных условиях. Так Hamburger V., Hamilton Т.Н. (1951), руково 21 дствуясь морфологическими изменениями зародышей в разные периоды развития, условно разделили эмбриональное развитие на 46 стадий. Позднее данные исследования были дополнены исследованиями ученых, которые описывали изменения в строении провизорных органов эмбриона в процессе инкубации (Объекты биологии развития, 1975). До 22 стадии основным критерием диагностики является возникновение сомитов. С 22-й стадии учитывается степень дифференцировки почек конечностей. С 8-х по 12-е сутки наилучшее различие между стадиями обеспечивают закладки перьев, строение век глаза. К концу инкубации, когда появление новых структур выявляется недостаточно отчетливо, диагностическим признаком для определения стадий является длина клюва и среднего пальца ноги.
По мнению Буртова Ю.З. Голдина Ю.С., Кривопишина И.П. (1990) в, процессе развития КЭ в зависимости от периода инкубации происходят изменения количественных и качественных преобразований. В связи с этим в эмбриональном развитии куриных зародышей автор выделил три периода. Первый - зародышевый, который длится у КЭ с момента оплодотворения яйцеклетки до 8-х суток. В это время происходит развитие скелета, закладка органов и их систем. Во второй (предплодный) период, длящийся до 12-го дня инкубации, происходит рост и специализация систем. В третий плодный период, который начинается с 12-го дня и заканчивается выводом, наблюдается рост и развитие организма, подготовка к вылуплению. Третьяков Н.П. (1990) выделил 21 период в эмбриональном развитии куриного зародыша. Такое деление основывается на посуточных изменениях в строение и росте эмбриона.
Искусственное и естественное воздействие внешних факторов на эмбриогенез птиц. Пути управления эмбриогенезом
Развитие эмбриона нельзя рассматривать отдельно от условий, в которых протекает процесс инкубации. Окружающая среда определяет эмбриогенез организма и правильность течения этапов развития. Большое внимание со стороны исследователей уделяется изучению влияния экологических факторов в период яйцекладки на эмбриогенез птиц (Дубась Г.И., 1993; Сугробова Н.Ю., 1997; Perrins СМ., 1967; Desai J.H. et al., 1980; Ma-honey S.P. et al., 1981). Зависимость течения эмбриогенеза от внешнейхре-ды наблюдается при естественном развитии зародышей и в искусственных условиях инкубации. Часто именно нарушения во внешней среде ослабляют организм и способствуют заболеванию зародыша. Исследователи достаточно давно изучают, какие условия окружающей среды необходимы для нормального развития эмбриона птиц (Скрылева Л.Ф., 1992; Rogers S., 1987). По мнению исследователей до инкубации яйца необходимо хранить не более 3-4 суток после откладки при температуре 8...12С и относительной влажности 75-80%, в хорошо вентилируемом помещении (Ветеринарные препараты: Справочник, 1981).
Интенсивность роста организма и течение его физиологических процессов зависит от окружающей температуры, так как до поздних стадий развития зародыш не обладает способностыо к терморегуляции (Морина, Н. В., 1992). Поэтому необходимо поддерживать температурный режим при инкубации яиц. Оптимальная температура в инкубаторе должна составлять 37,5-37,8С (Справочник ветеринарного лаборанта, 1981; Буртов Ю.З., Голдин Ю.С., Кривопишин И.П., 1990; Третьяков, Н.П., 1990).
Во время инкубации вода из яйца только испаряется, что приводит по исследованию ученых к уменьшению массы яйца (Rahn Н., Paganelli С, 1990). Некоторые литературные данные свидетельствуют о том, что вокруг яйца имеются слои влажного неподвижного воздуха, благодаря чему регулируется водный баланс яйца (Гражданкин А.В., 1987; Spotila J.R. et al. 1981). Гражданкин А.В. (1992) установил, что нарушение темпа влагоотдачи отрицательно влияет на эмбриональное развитие птиц и может стать причиной заболевания зародыша. Эффективность воздушного охлаждения возрастает с повышением относительной влажности воздуха, так как при этом происходит увеличение его теплосодержания (Буртов Ю.З., Голдин Ю.С., Кривопишин И.П., 1990). Основываясь на этих данных, был установлен оптимальный уровень влажности в инкубаторе, который составляет 60-70% (Объекты биологии развития, 1975; МоринаН. В., 1992).
Перемещение яиц обуславливает регуляцию ряда физических факторов (температура, газовая среда, влажность) и тем самым поддерживает нормальное течение эмбриогенеза (Экология раннего онтогенеза птиц, 1985). По мнению ряда исследователей необходимо, чтобы яйца периодически переворачивались под углом 45 как по направлению, так и против часовой стрелки не реже двух раз и не чаще 24-х раз в сутки (Объекты биологии развития, 1975).
Все вышеперечисленные условия отображены в зоотехнических требованиях выдвигаемых к процессу инкубации, правильное исполнение которых является залогом нормального роста и развития КЭ. Однако ряд исследователей установили, что колебание температуры, в процессе инкубации, оказывает положительное влияние на формирование фенотипических признаков организма, что ведет за собой повышение адаптивных возможностей. Термоконтрастный режим инкубации стимулирует активацию функций иммунокомпетентных органов; приводит к повышению гематологических показателей. Такая реакция организма на изменения температурного режима инкубации приводит к усилению роста и развития организма по сравнению с развитием эмбрионов в инкубаторе с постоянной температурой (Познанин Л.П., 1979; Болотников A.M., Шураков А.И. и др., 1985; Самотин A.M., Сулейманов СМ., Мануковская А.А., 2006).
Одним из важных вопросов при выведении здорового молодняка является выполнение санитарно-гигиенических требований, выдвигаемых к обработке инкубационных яиц. При продвижении по яйцеводу скорлупа покрывается слизью (кутикулой) которая предотвращает проникновение микробов, спор грибов (Фролов И.Ю., 1993). Однако содержание яиц в антисанитарных условиях может привести к их инфицированию и попаданию микрофлоры внутрь яйца в результате засасывания воздуха (Ветеринарные препараты: Справочник, 1981). По мнению автора для выведения здорового молодняка необходимо проводить дезинфекцию поверхности яйца парами формальдегида.
По данным Буртова Ю.З., Голдина Ю.С., Кривопишина И.П. (1990), Силиновой Н.П. (1999) ультрафиолетовые (УФ) лучи, обладая высоким бактерицидным действием, снижают микробную обсемененность яиц, что приводит к улучшению условий развития зародышей птиц. Облучение усиливает синтез витамина D, благодаря чему улучшается обмен веществ, возрастает устойчивость эмбрионов к неблагоприятным условиям, повышается вывод молодняка на 5-8% (Симонова, Н.П., 1999; Корнилова В.А., Алкарев Н.И, 2006).
Перекисные соединения, в том числе их смесь снижает бактериальную обсемененность инкубационных яиц. При этом уменьшается толщина и прочность скорлупы, что облегчает вывод молодняка (Буртов Ю.З., Голдин Ю.С., Кривопишин И.П., 1990).
Корнилова В.А. и Алкарев Н.И. (2006) в качестве дезинфицирующих средств рассматривают слабый раствор перманганата калия, температура которого должна быть на 5-7 выше температуры яйца. Озон обладает бактерицидным, вирулицидным и спороцидным действием. С целью дезинфекции инкубационного яйца можно проводить йодирование. Но, по данным авторов наиболее экономичным и экологически чистым способом санации является обработка инкубационных яиц антисептическим средством «бактерицид», а также использование ЭХА-растворов.
Ряд исследователей изучали возможность увеличения- выводимости цыплят при изменении факторов окружающей среды (Лукьянов В., Васильев А., 2000). Буртов Ю.З. Голдин Ю.С., Кривопишин И.П. (1990) доказали, что можно восстановить качество яиц при их обработке газом, обогащенным ССЬ. Более эффективное обогащение яиц углекислым газом достигается при вакуумной обработке газами до и после хранения. Данный способ увеличивает выводимость до 70-75% после 15-ти дней хранения инкубационных яиц.
Предынкубационная химическая обработка яиц (оксигенация, обработка скорлупы серебряной водой) дают положительные результаты относительно выводимости (Фролов И.Ю., 1993). Исследования, проведенные автором, свидетельствуют, что вибрация яиц с одновременным вакуумирова-нием повышает процент выводимости цыплят. Тетерев И. (1992), установил, что прополис стимулируют рост цыплят. По мнению Бессарабова Б.Ф., Мельниковой И.М. (1999) мумие стимулирует формирование иммунитета у птиц. Фролов И.Ю. (1993) установили, что и отвары, целебных трав увеличивают вывод цыплят; снижается уровень пороков яиц.
Патологоанатомические и морфометрические особенности иммунных органов
. Наиболее полной оценка развития организма в онтогенезе может считаться не только в результате исследования особенностей формирования тела, но и на основании сопоставления этих показателей с особенностями развития внутренних органов, исследованию которых у птиц в онтогенезе при нормальных условиях инкубации уделил внимание классик эмбриологии И.И. Шмальгаузен (1984). По мнению автора, нарушение процессов роста эмбриона связано с особенностями развития органов. Если под влиянием различных факторов, рост органов изменяется в значительной степени, то следует ожидать синхронную реакцию.
В качестве базовых критериев развития нами выбраны показатели массы органов, позволяющие при сравнении ее с массой тела, а также с па-тологоанатомическими характеристиками всего организма, судить о закономерностях конформного роста. Об особенностях гомономного роста можно судить на основании сопоставления относительной скорости увели-чения массы органа с периодом их развития. Эти данные позволяют судить о вероятных нарушениях развития и патологических процессах в органах.
Данные по вычислению относительных скоростей увеличения массы отдельных органов и коэффициента роста (к.) дополнят уже полученную нами информацию о степени пропорциональности развития организма на разных стадиях инкубации. По мнению Шмальгаузена И.И. (1984) приближение к пропорциональному росту всего организма возможно при наличии относительно одинаковых констант роста отдельных органов или частей тела эмбриона. Такой рост автор назвал гомономным. Если- константы роста органов различны, то это свидетельствует о гетерономном типе роста, который является разновидностью гомономного. Шмальгаузен И.И. выделяет три типа гетерономного ростового процесса. Первый — автономный, при котором причиной разного роста отдельных частей является самодифференцировка. Если на развивающийся организм влияют раз личные факторы и организм на данное воздействие отвечает через морфологическую дифференцировку, то здесь имеет место автоморфный тип роста. При стимуляции или торможении роста отдельных частей организма под воздействием чужеродного фактора, имеет место гетероморфный тип - третий виду гетерономного роста.
Для определения уровня гомономности роста вычислялась относительная среднесуточная скорость увеличения массы выбранных органов на разных стадиях развития, при помощи, которой в дальнейшем вычислялась константа роста соответствующего органа. Для нормально развивающегося эмбриона коэффициент массы органа на различных стадиях развития должен быть приближённым к трем или к 300%.
Для определения закономерностей конформного роста эмбрионов обоих экспериментальных групп нами вычислялась относительная масса органа на определенной стадии развития по отношению к массе всего тела на соответствующей стадии инкубации.
Перед оценкой морфометрических особенностей иммунных органов КЭ на разных стадиях развития, в норме и» под воздействием аллергена была проведена патологоанатомическая оценка внутренних органов эмбрионов.
При вскрытии эмбрионов в,установленные сроки развития, ни в одной из экспериментальных групп, каких-либо нарушений и отклонений в положении и закладки внутренних органов не обнаружено. Органы имели характерную для них структуру, окраску, топографию. Не отмечено аномалий развития, кровоизлияний и видимых признаков повреждения. После выделения иммунных органов и печени проводилось их взвешивание.
Как известно, печень наравне с желточным мешком КЭ выполняет функцию кроветворения. По сообщению Сулейманова Ф.И., Голубцовой В.А. (2006) данный орган принимает участие в формировании защитных сил организма и реагирует на изменяющиеся условия окружающей среды. В связи с этим важно изучить, как ведет себя печень при однократном введении куриному зародышу на разных стадиях развития аллергена.
Из результатов, приведенных в таблице, следует, что масса печени в контрольной группе эмбрионов на 11, 13, 15-е сутки инкубации выше, чем в опытной группе. Максимальная достоверная разница между показателями приходится на 13-е сутки (0,041±0,01 г), а минимальная и не достоверная - на 11-е сутки (0,017±0,004 г). На 17 и 19-е сутки эмбриогенеза происходит выравнивание значений данного показателя между экспериментальными группами, при этом разница также является недостоверной.
Сравнение относительной массы органа в экспериментальных группах эмбрионов на разных стадиях развития свидетельствует о том, что значения данного показателя после введения антигена на 11, 17 и 19-е сутки эмбриогенеза больше, чем в контроле. Наибольшая достоверная разница приходится на 17-е сутки инкубации (0,12±0,02%). На 13 и 15-е сутки развития в опытной группе показатель отношения массы печени ко всему телу на соответствующие стадии развития меньше такового показателя в контроле. Наибольшая достоверная разница приходится на 13-е сутки инкубации (0,29±0,02%). На 11 и 19-е сутки разница между показателями относительной массы печени минимальна и недостоверна (0,02±0,004%).
Вышеописанное позволяет судить о том, что разнонаправленные изменения относительной массы печени в опытной группе на разных стадиях развития- могут свидетельствовать о нарушениях закономерностей конформных преобразований относительно исследуемого органа.
Результаты экспериментальной работы свидетельствуют, что при однократном введении в желточный мешок амброзийного аллергена куриным зародышам на всех изучаемых стадиях развития происходит уменьшение среднесуточной скорости увеличения массы печени по сравнению с контролем (табл. 6). Наибольшая достоверная разница между показателями отмечена на 11-е сутки развития (34,47±1,15%). Разница в 0,44±0,03% приходится на 19-е сутки и является недостоверной.
Эти данные свидетельствуют о том, что модельный фактор оказывает угнетающее действие на морфометрические показатели печени, особенно четко это проявляется на 11, 13 и 15-е сутки эмбриогенеза.
С использованием относительной скорости увеличения массы печени эмбрионов экспериментальных групп и времени, с момента закладки органа, вычислялся коэффициент массы — показатель пропорционального рос 77 та, свидетельствующий о гомономности. Гомономный тип развития организма свойственен КЭ на ранних стадиях развития (Шмальгаузен И.И., 1984).
Из результатов, представленных в таблице 6, следует, что коэффициент массы печени в контроле на всех стадиях эмбриогенеза приближен к 300%, что свидетельствует о пропорциональном росте органа.
В опытной группе эмбрионов на 11, 13, 15-е сутки коэффициент массы органа достоверно меньше такового в контроле. Это свидетельствует о непропорциональном росте печени, что вероятно связано с введением эмбрионам аллергена. Максимальная разница между показателями коэффициента массы органа приходится на 13-е сутки инкубации (369,15±2,04%).
Несмотря на то, что на 17 и 19-е сутки коэффициент массы печени эмбрионов опытной группы достоверно меньше, чем в контроле на 25,73±1,14 и 6,54±0,84% соответственно, развитие органа является пропорциональным. Это связано с тем, что изучаемый показатель соответствует допустимой константе.
Цитохимические показатели крови развивающихся эмбрионов
Длятого чтобы подробно изучить особенности реагирования организма КЭ на введение амброзийного аллергена, не достаточно рассмотреть какие изменения происходят на тканевом; органном и организменном уровнях. Выявление особенностей и динамики клеточного метаболизма при помощи цитохимического метода позволит дать всестороннюю и углубленную оценку степени нарушения и установления патогенетических особенностей реакции организма в ответ на введение аллергена. Данный метод позволяет изучить химический состав структурных элементов клеток и тканей и его изменение в нормальных и патологических условиях.
Использование цитохимического метода позволяет находить связь между ферментативным статусом,отдельных клеток с метаболизмом внутренних органов. С помощью этих методов выявляются нарушения в клетках крови при разных патологических состояниях посредством определения активности ферментов. Цитохимический метод позволяет судить как о течении физиологических процессов, так и о механизмах развития патологических реакций организма на клеточном и тканевом уровне (Голубева Н.Н., Константинова Н.Н., Комисарова И.А., 1978).
При различных патологических состояниях организма важно изучение внутриклеточных изменений нейтрофилов как высокоспециализированных клеток крови. Благодаря цитохимическому анализу в биологии и медицине накопилось много информации, которая свидетельствует о различных изменениях метаболизма нейтрофильных гранулоцитах при различных заболеваниях. Установлена зависимость от гранул нейтрофила функциональной активности клетки и всего организма (Пальцын А.А., 1988).
Нейтрофильные гранулоциты включают в свой состав различные ферменты, которые принимают участие в формировании ответной реакции организма на внедрение разного рода антигенов (Babiol В., 1992). В ходе экспериментальной работы нами исследовались следующие ферменты: ка-тионные белки (КБ), миелопероксидаза (МПО (К.Ф. 1.11.1.7)) кислая (КФ (К.Ф.3.1.3.2)) и щелочная фосфатазы (ЩФ (К.Ф.3.1.3.1)) и сукцинатдегид-рогеназа (СДГ (К.Ф. 1.3.99.1)). Катионные белки локализуются в лизосомах нейтрофилов и принимают участие в фагоцитарной функции клеток. Фер-мент обладает высокой микробной активностью, низкой токсичностью, и антигенностью, свойствами медиатора воспаления, фактора проницаемости, стимулятора фагоцитоза, модификатора дыхательных и ферментатив 137 ных процессов (Пигаревский В.Е., 1983). Также КБ вызывают дегрануля цию тучных клеток (Нагоев Б.С., 1986).
Миелопероксидаза, концентрируется в специфической зернистости цитоплазмы нейтрофильных гранулоцитов. Как и катионные белки, МПО совместно с перекисью водорода и ионами галогенов образует мощную антибактериальную систему организма, способную к деградации антител (Бакуев М.М., Саидов М.З., Бутаков А.А., 1991). Фермент принимает участие в расщепление перекиси водорода в клетках и разрушает токсическую перекись водорода, катализирует реакцию хлорирования чужеродных белков сконцентрированных в фагосомах.
Кислая фосфатаза локализуется в азурофильных гранулах нейтрофи-лов и является основным маркером лизосом. Необходимо заметить, что концентрация фермента находится в прямой зависимости от возраста клетки. Кислая фосфатаза принимает участие в фагоцитозе, пиноцитозе, а так- же лизисе тканевых компонентов. По данным Агеева А.К. (1969) в клетках при воспалительной реакции отмечается увеличение активности КФ.
Щелочная фосфатаза обнаруживается в специфических гранулах ней-трофилов. Наиболее высокая активность фермента в крови регистрируется у новорожденных. С развитием процессов воспаления, при интоксикации, повреждениях тканей и шоке наблюдается увеличение количества ЩФ в лейкоцитах, что, по мнению Комисаровой И.А., Зивенко А.И., Петросяна Р.Э. (1971), связано с реакцией стресса.
Сукцинатдегидрогеназа (СДГ) принимает участие в формировании защитных сил организма, является кислород зависимым ферментом. В отличие от вышеперечисленных ферментов активность СДГ не обнаружена в нейтрофильных гранулоцитах. Однако отмечена реакция средней активности в цитоплазме лимфоцитов. Фермент осуществляет перенос электронов по средствам митохондрий клеток. Эта особенность позволяет отнести СДГ к маркерам митохондрий (Клиническая цитохимия, 2005).
Необходимо отметить, что как в контрольной, так и в опытной группе эмбрионов в нейтрофилах не обнаружено фермента миелопероксидазы. Вероятнее всего это связано с тем, что зародышу в эмбриональный период развития поступает недостаточное количество кислорода.
Количество катионных белков в нейтрофилах эмбрионов контрольной группы с 11-х суток постепенно увеличивается и на 19-е достигает своего максимума - 1,15±0,024. Классификация нейтрофилов по степени интенсивности реакции отображена на рисунке 51.
Средний цитохимический показатель, отражающий количество кати онных белков, в опытной группе на всех изучаемых стадиях меньше, чем в контроле. При этом максимальная разница между показателями приходится на 17-е сутки (0,28±0,05). Наименьшая разница между показателями СЦП экспериментальных групп приходится на 13-е сутки и составляет 0,005±0,001. На 11, 15 и 17-е сутки развития разница между показателями СЦП экспериментальных групп является в разной степени достоверной.
Средний цитохимический показатель, отражающий количество щелочной фосфатазы в контрольной группе также как и количество КБ постепенно увеличивается в ходе эмбрионального развития. Необходимо отметить, что на всех стадиях эмбрионального развития в контроле количество щелочной фосфатазы превышает количество остальных изучаемых нами ферментов. Классификация нейтрофилов, при подсчете количества ЩФ по степени интенсивности реакции, отображена на рисунке 52.
При изучении количества ЩФ в опытной группе эмбрионов следует, что СЦП на всех изучаемых стадиях эмбриогенеза с разной степенью достоверности выше, чем на соответствующие стадии в контрольной группе. Наименьшая разница приходится на 15-е сутки, а наибольшая - на 17-е сутки и составляет соответственно 0,05±0,01 и 0,15±0,02. Необходимо отметить, что достоверной разница является на 11 и 17-е сутки.
В опытной группе эмбрионов СЦП, отражающий количество кислой фосфатазы, в сравнении с контролем, на 13-е сутки достоверно меньше на 0,03±0,01. Максимальная разница приходится на 15-е сутки (0,2±0,04). Классификация нейтрофилов, при подсчете количества КФ по степени интенсивности реакции, отображена на рисунке 53.
