Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Особенности кариотипа супружеских пар в бесплодном браке (обзор литературы) 13 стр.
1. Особенности кариотипа у супружеских нар с нарушением репродуктивной функции 14 стр.
2. Особенности кариотипа у супружеских пар программы ЭКО и ЭИКСИ 22стр,
3. Особенности сперматогенеза у мужчин при различных его состояниях 27 стр.
3.1. Частота анеуплоидии в сперматозоидах у мужчин при нормозооспермии 31 стр.
3.2. Частота анеуплоидии в сперматозоидах у мужчин с олигоастено,- тератозооспермиией 35 стр.
3.3. Корреляция между кариотипом в лимфоцитах крови и частотой анеуплоидии в сперматозоидах у мужчин программы ЭКО и ПЭ, ИКСИ 40 стр.
ГЛАВА II. Материал и методы исследования 45 стр.
1. Характеристика обследованных супружеских пар 45 стр,
2. Характеристика сперматогенеза у мужчин программы ЭКО и ПЭ, ИКСИ 48 стр.
3. Методы исследования 49 стр.
ГЛАВА III. Медико - генетическое обследование супружеских пар программы ЭКО и ПЭ, ИКСИ 57 стр.
1. Результаты генетического обследования супружеских пар программы ЭКО и ПЭ, ИКСИ 57 стр.
2. Анализ частоты анеуплоидии гоносом в сперматозоидах у мужчин программы ЭКО и ПЭ, ИКСИ 72 стр.
3. Изучение корреляции между кариотипом, частотой анеуплоидии гоносом в сперматозоидах и состоянием сперматогенеза 83 стр.
4. Разработка подходов к формированию группы риска среди супружеских пар программы ЭКОиПЭ, ИКСИ 88 стр.
ГЛАВА IV. Обсуждение полученных результатов 93 стр.
Выводы 109 стр.
Практические рекомендации 111 стр.
Список использованных источников 113 стр.
- Особенности кариотипа у супружеских пар программы ЭКО и ЭИКСИ
- Корреляция между кариотипом в лимфоцитах крови и частотой анеуплоидии в сперматозоидах у мужчин программы ЭКО и ПЭ, ИКСИ
- Характеристика сперматогенеза у мужчин программы ЭКО и ПЭ, ИКСИ
- Изучение корреляции между кариотипом, частотой анеуплоидии гоносом в сперматозоидах и состоянием сперматогенеза
Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ РАБОТЫ
Более двадцати лет назад было положено начало успешному лечению женского бесплодия с помощью прогрессивного метода экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов (метод ЭКО и ПЭ) женщине. Благодаря расширению методов ЭКО и ПЭ, применению
интраплазматической инъекции одного сперматозоида в ооплазму яйцеклетки (ИКСИ), в настоящее время удается преодолевать ранее неизлечимые тяжелые формы мужского бесплодия.
Преодоление бесплодия с помощью методов вспомогательных
репродуктивных технологий (ВРТ) высветило важную проблему — получение
здорового потомства. Возникновение патологических состояний
репродуктивной системы часто обусловлены хромосомными аномалиями, генными мутациями и наличием наследственной предрасположенности к заболеванию. По данным Loan ct al. (1987) и Ворсановой с соавт. (1995) каждая 8 супружеская пара с нарушением репродуктивной функции нуждается в проведении цитогенетического исследования лимфоцитов крови. Jacobs et al. (1974) и Thompson et al. (1991) обнаружили среди супружеских пар с бесплодием повышенную частоту сбалансированных транслокаций в десятки раз по сравнению с популяцией. Однако к настоящему времени не определены частота и характер аберраций кариотипа у супружеских пар с бесплодием, включенных є программу ЭКО и ПЭ, ИКСИ.
Дополнительным риском формирования аномальных гамет при
суперовуляции у супружеских пар, включенных в программу ЭКО и ПЭ, ИКСИ является мощная гормональная терапия, необходимая для стимуляции. В связи с вышесказанным, пациенты программы ЭКО и ПЭ,
ИКСИ нуждаются в медико-генетическом обследовании до применения к ним ВРТ.
Особое место в структуре бесплодия отводится мужскому фактору, который по данным В.И. Кулакова и Б,В, Леонова (2000) составляет 50%. Существует ряд причин, приводящих к бесплодию у мужчин. Одной ич них являются нарушения сперматогенеза, обусловленное хромосомными аберрациями кариотипа (Testart, 1996). Другими причинами, приводящими к бесплодию у мужчин, являются различные физические, химические или биологические факторы, также приводящие к нарушению сперматогенеза; олиго-, астено- или тератозооспермия (О AT), Очевидно, чти помимо развития патозооспермии, причиной бесплодия может служить гормональный дисбаланс, нарушения эвакуации половых клеток, копуляция и др*
В настоящее время нет единого мнения о том, существует ли
корреляция между нарушениями сперматогенеза и изменением набора
хромосом в сперматозоидах. Pang et al. (1999) обнаружили высокую долю
дисомии в сперматозоидах мужчин, включенных в программу ИКСИ по
сравнению с контролем (5.4% и 0.2% соответственно). По данным других
исследователей (Colombcro et al., 1999) частота анеуплоидии в
сперматозоидах у мужчин с нарушением сперматогенеза были 2.7% и 1.8% в контроле соответственно.
В связи с этим, важным является выяснение частоты ошибок в хромосомном наборе сперматозоидов при различных формах нарушений
7 сперматогенеза» а также обнаружение корреляции кариотипа пациента с
формой заболевания и частотой хромосомных аберраций в сперматозоидах.
Кроме того, остается неясным, существует ли корреляция между наличием
нормального и/или аберрантного кариотипа в лимфоцитах крови и
изменением хромосомного набора в половых клетках мужчин с
нормозооспермией и ОАТ (Шаронин, 1998). К настоящему времени в
литературе высказаны противоречивые мнения и имеются немногочисленные
данные по этим вопросам (Blanco, 2000; Colls, 1997; Estop, 2000; Morel,
2001), поэтому продолжение исследований в этом направлении необходимо.
Изучение корреляции между нарушениями хромосом в соматических и половых клетках расширяют представления о механизмах генетического контроля этого процесса. Изучение характера хромосомных аномалий в половых клетках необходимо для понимания механизмов их происхождения и наследования. Это стало более актуальным с момента использования репродуктивных технологий, поскольку к последним прибегают супружеские пары в возрасте за 35 лет, когда возрастает риск рождения ребенка с хромосомными аберрациями (Прокофьева- Бельговская, 1986).
Происходящие в мейозе процессы давно волнуют исследователей в области биологии и медицины. Исследования половых клеток до середины 70-х годов проводили с использованием светового микроскопа. В 80-90 годах была усовершенствована техника приготовления тотальных препаратов мейотических хромосом из яичек (материал биопсий). С 1978 г
49 олиґоастенозооспермия, астенотератозооспермия, олиготератозооспермия,
олигоастенотератозооспермия.
73 мужчинам было проведено специальное исследование частоты анеуплоидии по половым хромосомам в сперматозоидах с помощью молекулярно - цитогснетического FISH метода. Из них 25 мужчин принадлежали к 1-ой группе супружеских пар, включенных в программу ЭКО и ПЭ; 48 мужчин принадлежали ко 2 - ой группе супружеских пар, включенных в программу ИКСИ.
3. Методы исследования
Цитогенетический метод
Данный раздел исследования осуществлен при помощи сотрудников лаборатории клинической генетики НЦ АГ и П РАМН, которым автор выражает признательность.
Цитогенетическое исследование проводили обоим супругам, включенным в программу ЭКО и ПЭ, ИКСИ. Цитогенетическое исследование было проведено на препаратах метафазных хромосом, которые получали из лимфоцитов периферической крови, культивируемых в условиях in vitro, в соответствии со стандартной процедурой (Hungerford,
1965).
Результаты цитогенетического и молекулярно-цитогенетического исследования приведены согласно Международной системе номенклатуры цитогенетики человека (1SCN, 1995).
50 Забор материала для цитогенетического анализа осуществляли путем
пункции локтевой вены одноразовыми шприцами, обработанными гепарином
в концентрации 100 ед/мл.
Цельную кровь в количестве 0,5 мл культивировали в одноразовых
шприцах или пенициллиновых флаконах в культуральной среде
следующего состава:
0,02 мл (20 мкг) ФГА ("Difco Р", USA);
5,5 мл питательной среды 199 (ИПВЭ РАМН, Россия);
1,0 мл цельной сыворотки крупного рогатого скота ("Диа - М", Россия). Культивирование проводили при температуре +37С в течение 72 часов. Для накопления лимфоцитов в стадии метафазы за 1,5 часа до окончания культивирования вводили колхицин (40 мкг/мл) в конечной концентрации 0,5 мкг/мл. По окончании культивирования клетки с питательной средой переносили в центрифужные пробирки и осаждали центрифугированием в течение 5-ти минут при 1000-1500 об/мин. Полученный осадок подвергали гипотонической обработке в 8 мл 0,075 М раствора хлорида калия до 20 минут при +37С. Затем клетки фиксировали в трех сменах смеси метанол-уксусная кислота в соотношении 3:1, приготовленной ex tempore, по 20 минут в каждой смене. После окончательного центрифугирования в течение 5-ти минут при 1000-1500 об/мин и удаления супернатанта, суспензию клеток раскапывали на охлажденные влажные стекла и высушивали на воздухе.
51 G-окраску хромосом проводили по общепринятому методу Seabright
(1971) в модификации Захарова и др. (1982). Препараты хромосом
помещали в 0,25% раствор трипсина на 10 - 30 секунд при комнатной
температуре, затем трижды промывали в этиловом спирте в концентрации
70, 96, 100 с экспозицией не менее 30 секунд в каждом растворе.
Препараты высушивали на воздухе при комнатной температуре. Для
окрашивания препаратов использовали 5% раствор красителя Гимза,
приготовленного на фосфатном буфере (рН 6,8). Процедура окрашивания
длилась 4- 5 минут. Затем препараты промывали дистиллированной водой и
высушивали на воздухе при комнатной температуре.
Для С-окрашивания хромосом использовали метод Sumner (1972), в модификации, разработанной Ворсановой и Демидовой (1989). Препараты хромосом обрабатывали насыщенным раствором гидрата окиси бария в течение 20 минут при комнатной температуре, ополаскивали под проточной водой и инкубировали 1,5 часа в растворе 1 OxSSC при температуре +65С. Затем препараты дважды промывали в 70 и 96 этиловом спирте, при экспозиции не менее 30 секунд в каждом, и высушивали на воздухе. Окраску препаратов производили красителем Райта, приготовленном на фосфатном буфере (рН 6,8), в течение 7 минут.
Микроскопический анализ метафазных пластинок проводили при увеличении 100X10 с использованием микроскопа Axioplan 2 фирмы Zeiss.
52 Отбор метафазных пластинок и анализ хромосом осуществляли
согласно общепринятым критериям (Кулешов, 1991).
Цитогенетический анализ проводили на препаратах хромосом, дифференциально окрашенных по длине G- и С-методами, как описано выше. В каждом случае анализировали не менее 11 метафазных пластинок.
При обнаружении количественных и структурных аберраций хромосом в одном из кариотипов, а также хромосомных вариантов, число анализируемых клеток увеличивали до 29 и далее по принятой схеме (Кулешов, 1991). Хромосомным вариантом в наших исследованиях мы считали наличие в одной из хромосом 1, 9, 16 и Y увеличения размеров гетерохроматинового блока, оцениваемого в 5 баллов и выше, присутствие гетерохроматинового блока в коротком плече хромосомы 9, а также увеличение спутников хромосом групп D и G (13, 14, 15, 21, 22 хромосом). Оценку величины блока С-гетерохроматина проводили полуколичественным методом (Прокофьева-Бельговская, 1986). В качестве группы сравнения использовали данные общепопуляционного исследования, полученные Прокофьевой-Бельговской А.А. (1986).
Исследование эякулята. Спермиологический анализ.
Перед взятием эякулята у обследуемых определяли режим половой жизни. Спермиологический анализ эякулята выполнялся дважды для большинства пациентов по методу, рекомендованному ВОЗ (WHO, 1999).
53 При анализе оценивали количество эякулята, его цвет, консистенцию,
рН, количество сперматозоидов в 1 мл и их общее количество в эякуляте,
характер их подвижности, наличие незрелых половых клеток,
патологические формы сперматозоидов.
По результатам спермиологического анализа пациентов относили к одной из шести групп по рекомендации ВОЗ (WHO, 1999). Согласно последним, образец эякулята считается нормальным (нормозооспермия), если он соответствует следующим критериям оценки: объем эякулята- 2,0 мл и более; рН 7,2-7,8; концентрация сперматозоидов- 20 млн и более в 1 мл эякулята; общее количество сперматозоидов- 40 млн и более; подвижность- 25% и более с поступательным движением в течение 1 часа после взятия пробы; наличие не менее 30% сперматозоидов с нормальной морфологией; лейкоциты - менее 1 млн/мл.
По номенклатуре ВОЗ при олигозооспермии снижен показатель концентрации сперматозоидов в 1 мл - он не достигает 20 млн/мл; при азооспермии отсутствуют сперматозоиды в эякуляте; при аспермии - нет эякулята; астенозооспермия характеризуется снижением подвижности сперматозоидов: менее 25% сперматозоидов проявляют поступательное движение. При тератозооспермии менее 30% сперматозоидов имеют нормальную морфологию (WHO, 1999).
54 FISH исследование ядер сперматозоидов.
Для молекулярно-цитогенетических исследований препараты
клеток эякулята готовили по методу, предложенному в 1994 г. Guttcnbach,
Эякулят инкубировали 30 минут при температуре +37С, растворяли в
фосфатном буфере PBS и центрифугировали в течение 8 минут при
2000 об/мин. Осадок ресуспендировали в фиксаторе метанол/ледяная
уксусная кислота (3:1) и фиксировали при -20С не менее 1 часа. После
смены фиксатора суспензию раскапывали на предметные стекла и
высушивали на воздухе. Препараты хранили при комнатной температуре.
Для гибридизации in situ использовали препараты, хранившиеся не более
3-х месяцев.
Денатурацию препаратов эякулята проводили в 2 - 2,5М растворе NaOH, 2xSSC при комнатной температуре в течение 2-5 минут, с последующей дегидратацией в серии восходящих спиртов 70, 8GQ, 96 по 5 минут в каждом.
Для флуоресцентной гибридизации in situ использовали зонды фирмы Vysis (каталожный номер 30-161050). Данный набор включает в себя ДНК зонды, Dapi II (противовыцветающий реагент) и набор реагентов для постгибридизационного отмывания препаратов. ДІЖ - пробы предназначены для идентификации альфа сателлитной последовательности центромерного региона X хромосомы (ХрП Л-qll.l) и сателлита III Y хромосомы (Yql2). ДНК- зонды, входящие в набор, предварительно денатурированы и прямо
55 меченные флуоресцентными красителями: ДНК зонд X хромосомы -
SpectrumOrange , a Y хромосомы- SpectrumGreenIM.
Гибридизацию in situ проводили в соответствии с протоколом,
рекомендуемым фирмой — производителем. Гибридизации in situ состояла
из следующих этапов:
- денатурация ДНК образцов (культуры лимфоцитов и сперматозоидов),
которую проводили в 70% формамиде, 2xSSC при 73С в течение 5 мин, с
последующим проведением исследуемых препаратов в трех сменах спиртов
70, 90 и 96 по I минуте в каждом;
гибридизация; к высушенному на воздухе исследуемому образцу добавляли ДНК зонд, помещали на термоплату при 75С на 5 мин. Затем препараты переносили во влажную камеру и инкубировали 2-4 часа при температуре 42С;
постгибридизационное отмывание препарата проводили в 0.4Х SSC (рН 7.0-7.5) при 73С 1 минуту, последующую отмывку проводили в растворе 2Х SSC/0.1% NP-40 при комнатной температуре от 5 до 50 секунд.
Перед идентификацией хромосом на препарат наносили противовыцветающий реагент Dapi II.
Микроскопический анализ проводили при увеличении 100x10 с использованием флуоресцентного микроскопа Axioplan 2 фирмы Zeiss, оборудованного соответствующим набором фильтров фирмы Vysis и
системой автоматического анализа изображения ISIS, разработанной фирмой
Metasystems.
Количество проанализированных ядер сперматозоидов зависело от концентрации сперматозоидов в 1 мл эякуляте.
У пациентов с выраженной олигозооспермией были
проанализированы все доступные для анализа сперматозоиды, у мужчин с кормозооспермией было проанализировано не меньше тысячи сперматозоидов.
Статистическая обработка полученных результатов. Автор выражает благодарность д.м.н,, профессору А.Н. Чеботареву (ГУ МГТЩ РАМН) за помощь в обработке эксперементальных результатов и предоставления разработанных им с соавт. собственных математических формул нормализации данных (Sokova, Chebotarev, 1992). Статистическую обработку результатов проводили по t- критерию в компьютерной
п
программе STATISTICA, а также по % в компьютерной программе STATGRAF. Достоверные различия считали при значениях, с вероятностью р<0.05.
Особенности кариотипа у супружеских пар программы ЭКО и ЭИКСИ
Для молекулярно-цитогенетических исследований препараты клеток эякулята готовили по методу, предложенному в 1994 г. Guttcnbach, Эякулят инкубировали 30 минут при температуре +37С, растворяли в фосфатном буфере PBS и центрифугировали в течение 8 минут при 2000 об/мин. Осадок ресуспендировали в фиксаторе метанол/ледяная уксусная кислота (3:1) и фиксировали при -20С не менее 1 часа. После смены фиксатора суспензию раскапывали на предметные стекла и высушивали на воздухе. Препараты хранили при комнатной температуре. Для гибридизации in situ использовали препараты, хранившиеся не более 3-х месяцев. Денатурацию препаратов эякулята проводили в 2 - 2,5М растворе NaOH, 2xSSC при комнатной температуре в течение 2-5 минут, с последующей дегидратацией в серии восходящих спиртов 70, 8GQ, 96 по 5 минут в каждом. Для флуоресцентной гибридизации in situ использовали зонды фирмы Vysis (каталожный номер 30-161050). Данный набор включает в себя ДНК зонды, Dapi II (противовыцветающий реагент) и набор реагентов для постгибридизационного отмывания препаратов. ДІЖ - пробы предназначены для идентификации альфа сателлитной последовательности центромерного региона X хромосомы (ХрП Л-qll.l) и сателлита III Y хромосомы (Yql2). ДНК- зонды, входящие в набор, предварительно денатурированы и прямо меченные флуоресцентными красителями: ДНК зонд X хромосомы SpectrumOrange , a Y хромосомы- SpectrumGreenIM. Гибридизацию in situ проводили в соответствии с протоколом, рекомендуемым фирмой — производителем. Гибридизации in situ состояла из следующих этапов: - денатурация ДНК образцов (культуры лимфоцитов и сперматозоидов), которую проводили в 70% формамиде, 2xSSC при 73С в течение 5 мин, с последующим проведением исследуемых препаратов в трех сменах спиртов 70, 90 и 96 по I минуте в каждом; - гибридизация; к высушенному на воздухе исследуемому образцу добавляли ДНК зонд, помещали на термоплату при 75С на 5 мин. Затем препараты переносили во влажную камеру и инкубировали 2-4 часа при температуре 42С; - постгибридизационное отмывание препарата проводили в 0.4Х SSC (рН 7.0-7.5) при 73С 1 минуту, последующую отмывку проводили в растворе 2Х SSC/0.1% NP-40 при комнатной температуре от 5 до 50 секунд. Перед идентификацией хромосом на препарат наносили противовыцветающий реагент Dapi II. Микроскопический анализ проводили при увеличении 100x10 с использованием флуоресцентного микроскопа Axioplan 2 фирмы Zeiss, оборудованного соответствующим набором фильтров фирмы Vysis и системой автоматического анализа изображения ISIS, разработанной фирмой Metasystems. Количество проанализированных ядер сперматозоидов зависело от концентрации сперматозоидов в 1 мл эякуляте. У пациентов с выраженной олигозооспермией были проанализированы все доступные для анализа сперматозоиды, у мужчин с кормозооспермией было проанализировано не меньше тысячи сперматозоидов. Статистическая обработка полученных результатов. Автор выражает благодарность д.м.н,, профессору А.Н. Чеботареву (ГУ МГТЩ РАМН) за помощь в обработке эксперементальных результатов и предоставления разработанных им с соавт. собственных математических формул нормализации данных (Sokova, Chebotarev, 1992). Статистическую обработку результатов проводили по t- критерию в компьютерной п программе STATISTICA, а также по % в компьютерной программе STATGRAF. Достоверные различия считали при значениях, с вероятностью р 0.05. Все 200 супружеские пары, т.е. 400 человек, страдающих бесплодием и включенных в программу ЭКО и ПЭ, ИКСИ были обследованы в отделении клинической эмбриологии НЦ АГ и П РАМН, Все собранные сведения о семье в целом, паспортные данные, сведения о репродуктивной функции пациентов, а также результаты специальных методов исследования были внесены в специально разработанную карту. Супружеские пары были разделены на 2 группы. Первую группу составили 100 супружеских пар, с бесплодием I или бесплодием II у мужчин, показатели спермограммы которых были в пределах нормы или на границе нормы {нормальная морфология сперматозоидов - 30%, активно подвижных сперматозоидов - 25%, концентрация сперматозоидов 20 млн в 1 мл). Этим супружеским парам было проведено классическое ЭКО и ПЭ. Вторую группу составили также 100 супружеских пар, с бесплодием I или бесплодием II у мужчин, показатели спермограммы которых были ниже границы нормы и они нуждались в проведении процедуры ИКСИ, Возраст супружеских пар представлен с учетом возраста женщин в связи с тем, что у женщин 35 лет и старше повышается риск рождения ребенка с хромосомной патологией (табл. 3). У 49% женщин программы ЭКО и ПЭ возраст был старше 35 лет, в программе ИКСИ этот показатель составил-48 %.
Корреляция между кариотипом в лимфоцитах крови и частотой анеуплоидии в сперматозоидах у мужчин программы ЭКО и ПЭ, ИКСИ
Одной из причин мужского бесплодия являются нарушения сперматогенеза в виде олиго-, астено-, тератозооспермии, которые могут встречаться по отдельности или в сочетанной форме олигоастенотератозооспермии (ОАТ). В связи с этим у всех мужчин программы ЭКО и ПЭ5 ИКСИ было проведено исследование эякулята (табл. 12). FISH исследование сперматозоидов было проведено 73 пациентам из первой и второй групп. Всего из первой группы было обследовано 25 мужчин: 15 пациентов, показатели спермограммы которых находились в пределах нормы; 10 - показатели спермограммы которых находились на границе нормы (нормальная морфология сперматозоидов - 30%, активно подвижных сперматозоидов - 25%, концентрация сперматозоидов в 1 мл - 20 млн). Возраст пациентов был от 24 до 63 лет. 9 пациентов из 73 (12%) имели хромосомные аберрации в кариотипе, которые были представлены: в 3- х наблюдениях - нарушениями в комплексе половых хромосом; в 2-х наблюдениях - хромосомными транслокациями; в 4-х наблюдениях перицентрическими инверсиями хромосом. 15 пациентов имели нормальные показатели в спермограмме. У 10 пациентов показатели спермограммы находились на границе нормы (по морфологии, концентрации, подвижности). У остальных 48 наблюдались различные отклонения в показателях спермограммы (по морфологии, концентрации, подвижности). Всем пациентам было проведено молскулярно-цитогенетическое исследование сперматозоидов с использованием зондов на хромосомы X и Y. Гибридизацию in situ проводили в соответствии с протоколом, рекомендуемым фирмой- производителем, У пациентов с отклонениями в спермограмме были проанализированы все доступные для анализа сперматозоиды, у мужчин с нормозооспермией было проанализировано не меньше тысячи сперматозоидов. Всего было проанализировано 47983 ядра сперматозоидов (рис. 5). Все обследуемые пациенты были подразделены на 5 групп. Первую группу составили 15 человек, включенных в программу ЭКО и ПЭ и имеющих нормальные показатели спермограммы. Возраст пациентов данной группы был от 28 до 48 лет (средний возраст 36.5 лет). У 13 мужчин кариотип был 46, XY, У 2 пациентов этой группы были выявлены хромосомные аберрации. В одном случае у мужчины кариотип был представлен полисомией хромосомы Y (47,XYY), в другом -перицентрической инверсией хромосомы 2 (46, XY, inv (2)(pl2ql4)). Средняя частота анеуплоидии в сперматозоидах по хромосомам X и у мужчин с нормальным кар но типом этой группы составил 0.21%. Группа этих пациентов оценивалась в качестве группы сравнения. У пациента с полисомией хромосомы Y в кариотипе, уровень анеуплоидии по хромосомам X и Y в сперматозоидах составил 2,6%, у мужчины с инверсией хромосомы в кариотипе - 0.7% анеуплоидии по хромосомам ХиУ. (табл. 13). а) Больной С-н; 38 Рисунок 5, FISH исследование сперматозоидов мужчин программы ЭКО и ИЗ, ИКСИ. Увеличение 10х 100. Красное свечение -- X хромосома, зеленое -Y хромосома. Вторую группу составили 10 мужчин, также включенных в программу ЭКО и ПЭ и имеющих показатели спермограммы, которые находились на границе нормы (по морфологии, подвижности, концентрации). Возраст пациентов группы был от 25 до 49 лет (средний возраст 38.5 лет). Нормальный кариотип был выявлен у 9 мужчин. У одного пациентов этой группы были выявлены хромосомные изменения - 46,XY ish Хр 11.1-qll.l(DXZIxl)ish.Yql2(DYZlxl)[470]/46,XX.ish Xpll.l-ql l.l(DXZlx2) [30]. Средняя доля анеуплоидии в сперматозоидах по хромосомам X и Yу мужчин этой группы с нормальным кариотипом составила 0.5%. У пациента с кариотипом 46,XY.ishXp 11.1 -q 11.1 (DXZ lxl), І5ИТя12(ОУ21х1)[470]/46ДХ.І5пХр11.1 11.1(ОХ21х2)[30], доля анеуплоидии по хромосомам X и Y в сперматозоидах составила 3.7%. (табл.13). У мужчин с нормальным кариотипом и пограничными показателями в спермограмме было обнаружено достоверное увеличение частоты (Р 0.05) анеуплоидии гоносом в сперматозоидах по сравнению с мужчинами 1-ой группы с нормальным кариотипом.
Характеристика сперматогенеза у мужчин программы ЭКО и ПЭ, ИКСИ
Поиск новых путей решения проблемы преодоления бесплодия, выяснение причин бесплодия и получение здорового потомства при применении ВРТ является актуальной задачей современной репродуктологии. Причинами нарушения репродуктивной функции могут служить как экзогенные факторы, так и наследственно обусловленная патология, связанная либо с хромосомными аберрациями (как численными, так и структурными), либо с генными мутациями. Изучение характера хромосомных аномалий при нарушении репродуктивной функции приобретает определенное значение ввиду их высокой частоты (Ворсанова и др., 1998; Azim et al., 2003; Stern et al., 1999), Своевременное определение причин нарушения репродуктивной функции, связанное с выявлением численных или структурных нарушений хромосом, приобретает особое значение в изучении репродуктивной системы и является одной из ведущих проблем медицинской генетики. Кроме того, выявление хромосомной патологии у пациентов с нарушениями репродуктивной системы и нуждающихся в лечении методами ВРТ имеет принципиальное значение. Так как, применяя программу ЭКО и ПЭ, ИКСИ к пациентам с бесплодием, у которых имеются хромосомные аберрации, имеется риск передачи ребенку генетической патологи от родителей.
Среди супружеских пар программы ЭКО и ПЭ, ИКСИ, мужской и женский фактор бесплодия примерно составляет 1:1 (Здановский и др., 1996). В связи с этим интересно было выяснить причины женского и мужского бесплодия в супружеских парах программы ЭКО и ПЭ, ИКСИ. Наши исследования показали, что супружеские пары, нуждавшиеся в лечении методами ВРТ, имели поздний репродуктивный возраст, как включенные в программу ЭКО и ПЭ, так и в программу ИКСИ. Сам этот факт уже указывает на то, что эти супружеские пары входят в группу риска пациентов, у которых может родиться ребенок с хромосомной патологией (Прокофьева-Бельговская , 1969). При медико - генетическом консультировании у пациентов программы ЭКО и ПЭ, ИКСИ нами были выявлены следующие врожденные ПР и генетические нарушения: синдром Рокитанского-Кюстера-Хаушера; ВДКН, обусловленная недостаточностью 21 - гидроксилазы (мягкая форма); гетерозиготное носительство мутации гена 21-гидроксилазы; гетерозиготное носительство аутосомно-рецессивного гена, приводящего к синдрому поликистоза почек у детей; синдром Поланда; гипохондроплазия; делеция AZF локуса хромосомы Y; носительство доминантного мутантного гена, приводящего к врожденным порокам развития почек у детей. Причем врожденные ПР и генетические нарушения 3 раза чаще встречались среди супружеских пар программы РЖ СИ. Выявленные врожденные ПР и генетические нарушения у пациентов с бесплодием указывает еще раз на необходимость медико - генетического консультирования пациентов, нуждающихся в лечении методами ВРТ и именно до включения их в программы ЭКО и ПЭ, ИКСИ. Пациенты должны быть информированы по возможности о природе, причине бесплодия, и при наличии у них генетических изменений о риске передачи потомству этих нарушений, так как решение о лечении методами ВРТ принимает супружеская пара. Состояние репродуктивной функции обследуемых пациентов в группе с классическим ЭКО и ПЭ и в группе пациентов, нуждающихся в процедуре ИКСИ было различным. В 1-ой группе пациентов вторичное бесплодие преобладало над первичным, во 2-ой группе диагноз первичное и вторичное бесплодие соотносится 1:1. Уровень хромосомных изменений у пациентов 1-ой и 2-ой групп практически был одинаковым: в 1-ой - 11%, во 2 - ой - 12%. Наши данные о высоком уровне хромосомных аберраций у пациентов программ ЭКО и ПЭ, ИКСИ по сравнению с общспопуляционным совпадают с данными других авторов (Meschede et al., 1998; Schreurs et al., 2000; Stern et al., 1999; Tcstart etal., 1996). У женщин 1-ой группы частота хромосомных аберраций при вторичном бесплодии в 3.5 раза превышала частоту при первичном. Вероятно, это связанно с тем, что основные изменения у женщин были представлены преобладанием хромосомных аберраций в комплексе половых хромосом (у 7 из 9)э причем больший уровень был представлен мозаицизмом. Известно что у женщин с такими хромосомными аберрациями чаще преобладает Б - И. По-видимому, это связано с нарушением нормального процесса дифференцировки яичников, который сопровождается снижением числа примордиальных фолликулов. Этот процесс особенно ярко выражен при классической форме дисгенезии гонад - синдроме Шерешевского Тернера с моносомией по хромосоме X. Поэтому мы рекомендуем женщинам, орі-анизм которых слабо отвечает на гормональную стимуляцию суперовуляции, кроме классического цитогенетического исследования лимфоцитов периферической крови проведение молекулярно цитогенетического анализа этого типа клеток для повышения у них вероятности выявления клона клеток с хромосомными аберрациями. Наши данные о высоком уровне изменений в комплексе половых хромосом у женщин совпадают с данными других авторов, которые отмечают, что аномалии гоносом могут составлять до 2/3 от общего числа случаев хромосомных изменений (Курило и др., 1997; Shirley et аК, 1982), У мужчин 2-ой группы хромосомные аберрации при первичном бесплодии преобладали над вторичным бесплодием в 1.8 раза.
Изучение корреляции между кариотипом, частотой анеуплоидии гоносом в сперматозоидах и состоянием сперматогенеза
У мужчин с нормальным кариотипом и сочетанной формой отклонений в показателях спермограммы по концентрации, подвижности, морфологии - ОАТ был выявлен самый высокий уровень анеуплоидии в сперматозоидах по изучаемым хромосомам - 0.83%. У мужчин с показателями спермограммы на границе нормы - 0.5 0%; с олигоастенозооспермией - 0.49%; с тератозооспермиеи - 0.61%. Полученные данные указывают на то, что при любых отклонениях в показателях спермограммы наблюдается повышенный уровень анеуплоидии гоносом в сперматозоидах, что совпадает с данными других исследователей (Джгаркава, 1991; Савельева, 2002; Шаронин, 1998; Baumgartner et al. 1999; Kruse et al. 1998; Lim et al., 1999; Martin et al., 1999; Morel et al., 2000; Okada et al., 1999). Учитывая статистически достоверное отличие частоты анеуплоидиипо ловых хромосом в сперматозоидах у мужчин с показателями спермограммы на границе нормы и нормальным кариотипом по сравнению с группой сравнения, мы считаем, что эти супружеские пары тоже относятся к группе риска пациентов, у которых в потомстве могут возникать хромосомные аберрации.
Принимая во внимание тот факт, что существует корреляция между хромосомными изменениями - инверсиями хромосом и частотой анеуплоидии гоносом в сперматозоидах в разных группах (частота анеуплоидии в зависимости от особенностей сперматогенеза менялась от 0.7% до 1.2%), и существует корреляция между частотой анеуплоидии половых хромосом и особенностями сперматогенеза, можно заключить, что у пациентов с нарушением сперматогенеза и аберрантным кариотипом на уровень нерасхождения хромосом влияет и хромосомные изменения в кариотипе и нарушения сперматогенеза. У пациентов во всех представленных группах с нормальными и измененными кариотипами соотношение сперматозоидов с хромосомой X к сперматозоидам с хромосомой Y было 1:1. Это же соотношение сохранялось и у мужчин с полисомией хромосомы Y (кариотип 47,XYY). Выявленная в сперматозоидах анеуплоидия была представлена нерасхождением хромосом XY, XX, YY. Соотношение нерасхождения хромосом XY : XX : YY у мужчин программы ЭКО и ПЭ (с нормозооспермией и показателями спермограммы на границе нормы) нормальными кариотипами составило 3.6 : 1.5 : 1, у мужчин программы ИКСИ и нормальными кариотипами 2.7 : 1.7: 1(среднее значение). Высокий уровень нерасхождений хромосом XY говорит о том, что нарушения процесса расхождения хромосом чаще происходят при первом делении мейоза. Только у пациентов с полисомией хромосомы Y соотношение частоты нерасхождения хромосом YY к нерасхождению XX было больше единицы (5: 1: 1.5). Кроме того, выявленный у них высокий уровень сперматозоидов с хромосомами XY может подтверждать теорию о том, что у мужчин с кариотипами 47, XYY в процессе мейоза может образовываться повышенная частота сперматозоидов с хромосомным набором 24, XY и 24, YY. При теоретическом расчете анеуплоидии в сперматозоидах у мужчин с кариотипами 47, XYY уровень нерасхождений хромосом должен быть значительно выше, чем выявляется на практике. Это подтверждает теорию о существовании специальных механизмов, блокирующих развитие клеток с аберрантным кариотипом. При сравнении частоты анеуплоидии гоносом в сперматозоидах мужчин разного возраста и различным состоянием сперматогенеза не было выявлено достоверно статистического различия во всех группах. Все выше сказанное позволило сформулировать показания к проведению молекулярно-цитогенетических исследований половых клеток у лиц мужского пола с бесплодием и включенным в программу ЭКО и ПЭ, ИКСИ: 1) мужчинам из супружеских пар, включенных в программу ЭКО и ПЭ, имеющих хромосомные аберрации в кариотипе; 2) мужчинам из супружеских пар, включенных в программу ЭКО и ПЭ, у которых показатели спермограммы находятся на границе нормы (по морфологии, подвижности и концентрации); 3) мужчинам из супружеских пар, включенных в программу ИКСИ и имеющих нарушения в сперматогенезе (с нормальным и аберрантным кариотипом). Наши исследования показали, что среди пациентов программ ЭКО и ПЭ, ИКСИ хромосомные аберрации кариотипа, встречаются значительно чаще, чем в популяции. У этих пациентов могут формироваться гаметы с неправильным набором хромосом. Кроме того, исследование сперматозоидов пациентов с нарушениями в сперматогенезе на анеуплоидии гоносом с использованием молекулярно- цитогенетического метода выявило у них высокий уровень таковых. Использование таких гамет в программах ЭКО и ПЭ, ИКСИ может привести к рождению детей с генетическими изменениями. Кроме того, наши исследования показали, что в большинстве супружеских пар, включенных в программу ЭКО и ПЭ, ИКСИ, возраст жен был старше 35 лет, что само по себе повышает у них риск рождения ребенка с хромосомными аберрациями. Таким образом, беременности, полученные с помощью ВРТ, требуют большой генетической настороженности.
