Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 8
Основные понятия и физико-химические представления о механизмах изотопного фракционирования 8
Изотопный состав и изотопное отношение 8
Изотопные эффекты и фракционирование изотопов 9
Магнитный изотопный эффект 11
Фракционирование изотопов у автотрофов 12
Фракционирование изотопов у гетеротрофов 26
Объекты и методы исследования 52
Результаты исследования и их обсуждение 59
Изотопное отношение углерода развивающихся зародышей вьюна 67
Сопоставление данных об изотопном содержании углерода в первой и второй сериях измерений тканей вьюнов 70
Летние лягушки второго года жизни (16-месячные) 73
Корреляции изотопного отношения с содержанием углерода и азота в составе тканей. 78
Летние лягушки третьего года жизни (28-месячные лягушки) 79
Корреляции изотопного отношения с содержанием углерода и азота в составе тканей 83
Весенние лягушки четвертого года жизни (36-месячные лягушки) 84
Корреляции изотопного отношения с содержанием углерода и азота в составе тканей. 88
Сопоставление данных, полученных при исследовании разновозрастных лягушек .90
Изотопное отношение углерода в тканях взрослых мышей 94
Изотопное отношение углерода основных фракций тканей взрослых мышей 99
Сопоставление данных об изотопном отношении углерода в основных фракциях тканей мышей 102
Изотопные отношения углерода и азота в тканях мышей в пренатальный период развития 106
Сопоставление данных для тканей эмбрионов мышей разных стадий развития 115
Связь изотопного отношения углерода с относительным содержанием азота и углерода в составе ткани 117
Заключение 119
Сопоставление значений изотопного отношения углерода и азота у исследованных видов 119
Изотопный состав тканей у особей разного пола 119
Изменения изотопного статуса на протяжении жизненного цикла организмов 120
Различия изотопного отношения тканей 121
Выводы 126
Список цитированной литературы 128
- Изотопный состав и изотопное отношение
- Фракционирование изотопов у гетеротрофов
- Сопоставление данных об изотопном содержании углерода в первой и второй сериях измерений тканей вьюнов
- Весенние лягушки четвертого года жизни (36-месячные лягушки)
Введение к работе
Легкий стабильный изотоп углерода в природе представлен в существенно большем количестве, чем тяжелый стабильный изотоп этого элемента. На долю 12С приходится (во вселенском масштабе) 98,9% углерода, на долю 13С - всего 1,10%, что, как хорошо известно, нарушает целочисленность атомного веса углерода (Эмсли, 1993). Еще более контрастно соотношение легкого (14N) и тяжелого (15N) стабильных изотопов азота - 99,63% против 0,37%, соответственно.
В 1939 г. А. Нир и Э. Гульбрансен (Nier, Gulbransen, 1939) разделили в соответствии с изотопным составом углерода компоненты земной поверхности на четыре группы. В одну из этих групп включены главным образом растительные формы, отличающиеся от остальных (магматических и метаморфических пород, карбонатов) выраженной асимметрией в соотношении ста-бильных изотопов углерода Си С в сторону первого. Именно это явление
обогащенность растительных и животных форм легким изотопом углерода
получило название биологического фракционирования изотопов. Существенно уточненные со времени Нира и Гульбрансена представления об изотопных отношениях углерода в локальных (т.е. разной природы и различного географического происхождения) образцах дает схема, представленная на рис. 1. В 1953 г. Г. Крейг (Craig, 1953) убедительно подтвердил факт биологической изотопии.
Рис. 1. Вариации изотопного состава углерода в веществе земной поверхности. Из Галимова, 1981.
ш а -ю -го -зо -чо -so
Соотношение легкого и тяжелого изотопов азота, так же как изотопное отношение углерода, варьирует в достаточно широких пределах в веществах различной природы (рис. 2). Эти вариации предопределены происхождением и превращением веществ, в результате которых и происходит фракционирование изотопов азота.
-30 20 _10 О 10 20 30
И ?» 10 0 10 J0 50
Рис. 2. Вариации изотопного отношения азота (5 N, горизонтальная ось) в веществе земной поверхности
Фундаментальная значимость явления биологического фракционирования наилучшим образом сформулирована А.И. Опариным в предисловии к книге Э.М. Галимова. Он пишет следующее. «Для меня, как биолога, работающего над проблемой происхождения жизни, особый интерес представляет утверждение автора, что высшими критериями для распознания биогенных и абиогенных соединений может служить характер внутримолекулярного распределения изотопов, которое может возникнуть не просто в результате отдельной реакции (даже ферментативной), а в целом их цикле, осуществляемом в фазово-обособленной открытой системе. ... Возникновение такого рода многомолекулярных систем в результате неспецифической самосборки органических макромолекул характеризует собой самую начальную стадию перехода от химической эволюции к ее биологическому этапу.
Таким образом (так Dice как в отношении оптической симметрии), пути возникновения закон оліерн ого внутрилюлекулярного распределения изотопов в органических соединениях нужно искать не на молекулярном уровне, а на уровне фазовообособленных многомолекулярных открытых систем, взаимодействующих с окружающей средой и эволюционирующих на основании примитивного отбора» (Галимов, 1981, с.5).
Со времени написания этих слов достигнуты существенные успехи в понимании механизмов изотопии - в целом, и в биологической изотопии, в частности (Галимов, 1981, 2006; Бучаченко, 2007); накоплен значительный фактический материал об изотопии, как различных живых форм, так и основных их биохимических компонентов; убедительно показана связь изотопии растительных форм со способами фиксации СОг и азота, а также зависимость изотопного состава гетеротрофов от типов питания (Park, Epstein, 1960, 1961; Ehleringer et al., 1986; Peterson, Fry, 1987; Griffiths, 1991; Gannes et al, 1997). Изотопное отношение стабильных форм углерода и азота приобретает все большую популярность как метод определения путей миграции и трофических связей животных организмов.
С накоплением сведений об изотопии автотрофов и гетеротрофов несколько «размылось» четкое и ясное представление о физико-химических механизмах изотопного фракционирования. Стало очевидным, что столь динамическая система как организм, обладающая мощными системами гомео-стаза, привносит свои специфические коррективы в процессы фракционирования. Существенный успех для объяснения фракционирования и, главное, многообещающие перспективы направленных влияний на организменные события, привнесло открытие специфических ядерно-спиновых изотопных эффектов (Бучаченко и др., 1976).
Ядерно-спиновый изотопный эффект обеспечен появлением магнитного момента у молекул, включающих в свой состав стабильные изотопы с нецелочисленным ядерным спином (13С и 15N). Молекулы такого рода обречены взаимодействовать с парамагнитными структурами, в число которых вхо-
дят радикалы. Свободнорадикальные формы достаточно обычны для живой материи. Особую роль имеют свободнорадикальные формы кислорода, порождающие многообразные радикальные формы и губительно сказывающиеся таким образом на структуре и, соответственно, функциях макромолекул в живой системе. Предполагается, что в силу изотопного эффекта (т.е. в силу специфики химических взаимодействий структур, несущих в своем составе стабильные изотопы) и, вероятно, прежде всего, в силу ядерно-спинового изотопного эффекта, молекула, несущая в своем составе стабильный изотоп оказывается «защищенной» от губительного влияния реактивных радикальных форм (Shchepinov, 2007). Соответственно, обогащение организма тяжелыми стабильными изотопами, достигаемая в результате употребления в пищу продуктов, полученных из С4 растений, способно «смягчить», элиминировать многочисленные патологические процессы и даже увеличить продолжительность существования организма (Shchepinov, in press).
Существует еще один аспект проблемы биологического фракционирования изотопов. В результате промышленной деятельности в атмосферу выбрасывается огромное количество углекислого газа, образующегося при сжигании обогащенного легким изотопом углерода топлива - нефти, газа, угля. Соответственно, углекислый газ также обогащен легким изотопом углерода. В результате, в мегаполисах и промышленных районах углекислый газ на 2-8%о обогащен изотопом С (Friedman, Irsa, 1967; Галимов, 1987). Такого рода обогащение атмосферы, очевидно, приводит к смещению изотопного отношения в тканях растений в сторону легкого изотопа. Именно такая тенденция - облегчение материала ростовых колец древесных растений, - отмечена с 40-х до конца 80-х годов прошлого столетия. Начиная с последнего срока, тенденция кардинально поменялась: вплоть до настоящего времени годовые кольца деревьев неуклонно и достаточно быстро обогащаются тяжелым изотопом углерода (Воронин и др., 2003). А.А. Ивлев (2005) связывает смену изотопного облегчения на изотопное утяжеление с непрерывным возрастанием концентрации СОг в атмосфере, увеличению среднегодовой температуры
и, как следствие, к усилению фотодыхания. События такого рода представляются угрожающими, поскольку развиваются по принципу положительной обратной связи: «планетарные лёгкие» изменяют свой функциональный статус, превращаясь в потребителя кислорода и поставщика углекислого газа, что, в свою очередь, усугубляет планетарный парниковый эффект. Остается неизвестным, влияют ли и как изменения изотопного отношения углерода на состояние и репродуктивные способности растений, на потребляющих их ге-теротрофов и, опосредовано, на человека.
Следует отметить, что, вопреки перспективности и, соответственно, значимости явления биологического фракционирования, механизмы сегрегации изотопов на организменном уровне (особенно у гетеротрофов) остаются неизвестными, хотя по этому поводу нет недостатка в предположениях и гипотезах. Более того, сведения об изотопии органов и тканей гетеротрофных организмов, о динамике изотопных отношений на разных этапах жизненного цикла, о роли (если таковая имеется) изотопного отношения для нормального функционирования организмов, - представлены фрагментарно и очевидно недостаточно.
В этой связи, целью данного исследования стало систематическое определение изотопного отношения в различных тканях на различных этапах онтогенеза и при различных состояниях гетеротрофных организмов. В качестве объектов исследования мы выбрали три существенно различающихся по организации вида позвоночных: костистую рыбу Misgurnus fossilis L., бесхвостую амфибию Rana arvalis Nilsson и домовую мышь Mus musculns L.
Изотопный состав и изотопное отношение
Изотопный состав характеризует относительную распространенность изотопов определенного элемента, обычно выраженную в виде изотопного отношения: отношения малораспространенного изотопа к более распространенному. Например: D/H, 13С/12С, 180/1бО и т.д.
Точно так же представляется 51 N. В качестве стандарта для определения 813С принят углерод образца кальцита (карбоната кальция) окаменелости Belemnitella americana формации Пи-Ди (Южная Каролина, США) мелового периода - PDB (Рее-Dee Belennite), в котором отношение концентрации 13С и 12С составляет 11,23-10-5. Собственно стандартный образец PDB давно утрачен, но результаты масс-спектрометрических измерений по традиции пересчитывают по отношению к PDB. Изотопные отношения иных биогенных элементов (Н, О, S) также определяют значениями 8 {3D, 8180, d34S). Эталонными стандартами для SD и S О служит образец воды, соответствующий среднему изотопному составу воды Мирового океана {SMOW); для определе ния д N- азот воздуха, а для 8 S - троилитная сера метеорита Каньон Дьяб-ло (MCD).
Возрастание величины д свидетельствует о повышении доли малораспространенного изотопа, а снижение, - соответственно, о повышении доли распространенного изотопа элемента в образце. Поскольку конфигурация электронных оболочек атомов изотопов одного элемента одинакова, химические свойства изотопов элементов в принципе таюке одинаковы. Однако, поскольку изотопы элемента различаются массой и величиной ядерного спина, скорости химических реакций, в которых они участвуют, так же как свойства соединений, возникающих в результате этих реакций, различаются. Это явление получило название «изотопного эффекта».
Изотопные эффекты предопределяют явление фракционирования изотопов, т.е. увеличение (либо уменьшение) относительного содержания одного из изотопов по координате гравитационного поля в диффузионной ячейке в соответствии с напряженностью электромагнитного поля, при осуществлении химического превращения и т.д. Для понимания явления фракционирования представляется важным следующее замечание Э.М. Галимова: «...при любом типе фракционирования изотопов решающее значение для окончательного распределения изотопов меэюду исходным веществом и продуктом имеет степень превращенности или коэффициент использования исходного вещества. Результирующее разделение изотопов произойдет лишь в том случае, если исходное вещество прореагировало частично. Если исходный реагент полностью перейдет в продукт, то последний приобретет изотопный состав исходного вещества независимо от того, сопровождался соответствующий процесс фращионированием изотопов или нет» (с. 25).
Поскольку всякую живую систему в наиболее общей форме возможно представить как открытую реакционную систему, в которой осуществляется великое множество химических преобразований поступающих веществ, и из которой удаляются некоторые продукты этих реакций, естественно полагать, что биологическое фракционирование предопределено корпускулярно-химическим, химическим и ядерно-химическим изотопными эффектами.
Кинетический изотопный эффект обеспечивается различиями скоростей взаимодействий разных изотопных форм (т.е. аналогичных по элементарному составу и строению, но отличающихся по изотопному составу веществ) и прочностью химических связей, образуемых тяжелыми изотопами (в сравнении с таковой легких изотопов). Иными словами, энергия активации реакций с участием изотопно-тяжелых форм ( ) выше, чем реакций изотопно-легких форм (Е). Отношение констант скоростей реакции с участием изотопно-легкой (к) и изотопно-тяжелой (к ) форм численно определяет кинетический изотопный эффект реакции:
ПГ Е-Е к_ к где: ju uju - приведенные массы молекул, Г- абсолютная температура, R - газовая постоянная. В соответствии с принятыми посылками, отношение к/к больше единицы, «т.е. продукты реакции обогащаются легким изотопом, а в непрореагировавгием остатке накапливается тяэюелый изотоп» (Галимов, 1981, с.15).
Магнитный изотопный эффект. Ядерно-спиновый или магнитный изотопный эффект был открыт срав нительно недавно, в 1976 г. (Бучаченко и др., 1976). Ядерно-спиновый изо топный эффект является следствием различия спинов изотопных ядер. Все биогенные элементы включают изотопы с различающимися, в т.ч., с нецело численными, ядерными спинами. Например, изотопы имеют нуле вой спин, а 170 - спин, равный 5/2. Для стабильных изотопов 13С и 12С харак терны полуцелый и нулевой спин. Из фундаментального закона сохранения угловых моментов следует, что химическое взаимодействие разрешено только для таких спиновых состояний, при которых спин реагентов совпадает со спином продуктов реакции, и запрещены в том случае, если продукт реакции должен изменить спин в сравнении со спином реагентов. Носителями спина являются частицы, для которых характерны различные спиновые мультиплетности (набор спиновых состояний) - радикалы, ион-радикалы, ионы металлов, карбены и т.д.
Спин всегда сопровождается магнитным моментом; и только магнитные взаимодействия могут изменить спин молекулы. Магнитные взаимодействия, будучи ничтожно малы и по энергии сравнимы с энергией химических взаимодействий или тепловыми эффектами реакций способны модифициро-вать реакционную способность, изменяя спины реагентов.
Изотопы, несущие ядерный спин, обладают ядерным магнитным моментом. В соответствии с этим, магнитный изотопный эффект есть зависимость скорости реакции от ядерного спина, его проекции, магнитного момента, энергии электрон-ядерного (сверхтонкого) взаимодействия. Существование сверхтонкого взаимодействия предопределяет селективность по ядерному спину всякой селективной по электронному спину реакции. Иными словами, существование магнитного изотопного эффекта свидетельствует о спин-селективной реакции, т.е. о взаимодействии спин-несущих, парамагнитных молекул.
Если кинетический изотопный эффект, в силу различия масс изотопов, всегда создает кинетическое преимущество для легкого изотопа, то знак магнитного изотопного эффекта предопределяется спиновой мультиплетностью реакции, т.е. направлением спиновой конверсии. «В частности, для радикальных пар с конверсией триплет-синглет и с обратной конверсией синг-лет-триплет знаки магнитного изотопного эффекта противополоэ/сны: изотопное обогащение в первом случае и обеднение — в другом» (Бучаченко, 2007, с.39).
Нужно отметить еще одну особенность магнитного изотопного эффекта: «...для тяжелых ядер (тяжелее водорода) магнитный изотопный эффект на один - два, а иногда на три порядка превышает классический: классический масс-зависящий эффект имеет предел, определяемый отношением масс изотопных ядер...Магнитный изотопный эффект вообще не имеет предела» (Бучаченко, 2007, с. 39).
Фракционирование изотопов у гетеротрофов
Уже в относительно ранних исследованиях (Sackett et al., 1965; Degens, 1969; Smith, Epstein, 1970) был сделан вывод о том, что значения изотопных отношений образцов гетеротрофных организмов, обитающих в морских и пресных водах и на суше, попадают в интервал значений изотопных отношений, характерных для растений, обитающих в этих ареалах.
Значения 8 С образцов тканей травоядных, питающихся СЗ и С4 растениями, соответствует изотопным отношениям, характерным для этих групп растений (Minson et al., 1975; Haines, 1976). Вывод из этих наблюдений был достаточно однозначным: «гетеротрофы мало отличаются или не отличаются по изотопному составу от своего органического источника» (Галимов, 1981, с. 29); или «you are what you eat ... plus a few per mil» (Egger, Jones, 2000).
Существенное влияние на исследование изотопии у гетеротрофов оказала работа М. Дениро и С. Эпштейна (DeNiro, Epstein, 1978). Эти исследователи провели серию измерений изотопного отношения углерода целых организмов тринадцати видов (представляющих пять типов) в сравнении со значениями изотопных отношений диеты, на которой они содержались. Результаты исследования можно резюмировать следующим образом. (1) В большинстве случаев (в 8 из 13) углерод гетеротрофных организмов обогащен 13С в сравнении с углеродом диеты, и лишь в одном (Caenorhabditis) - обеднен. (2) Изотопия различных особей одного вида, содержавшихся на одной и той же диете, варьирует. (3) Представители разных видов, содержавшихся на одинаковой диете, могут иметь сходные изотопные отношения.
В следующей серии измерений Дениро и Этптейн сравнивали изотопию липидной, углеводной фракций и фракции растворимых белков двух видов мух (Calliphora, Musca), содержавшихся на конине и свином мясе. Выяснилось, что изотопия одинаковых фракций, полученных от обоих видов мух, одинакова и повторяет изотопию соответствующих фракций диеты.
Заключение о том, что изотопное отношение у гетеротрофов, если не повторяет, то достаточно близко к изотопному отношению потребляемой ими пищи, послужило основанием для использования изотопного состава тканей для выявления пищевых связей и миграций организмов. По изотопным отношениям азота и углерода в тканях были прослежены пищевые источники многих видов в естественной среде обитания.
Из позвоночных животных исследовали: арктического гольца, форель и тихоокеанского лосося (определение трофических предпочтений и конкуренции; в связи с ростом) (Welch, Parsons, 1993; Jardine et al., 2004; Trueman et al., 2005; Power et al., 2007); бычков, сельдей и шпротов (в связи с миграциями и ростом) (Maruyama et al., 2001; Guelinckx et al., 2006); обитающую в пещерах саламандру Enrycea spelaea (в связи с копрофагией помета летучих мышей) (Fenolio et al., 2006); несколько видов ямкоголовых змей (Pilgrim, 2007; McCue, 2007); многочисленные виды птиц (в связи с миграциями и типом питания) (Hobson, Clark, 1992; Sydeman et al., 1997; Thompson et al., 1999; Romanek et al., 2000; Harding, Stevens, 2001; Forero, Hobson, 2003; Cherel et al., 2005; Norris et al., 2007); усатых и зубатых китов (в связи с миграциями и характером питания) (Ostrom et al., 1993; Abend, Smith, 1995; 1997; Best, Schell, 1996; Hobson, Schell, 1998; Caraveo-Patino, Soto, 2005; Lee et al., 2005; Mitani et al., 2006); несколько видов ластоногих (в связи с характером питания и трофическими отношениями) (Burns et al., 1998; Lessage, 2002; Zhao et al., 2004, 2006); плотоядных млекопитающих (Hilderbrand et al., 1996; Roth, Hobson, 2000; Hobson et al, 2000; Felicetti et al, 2003 a, b); домашних животных (коз, быков, альпаков, лам, лошадей, кроликов, свиней) (Sponheimer et al., 2003 a,b; Nardoto et al., 2006); летучих мышей (в связи с особенностями питания) (Voigt et al, 2003; Voigt, Matt 2004; Voigt, Speakman, 2007; Popa-Lisseanu et al., 2007); шимпанзе (в связи с пищедобывающей стратегией) (Schoeninger et al., 1999).
Представленное выше перечисление отнюдь не исчерпывающе, что свидетельствует о популярности и, вероятно, целесообразности использования определения изотопного отношения для эколого-зоологических исследований (см. статьи: Ehleringer et al., 1986; Peterson, Fry, 1987; Griffiths, 1991; Gennes et al., 1997; Kelly, 2000; Тиунов, 2007). Однако, следует иметь в виду, что реконструкция трофических цепей и, соответственно, выяснение маршрутов миграций организмов на основании данных об изотопном фракционировании остается достаточно слабо обоснованным. Еще Дениро и Эп-штейн (DeNiro, Epstein, 1978) указывали на два обстоятельства, которые могут приводить к ошибочным заключениям о соответствии изотопных отношений диеты и тканей потребляющего ее организма. Это: сезонные вариации изотопного состава растений и возможность выбора пищи травоядными животными, в том числе между СЗ и С4 растениями.
Сходство изотопии структур организмов с изотопией потребляемой пищи позволило весьма продуктивно использовать масс-спектрометрический метод для анализа палеонтологического материала (Fo-linsbee et al., 1970), останков гоминид и людей доисторической эпохи (Schoeninger et al., 1983; Schoeninger, DeNiro, 1984; Walker, DeNiro, 1986; Sealy et al., 1987; Bell et al., 2001). В частности, было показано, что, в соответствии с изотопным составом коллагена костей, в диете неандертальского человека преобладала животная пища (Bocherens et al., 1999; Richards et al., 2000). Изотопия волос тирольского человека ледникового периода свидетельствует о преобладании растительной пищи в его рационе (Macko et al., 1999).
Сопоставление данных об изотопном содержании углерода в первой и второй сериях измерений тканей вьюнов
Сопоставление значений 5 С для самок первой и второй групп показало их сходство в соответствии с критериями сравнения независимых выборок: Колмогорова-Смирнова (р 0,100) и Манна-Уитни (р = 0,109). В то же время парное сравнение (в соответствии с типом тканей) свидетельствует об их различии (критерий знаков, р = 0,041; критерий Вилкоксона, р = 0,028). Однофакторный дисперсионный анализ (при группировке по принадлежности к группам) демонстрирует сходство выборок (F = 3,544 4,965 = Fcm, р = 0,089).
Такое же сопоставление значений 5 С для самцов из первой и второй групп показало: (1) сходство выборок в соответствии с критериями Колмогорова-Смирнова (р 0,100), Манна-Уитни (р = 0,522); (2) однотипность выборок в соответствии с однофакторным дисперсионным анализом (при группировке по принадлежности к сериям исследования) (F - 0,А21 4,965 = Fcm, р = 0,528); (3) различие выборок в соответствии с результатом однофакторного дисперсионного анализа (при группировке данных по типу тканей) (F = 7,425 4,387 = Fcm,p = 0,016), т.е. о нарушении подобия этих выборок в двух сериях. Отличие выборок предопределено существенной разницей у самцов первой и второй групп значений 813С для ткани мозга и кожи (рис. 24). головной мозг -27 х -29- кожал ,\ \ \ -31-\ 5 j roHafla хрусталик г Ч ч Tfмышечная ткань гепатопанкреас Рис. 24. Диаграмма, иллюстрирующая распределение значений 613С в образцах тканей у самцов первой (сплошная линия) и второй (пунктирная линия) групп.
Таким образом, в результате проведенного анализа следует констатировать: (1) безусловное существование различий значений 813С у некоторых тканей, как самцов, так и самок рыб и (2) возможность возникновения различий в величинах 513С для однотипных тканей у рыб разного пола.
В связи с этим заключением следует добавить следующее. Сопоставляя данные, приведенные в таблице 9 и 15, не трудно убедиться в том, что ткани самок рыб ранжируются в соответствии с возрастанием следующим образом: мозг - гонада - мышечная ткань - гепатопанкреас - хрусталик - кожа. Такое же сопоставление для тканей самцов демонстрирует иную последовательность: мозг - гепатопанкреас - мышечная ткань - гонада - хрусталик - кожа. Таким образом, асимметрия распределения значений 513С тканей самцов и самок предопределена именно половой принадлежностью. Вопреки показанной выше недостоверности различий изотопного отношения азота для разных тканей у самок и самцов рыб, для сравнения, ука жем ранжированную (по возрастанию 5 N) последовательность тканей. Для тканей самок она такова: хрусталик - кожа - мышечная ткань - гепатопанкреас - мозг - гонада. Для самцов: кожа - гонада - хрусталик - мышечная ткань - гепатопанкреас - мозг. Из сопоставления ранжированных последовательностей возникает предположение об обратных отношениях значений 5 С и 5 N, что находит подтверждение в отрицательных корреляциях этих величин. Летние лягушки второго года жизни (16-месячные). Результаты измерений 5 С и 5 N и процентное содержание углерода и азота в тканях 16-месячных лягушек представлены в таблице 20. В соответствии с результатом статистического анализа процентное содержание углерода в тканях самок и самцов (рис. 25, А) следует полагать одинаковым (критерий Колмогорова-Смирнова, р 0,100; критерий Манна-Уитни,р = 0,916).
Исключением является костная ткань, содержание углерода в которой значимо меньше, чем в других тканях (табл. 21), что создает асимметрию распределения значений С% по типам тканей (однофакторный дисперсионный анализ, F = 63,323 3,500 = Fcm,p = 0,000002; рис. 26, А).
Согласно результатам статистических сравнений, следует полагать, что процентное содержание углерода в тканях как самок, так и самцов 28-месячных лягушек одинаково (критерий Колмогорова-Смирнова, р 0,100, критерий Манна-Уитни, р — 0,093; рис. 28,А). Исключением является костная ткань, относительное содержание углерода в которой существенно ниже, чем в остальных тканях, что и предопределяет асимметрию распределения значений С% по типам тканей .
Весенние лягушки четвертого года жизни (36-месячные лягушки)
Диаграмма, иллюстрирующая распределение процентного содержания углерода по тканям, представлена на рис. 32, А. Однофакторный дисперсионный анализ (при группировке данных по типу тканей) демонстрирует значимую неоднородность средних для тканей величин С% (F = 5,468 3,500 = Fcm, р — 0,014), предопределенную низким содержанием углерода в костной ткани .
Выборки значений д С для самок и самцов не различаются (рис. 31, В) согласно критериям Колмогорова-Смирнова (р 0,100) и Манна-Уитни (р = 0,529). Однофакторнъш дисперсионный анализ (при группировке данных по принадлежности к полу) свидетельствует в пользу идентичности выборок (F = 0,212 4,600 = Fcm, р = 0,652).
В то же время однофакторный дисперсионный анализ (при группировке данных по типу ткани (F = 43,313 3,500 = Fcm, р — 0,000007) свидетельствует о значимой гетерогенности выборок (рис. 32, В). Из сравнений усред-ненных для каждого типа ткани значений 5 С (табл. 31) следует, что гетерогенность выборок предопределена различиями образцов костной ткани, колеи, хрусталика и гонады.
Костная ткань {8} 0,000000 0,000001 0,000001 0,000001 0,000002 0,000005 0,000036 Выборки значений процентного содержания азота (N%), полученные при исследовании самок и самцов (рис. 31, Б), не отличаются одна от другой (критерий Колмогорова-Смирнова, р 0,100; критерий Манна-Уитни, р = 0,834). Распределения значений N% в соответствии с типом ткани асимметричны: однофакторный дисперсионный анализ (при группировке данных по типу тканей) демонстрирует значимую неоднородность средних для тканей величин N% (F = 14,466 3,500 = Fcm, р = 0,00058, рис. 32, Б), причем эта асимметрия предопределена контрастными значениями N% для хрусталика, кожи и печени (табл. 32). Таблица 32. Результат статистического сравнения средних (для самок и самцов) значений процентного содержания азота в тканях весенних лягушек. В ячейках указаны значимости различий (р) в соответствии с LSD - тестом. Жирным шрифтом выделены статистически значимые различия.
Статистические сравнения значений д N тканей самок и самцов весенних лягушек свидетельствуют о значимом различии выборок, полученных при исследовании самцов и самок (критерий Колмогорова-Смирнова, р 0,100; критерий Манна-Уитни, р — 0,046; рис. 31,Г). Ткани самцов ненамного, но более богаты тяжелым изотопом азота. Распределения значений 815N для тканей самок и самцов относительно подобны (однофакторный дисперсионный анализ (при группировке данных по типу тканей), F = 2,233 3,500 = Fcm, Р = 0,141). Фактором, искажающим симметрию этого распределения, являются значения 8 N для ткани сердца (табл. 33).
Если полагать (вслед за П.В. Терентьевым, 1950), что половозрелость de facto (т.е. первое спаривание и икрометание), достигается у остромордых лягушек на третьем году жизни, то 16-месячных лягушек следует считать ювенильными формами, 28-месячных - поздними ювенильными формами, превращающимися в половозрелые особи, а весенних 36-месячных - половозрелыми формами.
В соответствии с этим, значимые изменения величин, отражающие увеличение доли тяжелых изотопов углерода и азота в тканях самцов, следует полагать сопряженными с переходом от ювенильной к половозрелой фор ме. У самок такой переход выражен существенно меньше, поскольку можно констатировать лишь слабую тенденцию изменения значений 8 С и 5 N.
В то же время, кажется маловероятным, что изменения изотопного отношения тканей предопределяются изменением гормонального статуса при переходе к состоянию половозрелости, поскольку ткани 36-месячных лягушек (т.е. лягушек в самом начале периода икрометания) фактически не отличаются по изотопному отношению от тканей 28-месячных лягушек.
Более вероятным представляется другое объяснение возрастных изменений изотопных отношений. Лягушки (и R. arvalis в том числе) являются хищниками, лишенными пищевой специализации. Рацион лягушек включает фактически все без исключения группы насекомых (на разных фазах их жизненного цикла), моллюсков, червей. Лягушки поедают все то, что населяет их местообитание и что может быть ими проглочено. Соответственно, крупные особи поедают более крупную добычу, чем мелкие (Терентьев, 1950). Для лягушек второго года жизни (16-месячных) характерно выраженное различие в размерах особей разного пола: самцы на треть короче и почти вдвое легче самок того же возраста (см. раздел «объекты и методы исследования»). Соответственно, рацион мелких самцов 16-месячных лягушек должен включать более мелкую «добычу», чем рацион крупных самок этого же возраста, что и проявляется в различии изотопных отношений их тканей. Выравнивание размеров самцов и самок лягушек на третьем году их жизни приводит к унификации рациона и выравниванию значений изотопного отношения.
Значения 5 С тканей у 1- и 22-месячных самок мышей представлены в таблицах 36 и 37. Изотопное соотношение в образцах пищи (5С = -25,2±0,61; результат шести определений), на которой содержали животных, значимо (р 0,05) отличается от характерных изотопных отношений тканей и органов мышей из обеих возрастных групп.
Однофакторный дисперсионный анализ свидетельствует об однородности значений, полученных от разных одномесячных мышей (группировка данных по исследованным особям; F = 2,191 2,584 = Fcm, р = 0,086). Такой же анализ выборки для 22-месячных мышей выявил значимую неоднородность данных (F 4,996 2,594 = Fcm, р = 0,0002). LSD-анализ показал, что эта гетерогенность предопределена значимыми отличиями 513С для всех тканей первой мыши от соответствующих величин у остальных мышей. Исключение данных для первой мыши исправляет ситуацию: выборка данных становится гомогенной (F = 1,511 2,874 = Fcm, р = 0,229). В этой связи данные, полученные при исследовании первой мыши, были исключены из последующего анализа. Последняя строка таблицы 37 содержит усредненные значения для четырех (№№2 — 5) оставшихся в анализе мышей.
Однофакторный дисперсионный анализ значений изотопного отношения в различных тканях и органах (т.е. при группировке данных в соответствии с типом ткани) одномесячных мышей (табл. 38) указывает на то, что различия этого показателя в разных органах статистически существенны. Рас-пределение значений 5 С в соответствии с типом ткани асимметрично (рис. 36). Эта асимметрия предопределена значениями 8 С костной ткани, сухожилия хвоста и хрусталика, отличающихся между собой и от остальных тканей (табл. 39).
