Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 7
1.1. Механическое напряжение как важный морфогенетический фактор 7
1.1.1. Источники механических напряжений в тканях зародыша и механизмы их передачи на расстояние и внутрь клетки 7
1.1.2. На что могут влиять механические напряжения 12
1.1.3. Реакция участков эмбриональных тканей амфибий на механическое растяжение и релаксацию 14
1.2. Структура биологических тканей 16
1.2.1. Биологический смысл клеточной мозаики 16
1.2.2. Механизмы, определяющие структуру ткани 18
1.3. Планарная полярность биологических тканей 22
1.3.1. Что такое планарная полярность, её функции и примеры 22
1.3.2. Молекулярные механизмы планарной полярности, действующие на
локальном уровне 23
1.3.3. Механизмы планарной полярности, действующие на глобальном уровне 29
1.4. Эмбриональный ресничный эпителий xenopus laevis 31
1.4.1. Строение и развитие ресничного эпителия 31
1.4.2. Механизмы, задающие регулярный паттерн расположения ресничных клеток...31
1.4.3. Цилиогенез 32
1.4.4. Механизмы установления планарной полярности ресничного эпителия 34
2. Цели и задачи 38
3. Материалы и методы 39
3.1. Материалы 39
3.1.1. Реактивы 39
3.1.2. Лабораторное оборудование 39
3.1.3. Лабораторные животные 39
3.1.4. Буферы и растворы 40
3.1.5. Фиксаторы 40
3.2. Методы 40
3.2.1. Получение и инкубация зигот 40
3.2.2. Микрохирургические операции 41
3.2.3. Составление карт потоков окружающей жидкости, создаваемых РН, и их анализ 45
3.2.4. Сканирующая электронная микроскопия (СЭМ) 46
3.2.5. Вычисление степени растяжения сэндвичей 46
3.2.6. Обработка изображений, полученных с помощью СЭМ 47
3.2.7. Алгоритм поиска рядов из РК 48
4. Результаты 49
4.1. Структура ресничного эпителия 49
4.2. Планарная полярность ресничного эпителия 52
5. Обсуждение 63
5.1. Структура ресничного эпителия 63
5.2. Планарная полярность в эксплантатах крыши бластоцеля 64
5.3. Влияние механического растяжения и релаксации на планарную полярность ресничного Эпителия 66
5.4. Возможная роль натяжений на поверхности интактных зародышей в ориентации оси планарной
Полярости ресничного эпителия 68
6. Выводы 71
Список сокращений 73
Список литературы
- Источники механических напряжений в тканях зародыша и механизмы их передачи на расстояние и внутрь клетки
- Механизмы, определяющие структуру ткани
- Лабораторные животные
- Влияние механического растяжения и релаксации на планарную полярность ресничного Эпителия
Введение к работе
Актуальность проблемы
Ресничный эпителий выстилает полости многих систем органов позвоночных, например, дыхательной, репродуктивной, мочевыделительной. Он создаёт направленный поток жидкости в полостях. В дыхательной системе он способствует выведению частиц пыли и болезнетворных микроорганизмов наружу, а в репродуктивной системе способствует продвижению яйцеклетки по яйцеводам в матку. Нарушения в формировании ресничек и их направленного биения лежат в основе многих заболеваний (Eley et al., 2005).
Направленное биение ресничек отражает широко распространённое в природе явление планарной полярности (ПП). Оно является фундаментальным для морфогенеза многочисленных структур от крошечных волосков до целых организмов. Молекулярные механизмы планарной полярности, действующие на локальном (межклеточном) уровне изучены к настоящему моменту достаточно подробно. Однако до сих пор остаются
нераскрытыми механизмы ориентации осей планарной полярности клеток вдоль целого органа или организма («глобальный» уровень) (Wang, Nathans, 2007; Goodrich and Strutt, 2011).
Ресничные клетки имеют регулярное расположение в эпителии. Данное явление отражает тот факт, что биологические ткани имеют модульное строение (Савостьянов Г.А., 2005) и обладают определённой топологией (Isaeva et al., 2012). Нарушение структуры1 ткани может лежать в основе патологических процессов. Следовательно, изучение механизмов формирования структуры ткани является актуальным для медицины, особенно, учитывая то, что основное внимание в исследованиях уделяется молекулярным механизмам тканевой патологии, а структурный фактор остается без внимания.
Ряд сравнительно недавно полученных данных свидетельствует о том, что в установлении ПП и структуры ткани могут участвовать механические напряжения (МН) в клеточном пласту. Полученные на зачатке крыла дрозофилы результаты (Aigouy et al., 2010) позволяют предположить, что МН могут являться глобальным поляризующим фактором. Кроме того, в теоретических работах по моделированию плотных клеточных упаковок (эпителиев) было показано, что в зависимости от механических параметров клеточного пласта (сил клеточной адгезии и сократимости поверхности клеток) могут существовать клеточные мозаики с различными топологиями (Farhadifar et al., 2007; Staple et al., 2010). Однако экспериментальные данные о влиянии механического напряжения на структуру клеточной мозаики в биологических тканях практически отсутствуют.
Данная работа предпринята, чтобы прояснить на примере ресничного эпителия шпорцевой лягушки (Xenopus laevis) механизмы формирования тканевой структуры и ориентации оси ПП клеток вдоль целого органа, и сконцентрирована на роли механических напряжений в тканях. Ресничный эпителий X. laevis в качестве модельной системы выбран неслучайно: его структура и планарная полярность подробно изучены и легки для идентификации. Поскольку механизмы ПП высоко консервативны среди животных, результаты, полученные на X. laevis, будут актуальны для исследования ПП у других организмов, в т.ч. и у млекопитающих.
Под структурой ткани мы будем понимать особенности взаимного расположения относительно друг друга разных типов клеток в ткани и их численные соотношения.
Цели и задачи
Цель данной работы - экспериментальное изучение факторов, определяющих структуру и планарную полярность (ПП) ресничного эпителия у зародышей шпорцевой лягушки.
В соответствии с целью исследования были поставлены следующее задачи:
-
Разработать метод оценки структуры и ПП ресничного эпителия (РЭ) X. laevis и описать с использованием данного метода его структуру и ПП у интактных зародышей.
-
Исследовать влияние релаксации механических натяжений у зародышей на стадии ранней нейрулы на структуру и ПП их РЭ.
-
Оценить, как эксплантация передней и задней части крыши бластоцеля на стадии ранней гаструлы и латеральной эктодермы на стадии ранней нейрулы влияет на структуру и ПП РЭ.
-
Изучить влияние механического растяжения эксплантированных на ранней гаструле участков крыши бластоцеля на структуру и ПП их РЭ.
-
Поставить опыты по поворотам на 180 на стадии ранней гаструлы передних и задних областей крыши бластоцеля и оценить ПП повернутых трансплантатов относительно ПП зародышей-реципиентов.
Научная новизна работы
Разработана компьютерная программа для анализа структуры ресничного эпителия, которая на изображениях образцов, полученных с помощью сканирующей электронной микроскопии, подсчитывает число ресничных клеток (РК), находит ряды из РК и вычисляет их ориентацию относительно заданной оси. С помощью данной программы обнаружено, что у интактного зародыша 28 стадии развития (стадия хвостовой почки) РК располагаются отдельными рядами, причём ряды располагаются преимущественно под прямым углом к длинной оси зародыша. Обнаружено, что эксплантация нарушает данный паттерн расположения РК, а механическая релаксация на стадии ранней нейрулы и растяжение на стадии ранней гаструлы практически не влияют на структуру эпителия.
На двойных эксплантатах (сэндвичах) крыши бластоцеля ранней гаструлы шпорцевой лягушки показано, что механическое растяжение приводит к повышению порядка ПП РЭ, причём ось ПП ориентируется поперёк оси растяжения. Также обнаружена региональная специфичность реакции тканей зародыша на растяжение. Кроме того, показано, что релаксация механических натяжений целого зародыша на стадии ранней нейрулы может приводить к изменению паттерна ПП.
Таким образом, нами впервые на примере эмбрионального ресничного эпителия X. laevis удалось показать, что механические напряжения могут быть глобальным ориентирующим фактором ПП у позвоночных.
Научно-практическая значимость работы
Изучение механизмов формирования структуры и планарной полярности ресничного эпителия имеет не только большой теоретический интерес, но и прикладное значение. Поскольку механизмы формирования клеточных мозаик и ПП консервативны среди животных, результаты, полученные на X. laevis могут быть использованы в медицине. Нарушения формирования ресничек и их полярности лежат в основе многих заболеваний человека: в частности, это касается заболеваний дыхательной и репродуктивной систем (Eley et al., 2005). Показано, что в основе патологических процессов в эпителиях могут лежать перестройки в их структуре (Савостьянов, 2005). Знание механизмов формирования структуры ткани важно и для тканевой инженерии.
Апробация работы
Основные результаты диссертационной работы были доложены на конференции «Морфогенез в индивидуальном и историческом развитии: симметрия и асимметрия» (Москва, 2012), международной конференции «Biological motility: Fundamental and applied science» (Пущино, 2012), конференции «Морфогенез в индивидуальном и историческом развитии» (Москва, 2011), международной конференции «Biological Motility: from fundamental achievements to nanotechnologies» (Пущино, 2010).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ, в том числе 2 статьи в рецензируемых журналах из списка ВАК.
Структура и объем диссертации
Источники механических напряжений в тканях зародыша и механизмы их передачи на расстояние и внутрь клетки
Опосредованное цитоскелетом движение интегринов, связанных с фибронектином, вызывает его растяжение. Натяжение фибронектина может передаваться другим клеткам, что упорядочивает их движения и влияет на их дифференцировку. Кроме ого, сами фибробласты упорядочивают нити фибронектина и, таким образом, могут влиять на движение других клеток (Larsen et al., 2006).
В перестройке актинового цитоскелета (полимеризации-деполимеризации актина) и в миозин-опосредованном скольжении актиновых нитей участвуют сигнальные пути, регулируемые малыми ГТФазами из семейства Rho (Lodish et al., 2003). Наиболее изученными представителями этого семейства являются Rho A, Rac1 и Cdc42. Активация RhoA стимулирует связывание актиновых филаментов в пучки (стресс-фибриллы) и сборку интегринов в фокальные контакты. RhoA также активирует киназу, которая в свою очередь активирует АТФазу лёгких цепей миозина. Это вызывает скольжение миозина по актину, т.е. сокращение актомиозинового аппарата. Rac1 вызывает полимеризацию актина de novo на периферии клетки и формирование плоских мембранных выступов (ламеллоподий). Cdc42 участвует образовании онких, богатых актином мембранных выступов (филлоподий). Активация RhoA может происходить при воздействии на интегрины механическими стимулами (Ingber, 2003). Баланс между активностью Rho и Rac определяет способность клеток чувствовать физическое окружение и двигаться в определённом направлении (Brock and Ingber, 2005). Было показано участие ГТФаз семейства Rho в регуляции митоза и морфогенетических движений за счёт участия в процессах, изменяющих клеточную форму и полярность (Hall, 1998).
Механические силы могут восприниматься через механочувствительные ионные каналы (МИК). Некоторые интегрины находятся рядом с предположительно механочувствительными ионными каналами. Считается, что поток Ca может быть вызван приложением силы к интегринам (Shakibaei and Mobasheri, 2003).
Интересной является идея об участии МИК в активном ощупывании (т.н. «активное касание») клетками субстрата для получения информации о его жёсткости, т.е. информации о своём механическом окружении. Ощупывание заключается в натягивании клеткой субстрата за счёт работы актомиозинового комплекса стресс-фибрилл (Pelham and Wang, 1997; Engler et al, 2006).
Интересно, что от жёсткости субстрата зависит амплитуда и частота активности МИК. Например, эндотелиальные клетки на жёстком субстрате проявляют более высокие флуктуации концентрации внутриклеточного кальция по сравнению с клетками, растущими на более мягком субстрате. Самое интересное, что на границе между жестким мягким субстратом эндотелиальных клеток наблюдали наиболее сильные спонтанные флуктуации внутриклеточного кальция. Это говорит о том, что клетки очень тонко чувствуют жёсткость субстрата, ощущая даже границу между разными жёсткостями (Kobayashi and Sokabe, 2010).
Клетка может использовать в качестве механосенсоров и другие молекулы. Например, механическое давление потока жидкости напрямую активирует гетеротримерные G-белки клетки, изменяя вязкость мембраны (Haidekker et al., 2000). Другой мембрано-ассоциированный механизм механотрансдукции связан с кавеолами - небольшими углублениями в плазмалемме, в мембране которых сосредоточено большое количество олигомеризованного белка кавеолина - и липидными рафтами (микродомены более плотно упакованного билипидного слоя, «плавающие» по остальному менее плотному слою). При распаде кавеол и рафтов (из-за уменьшения в плазмалемме количества холестерола) остеоциты перестают воспринимать происходящие в них изменения механического давления жидкости (Ferraro et al., 2004). Формирование липидных рафтов, необходимое для активности Rac, зависит от интегрин-опосредованного сигнала т внеклеточного матрикса (del Pozo et al., 2004). 1.1.2. На что могут влиять механические напряжения
Существуют многочисленные данные о влиянии МН на мембранную динамику (совокупность процессов экзо- и эндоцитоза), рост и пролиферативную активность клеток, их дифференцировку, форму, направленную миграцию, планарную полярность (см. п. 1.3.3) и ориентацию базальных телец ресничек (см. п. 1.4.4). МН могут даже регулировать экспрессию генов. Все эти процессы имеют место при морфогенезе животных, в основе которого лежат строго скоординированные во времени и в пространстве изменения формы клеток и клеточных движений. Рассмотрим примеры.
В клетке на молекулу белка может действовать растягивающая сила, равная 2-10 pN (Ladoux B., Nicolas A., 2012). Под действием растяжения отдельные домены молекул меняют свою конформацию. Следовательно, в живой клетке механические силы могут влиять на белок-белковые взаимодействия или на связывание с лигандом. Они также могут оказывать влияние на химическое равновесие и, следовательно, на динамику полимеризации-деполимеризации элементов цитоскелета. Например, растяжение нейрона или гладкомышечной клетки сосуда усиливает полимеризацию тубулина (Dennerll et al., 1988; Putnam et ai, 2001).
В многочисленных работах показано, что клеточная мембрана способна отвечать на механическое воздействие изменением своей площади (Apodaca, 2002; Ivanenkov et al., 1990; Fink, Cooper, 1996). На протопластах было замечено (Wolfe et ah, 1986), что если мембрана по сравнению с её исходным состоянием натянута сильней, то происходит встраивание материала в мембрану, а если слабее, то наоборот, происходит интернализация части мембраны. Клетка, видимо, стремится восстановить исходное натяжение мембраны. В условиях, предотвращающих самонатяжение клетки, последняя переходит к апоптозу, а экспрессия специфических для данного типа клеток генов подавляется (Huang and Ingber, 2000).
Механизмы, определяющие структуру ткани
Рассмотрим предполагаемые факторы, участвующие реализации различных клеточных упаковок. Роль белков планарной полярности в регуляции трёхмерной структуры тканей рассмотрена в п. 1.3.2. Физические факторы, влияющие на тканевую мозаику
Существует гипотеза дифференциальной адгезии, согласно которой различия в адгезивных свойствах клеток приводят к образованию определённых клеточных упаковок. Создание таких упаковок ведёт к минимизации свободной энергии клеточных поверхностей (Lecuit, Lenn, 2007).
Хорошо согласуется с этой гипотезой развитие фасетчатого глаза дрозофилы. Упаковка будущих колбочек основана на дифференциальной экспрессии кадгеринов. N-кадгерин синтезируют только колбочки, они окружены клетками, которые синтезируют другой тип кадгерина (Е-кадгерин). N-кадгериновые клеточные контакты более прочные (соответствуют минимуму потенциальной энергии), т.е. здесь имеет место дифференциальная адгезия. Колбочки образуют то чно такие же упаковки, как мыльные пузыри (рис. 2). Из этого был сделан вывод, что упаковка колбочек идёт в направлении минимизации площади их общей внешней поверхности, т.е. к минимизации свободной энергии (Hayashi, Carthew, 2004).
Методом моделирования б ыло показано, что форма клеток, их размер и смежность зависят от механического состояния ткани (Farhadifar et al., 2007). Основными параметрами данной модели были силы адгезии на границах клеток и силы, стремящиеся сократить поверхность клеток с помощью актинового цитоскелета. Было обнаружено существование нескольких типов клеточных упаковок, соответствовавших минимуму свободной энергии при данных параметрах (рис. 3).
Механизмы формирования регулярных клеточных упаковок Известный и широко распространённый механизм образования регулярных клеточных упаковок основан на принципе контактного ингибирования, где необходимым условием являются межклеточные взаимодействия посредством системы Delta-Notch. Она задействована и во многих других дифференцировках (Bray, 2006). Notch – трансмембранный белок , а Delta – лиганд, встроенный в мембрану другой клетки. Delta и Notch одновременно находятся в мембране каждой клетки.
Рассмотрим, как эта система участвует расчленении изначально однородной клеточной массы на различные типы клеток на примере хорошо изученной дифференцировки клеток личинки дрозофилы на нервные эпителиальные клетки. Связывание Delta с Notch вызывает протеолиз Notch на три фрагмента. Цитоплазматический фрагмент проникает в ядро и активирует гены эпителиальной дифференцировки. Случайная флуктуация в мембране какой-либо клетки в сторону большей концентрации Delta направляет её в сторону нейральной дифференцировки. «Продвинувшись» чуть дальне своих соседей в «нейральную» сторону, эта клетка подавляет дифференцировку соседей по этому же пути и окружает себя кольцом эпителиальных клеток. Вне этого кольца запрета на нейральную дифференцировку нет, отчего повторяется то же самое. Так возникает регулярная мозаика из разных типов клеток (Bray, 2006). Этот же механизм участвует и в возникновении регулярного расположения щетинок на кутикуле дрозофилы (Lewis, Held, 1991).
Второй механизм, который можно отнести к механизму контактного ингибирования, связан с механическими напряжениями. Наиболее простым и ярким примером ого, то механические натяжения могут частвовать самоорганизации клеточных масс является работа А. Харриса (Harris et ai, 1984). Ещё до их опытов было известно, что если посеять культуру активно двигающихся клеток (например, фибробластов) на твёрдый субстрат, который они не способны сами растянуть, никакой морфологической организации не возникает. Однако, как установили вторы, если посеять те же клетки на коллагеновый гель, который клетки способны натянуть своим сокращением, то будут образовываться однородные клеточные сгущения, соединённые «мостиками» из растянутых клеток. Точно такие же структуры возникают в соединительно-тканном лое кожи зародышей птиц и млекопитающих при возникновении перьев или волос (рис. 4).
Американские авторы предлагают следующую схему данного процесса (Harris et ai, 1984). Фибробласты имеют тенденцию образовывать плотные скопления. Они образуются из клеток, имевших ранее хотя бы точечные контакты. Сокращаясь, данная группа растягивает убстрат, то вызывает разрежение клеток в окрестностях группы. От этого понижается вероятность образования новых скоплений рядом с уже существующим. Как следствие, скопления образуются на одинаковых расстояниях друг от друга и возникают регулярные скопления.
Планарная полярность (ПП) - характерное свойство биологических тканей. Она более всего проявляется в эпителиях, но встречается и в неэпителиальных тканях (Goodrich and Strutt, 2011). В эпителиях ПП определяется как полярность в плоскости пласта, отличная от апико-базальной полярности.
ПП проявляется как на уровне отдельных клеток, так и на уровне многоклеточных структур (примеры см. на рис. 5) и необходима для нормального функционирования органа и всего организма. Ярким примером планарно полярной ткани является ресничный эпителий (РЭ). Он входит в состав многих систем органов и участвует в создании направленных потоков окружающих жидкостей (выстилка дыхательной и репродуктивной систем, желудочков мозга). Нарушения в формировании ресничек или их направленном биении лежат в основе многих заболеваний (Eley et al., 2005).
Интересно, что ПП отдельной небольшой группы клеток может определять лево-правую асимметрию тела всего организма. Предполагают, что создаваемый моноцилиарными клетками в гензеновском узелке у птиц и мышей, в крыше гастроцеля шпорцевой лягушки и в Купферовском пузыре рыб левосторонний поток окружающей жидкости участвует пока точно не выявленным способом в запуске каскада активации генов, специфичных для левой стороны тела (Essner et al., 2002).
Лабораторные животные
Перед фиксацией на СЭМ мы составляли карты потоков окружающей жидкости у сэндвичей. Сначала мы составили карты для сэндвичей из целых крыш (КБс) и из их передних (ПКс) и задних частей (ЗКс) (рис. 19а, Приложение 1). 37% КБс обладали хаотическим паттерном потоков окружающей жидкости, создаваемых РК (рис. 19б). Однако у оставшейся части КБс можно было выделить от 1 до 4 областей , в пределах которых потоки были упорядочены вдоль одной оси. Среди них преобладали сэндвичи с четырьмя и с тремя областями (27% и 18% от общего числа КБс, соответственно). У ПКс паттерны потоков были сходными.
ЗКс существенно отличались по преобладающему паттерну потоков. В целом у ЗКс они были более упорядочены, будучи направленными о т области присоски назад или радиально расходясь от нее к краям сэндвичей. 7% ЗКс обладали хаотическим паттерном потоков, у 27% ЗКс потоки были полностью упорядоченные и 40% ЗКс имели по две крупные области, каждая из которых характеризовалась единым паттерном потоков (рис. 19б).
Карты потоков окружающей жидкости, создаваемых РК на 28-й стадии развития, для различных типов сэндвичей (а). Стрелки – направления потоков, овалы – области с одинаковым направлением потоков, в скобках указано число таких областей в сэндвиче: 0 – потоки хаотичны и в пределах сэндвича нельзя выделить крупные области с одинаковыми направлениями потоков жидкости, 1 – паттерн потоков полностью упорядочен вдоль одного направления в сэндвиче, 2, 3, 4 – в сэндвиче можно выделить 2, 3, 4 области с одинаковым направлением оси ПП, соответственно; б – доли сэндвичей (в процентах) по числу (в скобках) имеющихся в них областей с одинаковым паттерном потоков. Переднезадняя ось располагается горизонтально. решили повторить данные опыты и проверить, меняется ли при этом паттерн потоков в задней части крыши. Оказалось, что по сравнению с ЗКс в ПК+ЗК помимо исчезновения присоски задних частях крыш (рис. 19, Приложение 1) происходила хаотизация потоков: значительно увеличились доли образцов с тремя (с 13 до 30%) и четырьмя областями (c 13 до 40%), и не было образцов с двумя областями.
Наши данные свидетельствуют о том, что эксплантация нарушает ПП у КБс и ПКс, однако у них сохраняется локальный порядок ПП. ЗКc обладают существенно большим порядком ПП по сравнению с КБс и ПКc.
Способность участков эктодермы к локальному выстраиванию полярностей была отмечена ранее (Knig, Hausen,1993). Нас интересовало, может ли механическое натяжение быть глобальным поляризующим фактором. Свидетельства в пользу данного предположения были приведены в обзоре литературы (п. 1.3.3).
Мы исследовали влияние механического растяжения на ПП сэндвичей из различных половин крыш бластоцеля. Величины суммарного растяжения (после трех последовательных сеансов растяжения) для отдельных сэндвичей и средние значения растяжения для каждой серии опытов приведены в Приложении 2, а карты потоков у растянутых сэндвичей - на рис. 20а и в Приложении 3.
Сначала ы исследовали влияние растяжения вдоль оси, перпендикулярной презумптивной АР оси, поскольку в данном направлении, как уже отмечалось, удобнее проводить растяжение. Достоверных различий в величине растяжения между ПКс и ЗКс в данном направлении не было, т.е. в данной серии опытов нам удавалось растянуть их одинаково (см. рис. П2).
Механическое растяжение сэндвичей поперек их АР оси приводило к существенному упорядочиванию паттерна потоков у ПКс (рис. 20б): доля ПКс с хаотическим паттерном потоков снизилась с 33 (у нерастянутых) до 9% (у растянутых), а доля ПКс с двумя областями одинаковых паттернов потоков возросла с 8 до 46%. Доля ЗКс с полностью упорядоченными потоками увеличилась с 27 до 56%.
В Приложении 4 представлены количественные результаты экспериментов, по которым составляли круговые диаграммы на рис. 19б и 20б. Для оценки направления, вдоль которого произошло упорядочивание потоков, мы составили таблицу (Приложение 5) и круговые диаграммы по ней (рис. 21). В качестве контроля для каждой серии опытов мы оценивали направление потоков у нерастянутых образцов вдоль той же оси, что и у растянутых образцов (т.е. для нерастянутых сэндвичей мы составляли две диаграммы - для двух взаимно перпендикулярных направлений).
Оказалось, что у более 70% ПКс, растянутых перпендикулярно АР оси, потоки были ориентированы перпендикулярно оси растяжения (27% + 46% 70%), т.е. вдоль АР оси (рис. 21), в то время как только у около 30% контрольных нерастянутых ПКс потоки были направлены вдоль АР оси (17% + 18%), а у 42% из них нельзя было выделить преимущественного направления потоков. Растяжение ЗКс перпендикулярно АР оси привело к увеличению доли сэндвичей с потоками, направленными перпендикулярно АР оси с 20% (у нерастянутых) до 56% (11% + 45% = 56%).
Чтобы проверить наше предположение о том, что ПП ресничных клеток ориентируется перпендикулярно искусственно приложенному механическому натяжению, мы провели вторую серию опытов, в которой растяжение роводили перпендикулярном направлении относительно направления растяжения в первой серии опытов. Т.е. во второй серии опытов мы растягивали сэндвичи вдоль АР оси. ЗКс в данном случае удавалось растянуть достоверно меньше по сравнению с ПКс, а также с ЗКс в первой серии опытов (см. рис. П2). Возможно, это связано с тем, что ЗКс вдоль АР направления были немного короче, чем ЗКс, поскольку при вырезании фрагментов крыш ы старались не брать эктодерму, подостланную подворачивающимся в области дорсальной губы бластопора слоем клеток. Или же это связано с различными механическими свойствами передней и задней части крыши бластоцеля.
Влияние механического растяжения и релаксации на планарную полярность ресничного Эпителия
Возможные факторы дальнего порядка ПП, утраченные в эксплантатах, обсуждаются в п. 5.4. Сохранившийся ближний порядок может определяться гидродинамическими факторами (Mitchel et al., 2007). В последних исследованиях показано, что установлении локального порядка ПП участвуют микротрубочки, оплетающие базальные тельца, а в установлении глобального порядка ПП - актиновый цитоскелет, также оплетающий основания ресничек (Werner et al., 2011). Нельзя исключить также воздействие местных паттернов натяжений, установившихся в эксплантатах. Возможно также, что бльшие масштабы ближнего порядка в эксплантатах головной эктодермы связаны с наличием во многих из них присоски (которая может участвовать организации полей натяжений). Заметим, то большинства ПК+ЗК, по сравнению с ЗКс, присоска отсутствовала и порядок планарной полярности был нарушен. Нельзя исключить, конечно, что ПК содержат химические факторы, ингибирующие установление глобального порядка ПП в ЗК.
Наши опыты по региональным различиям в «подстройке» повернутых участков к ПП окружения в целом согласуются как с результатами опытов по растяжению, так и с масштабами ближнего порядка. Действительно, ПКт, которые учше подстраиваются к ПП зародыша-реципиента, сильнее реагируют и на растяжение. Кроме того, меньшие (по сравнению с ЗКс) масштабы их ближнего порядка указывают на меньшую устойчивость их собственной ПП. 5.3. Влияние механического растяжения и релаксации на планарную полярность ресничного эпителия
Нами впервые на примере эмбрионального ресничного эпителия X. laevis было показано, то механическое растяжение может быть глобальным ориентирующим фактором ПП у позвоночных: в опытах по растяжению ПКс ориентировали свою ПП перпендикулярно оси растяжения и у них происходило повышение порядка ПП. Интересно, что механическое натяжение в зачатке крыла дрозофилы, напротив, ориентирует полярность клеток вдоль оси растяжения (Aigouy et ai, 2010).
Также мы обнаружили, что различные регионы зародыша могут по-разному отвечать на одно и то же механическое воздействие. У ЗКс порядок планарной полярности при растяжении по АР оси напротив нарушался, хотя растяжение поперёк АР оси приводило к повышению порядка ПП.
Полагают (Mitchell, 2009), что предшественники РК приобретают полярность внешнего слоя эктодермы, которая устанавливается значительно ранее установления полярности у предшественников РК. Поэтому, вполне вероятно, что механическое растяжение на 10 стадии в наших опытах вызвало необратимую поляризацию на данной стадии клеток внешнего слоя эктодермы (эпиэктодермы), тем, на более поздних стадиях предшественники РК приобрели полярность, навязанную эпиэктодерме. Ранее было обнаружено (Knig, Hausen,1993), что эксплантаты распластываются ри эксплантации на фибронектине, и направление миграции клеток не коррелирует с АР осью эксплантатов. Однако с направлением миграции клеток коррелировало направление биений ресничек. Данный результат авторы поясняют тем, что базальные тельца ресничек тесно связаны с цитоскелетом, поляризация которого происходит при миграции клетки.
Можно полагать, что в наших опытах по растяжению упорядочивание биений ресничек перпендикулярно оси растяжения связано тем, чо растяжение запускает движение клеток в направлении, перпендикулярном растяжению. В нашей лаборатории ранее было обнаружено, то механическое растяжение действительно запускает механозависимые коллективные клеточные движения. В течение первых 15 мин после растяжения клетки ачинают двигаться в направлении максимального натяжения. Во второй, более продолжительной фазе ответа на растяжение (она продолжается до 8 часов) клетки интеркалируют направлении перпендикулярном оси растяжения (Beloussov et ai, 2000). Поэтому остаётся пока не вполне ясным, напрямую ли повлияло в наших экспериментах растяжение на ПП ресничного эпителия или же это следствие запуска клеточных движений в перпендикулярном оси растяжения направлении.
Релаксация натяжений на стадии ранней нейрулы вставлением клина эмбриональной ткани в дорсальную область зародыша способствовала в 50% случаев приближению оси планарной полярности РЭ к дорсо-вентральной оси зародыша. Кроме того, часто исчезал дорсальный домен РЭ, в котором планарная полярность была ориентирована в передне-вентральном-задне-дорсальном направлении.
Оба результата можно объяснить тем, что при данном способе релаксации непосредственно ослабляется лько дорсо-вентральное натяжение поверхности ародыша (вызванное морфогенетическими движениями нейруляции), тогда как передне-заднее (т.е. вдоль длинной оси зародыша) не только сохраняется, но даже и усиливается, что видно по выпуклой форме вентральной поверхности и заворачиванию ее переднего и заднего концов (см. рис. 17г-е). Следовательно, в данном опыте, так же как и в экспериментах по искусственному растяжению эксплантатов ось планарной полярности приобретает тенденцию к ориентации перпендикулярно доминирующему натяжению.
