Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. ЗНАЧЕНИЕ МИКРОЭЛЕМЕНТОВ ДЛЯ РАСТЕНИЙ 9
1.1. Роль тяжелых металлов в экосистемах 9
1.2. Комплексонаты как способ восполнения дефицита биогенных металлов у растений 14
1.2.1. Общая характеристика комплексонов 14
1.2.2. Применение комплексонатов 21
1.3. Влияние сверхмалых доз биологически активных веществ на растения 38
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 48
2.1. Материалы исследования 48
2.2. Методы исследования 56
2.2.1. Получение растворов 56
2.2.2. Анализ качества выращенной продукции 57
2.2.3. Статистическая обработка данных 62
ГЛАВА 3. ВЛИЯНИЕ СВЕРХМАЛЫХ ДОЗ КОМПЛЕКСОНАТОВ БИОГЕННЫХ МЕТАЛЛОВ НА ОНТОГЕНЕЗ ЛЬНА-ДОЛГУНЦА СОРТА «ТОМСКИЙ-14» 65
3.1. Особенности прорастания семян льна 65
3.2. Рост и развитие льна на песчаной среде 78
3.3. Особенности накопления тяжелых металлов растениями льна после обработки их комплексонатами микроэлементов 84
ГЛАВА 4. ВЛИЯНИЕ СВЕРХМАЛЫХ ДОЗ КОМПЕКСОНАТОВ БИОГЕННЫХ МЕТАЛЛОВ НА ОНТОГЕНЕЗ И КАЧЕСТВО КАР ТОФЕЛЯ «ЛАСУНОК» 88
4.1. Онтогенез растений картофеля 88
4.2. Урожайность и качество клубней картофеля 90
ВЫВОДЫ 102
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ
Введение к работе
Актуальность темы. Как известно, биогенные металлы - необходимая часть питания растений, без которого невозможно получить качественный урожай. Поэтому проблеме снабжения растений этими элементами отводится большое внимание (Битюцкий, 1999).
Растения легко могут использовать биогенные металлы только в биологически активной водорастворимой форме (подвижной), а неподвижная форма может быть использована растением после протекания сложных биохимических процессов. Биогенные металлы, используемые в виде неорганических солей металлов, огарков и других отходов химических производств, зачастую не только малоэффективны и экономически не оправданны, но и экологически не безопасны. Биогенные металлы в виде неорганических солей удовлетворительно работают только в кислых почвах (рН до 6). В почвах, близких к нейтральным, их эффективность снижается в десятки раз. В нейтральных, слабощелочных и карбонатных почвах эти элементы переходят в плохо растворимые формы (гидроксиды, карбонаты), становятся недоступными для растений.
Одним из способов решения этих проблем является использование синтетических хелатных комплексов (Битюцкий, 1999; Дятлова, Темкина и др. 1988; Островская, 1988). Все они в целом обладают рядом преимуществ по сравнению с неорганическими солями. А именно: нетоксичны; устойчивы в более широком диапазоне рН почв, питательных растворов и совместимы с минеральными удобрениями; полностью растворимы в воде и легко усваиваются растениями; незначительно связываются почвой в малорастворимые соединения и не разрушаются микроорганизмами.
По эффективности воздействия на растения комплексонаты превосходят все другие формы микроэлементов от 2 до 5 раз. На карбонатных почвах и после известкования в настоящее время это единственная высокоэффективная форма микроудобрений.
Комплексные соединения микроэлементов с органическими лиганда-ми обладают высокой транспортной активностью. Через корневую систему растений они поступают в стебель и листья без изменений, однако в течение 1-3 суток разрушаются с переходом катиона металла в метаболиты растительной ткани. Высокая проницаемость комплексонатов через листья растений выдвигает их в ряд высокоэффективных средств для внекорневой подкормки. Вследствие этого значительно уменьшается расход, и данную форму микроэлементов можно использовать в качестве профилактического средства, не принимая во внимание состав почвы.
Экологический эффект достигается за счет биотрансформации малоподвижных форм биогенных металлов, которые при применении в традиционных формах не могут участвовать в онтогенезе растений. Кроме того, внекорневая подкормка снижает техногенную нагрузку на почву.
Большой вклад в решение проблемы плодородия Алтайский почв внесли работы таких специалистов как Бурлакова Л.М. (2005), Антонова О.И. (2005), Морковкин Г.Г. (2005), Макарычев СВ. (2005) и др. В представленной работе предпринята попытка изучить влияние минимизации такого антропогенного фактора, как тяжелые металлы, на развитие и урожайность растений льна-долгунца и картофеля, с целью разработки экологически обоснованных норм внесения микроэлементов при выращивании этих культур.
Цели и задачи исследования. Цель исследования - изучить влияние комплексонатов биогенных металлов на основе этилендиаминтетрауксус-ной кислоты (ЭДТА) в сверхмалых дозах (СМД) на процессы роста и развития растений льна-долгунца и картофеля, на урожайность и качество выращенной продукции.
В задачи исследования входили:
1. Изучить особенности роста и развития растений льна-долгунца при использовании удобрения на основе питательной среды Мурасиге-Скуга с комплексонатами биогенных металлов в СМД.
Определить накопление токсичных металлов растениями льна при использовании в процессе его выращивания удобрения на основе питательной среды Мурасиге-Скуга с комплексонатами переходных металлов.
Выявить влияние хранения удобрения на основе питательной среды Мурасиге-Скуга с комплексонатами биогенных металлов в СМД на энергию прорастания льна-долгунца.
Изучить рост и развитие растений картофеля при использовании удобрения на основе питательной среды Мурасиге-Скуга, с комплексонатами биогенных металлов в СМД.
Оценить влияние массовой доли комплексонатов микроэлементов в питательной среде на урожайность и показатели качества клубней картофеля.
Исследовать влияние обработки растений картофеля комплексонатами биогенных металлов в СМД на процессы дыхания при хранении клубней картофеля.
Научная новизна. Впервые определен максимум биологической активности по энергии прорастания, показателям морфологического развития растений льна-долгунца и картофеля, урожайности и обменным процессам в выращенной продукции при использовании удобрений, содержащих ком-плексонаты биогенных металлов в массовой доле в области 10"и М.
Установлено, что биологическая активность растворов комплексонатов в СМД по энергии прорастания уменьшается при хранении.
Впервые обнаружено, что в условиях проведения полевого опыта обработка растворами комплексонатов биогенных металлов в СМД способствует аккумуляции кадмия растениями льна-долгунца.
Практическая значимость. Применение растворов комплексонатов биогенных металлов в сверхмалых дозах позволяет интенсифицировать развитие растений льна-долгунца и картофеля, а также повысить их урожайность и улучшить качество выращенной продукции на фоне минерального питания, создаваемого средой Мурасиге-Скуга.
7 Полученные данные используются в курсе лекций «Экология», при подготовки специалистов по специальности «Биотехнология». Положения, выносимые на защиту.
Снижение доли комплексонатов тяжелых металлов до сверхмалых доз повышает урожайность растений льна-долгунца и картофеля, улучшает качество выращенной продукции.
Обработка растений льна-долгунца растворами комплексонатов переходных металлов увеличивает биоусвояемость кадмия из почвы.
Апробация работы. Основные результаты работы доложены на 6 конференциях, из них на одной международной - Межд. науч.-прак. конф. «Вузовская наука - сельскому хозяйству» (Барнаул, 2005); трех Всероссийских - 2-й Всерос. конф. «Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья» (Барнаул, 2005); 2-й Всерос. науч.-прак. конф. «Актуальные проблемы сельскохозяйственной биотехнологии» (Белгород, 2005); 4-й Всерос. науч. конф. «Химия и технология растительных веществ» (Сыктывкар, 2006); двух Межегиональных - 3-й Межрегион, науч.-прак. конф. «Производные хитозана и стимуляторы роста в сельском хозяйстве» (Бийск, 2005); 4-й Межрегион, науч.-практ. конф. «Производные хитозана и стимуляторы роста в сельском хозяйстве» (Бийск, 2006).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 печатных работ, из них 4 в журналах, включенных в список ВАК, и патент Российской Федерации № 2269893 С1 «Применение динатриевой соли этилендиа-минтетрауксусной кислоты (Трилона Б) в качестве стимулятора роста растений и способ его использования».
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 120 страницах, состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методик исследования, глав результатов собственных исследований, выводов, библиографического списка литературы (178 ссылок, в том числе 69 иностранных), содержит 18 таблиц и 24 рисунка.
Роль тяжелых металлов в экосистемах
В последние десятилетия в связи с интенсивным развитием промышленности значительно возросло поступление тяжелых металлов (относящихся к числу важнейших элементов в связи с их высокой биологической активностью) в биосферу.
На организм человека и животных физиологическое действие металлов различно и зависит от их природы, типа соединения, в котором они существуют в природной среде, а также концентрации. Таким образом, все тяжелые металлы, по своему влиянию на живые организмы, делятся на 2 группы: биогенные и абиогенные (ксенобиотики) металлы. Биогенные металлы крайне необходимы для жизнеобеспечения различных живых организмов, в то время как ксенобиотики вызывают противоположный эффект и, попадая в живой организм, приводят к его отравлению или гибели (Ильин, 1991; Будников, 1998).
К возможным источникам загрязнения биосферы тяжелыми металлами относят предприятия черной и цветной металлургии (аэрозольные выбросы, загрязняющие атмосферу, промышленные стоки, загрязняющие поверхностные воды), машиностроения, заводы по переработке аккумуляторных батарей, автомобильный транспорт.
Кроме антропогенных источников загрязнения среды обитания тяжелыми металлами существуют и другие, естественные, например вулканические извержения (кадмий обнаружили сравнительно недавно в продуктах извержения вулкана Этна на острове Сицилия в Средиземном море). Увеличение концентрации металлов-токсикантов в поверхностных водах некоторых озер может происходить в результате кислотных дождей, приводящих к растворению минералов и пород, омываемых этими озерами. Все эти источники загрязнения вызывают в биосфере или ее составляющих (воздухе, воде, почвах, живых организмах) увеличение содержания металлов-загрязнителей по сравнению с естественным, так называемым фоновым уровнем (Будников, 1998).
Тяжелые металлы как биогенные элементы. Интерес к функциям переходных элементов, которые относятся к тяжелым металлам и содержатся в организме в следовых количествах, проявился сравнительно недавно. Из-за низкого содержания в живом организме их стали называть микроэлементами. Главный критерий, по которому отличают макроэлементы от микроэлементов, - потребность организма в элементе, определяемая в мг/кг массы в сутки. Все микроэлементы в растениях функционируют либо в форме гидра-тированных ионов, либо в виде координационных соединений (Будников, 1998).
В растениях, как и в любом живом организме, в процессе осуществления жизнедеятельности протекает множество ферментативных химических реакций, сопровождающихся разрывом весьма прочных связей, то есть таких, которые в лабораторных установках могут быть осуществлены только в жестких условиях, например при высоком давлении или температуре.
Хотя молекула металлсодержащего фермента способна выдержать многие тысячи каталитических циклов, все-таки метаболические процессы, происходящие в живом организме, могут привести к разрушению части ферментов и выводу из организма соответствующего количества металлов. Поэтому появляется необходимость возмещать эти потери, поскольку недостаток микроэлементов приведет к нарушению жизнедеятельности организма, что может выразиться в различных заболеваниях (Ильин, 1985).
Для растений требуется определенный уровень содержания микроэлементов в почве, что обычно достигается внесением так называемых микроудобрений представляющих собой набор биогенных микроэлементов: цинка, ванадия, молибдена, меди, кобальта, железа, марганца. Следует обратить внимание и на то, что биологической ценностью обладают лишь активные биогенные элементы, содержащиеся или вводимые в виде солей органиче ских кислот и других растворимых химических соединений, чаще всего комплексных (Кабата-Пендиас, Пендиас, 1989).
При попадании в организм избытка металлов последние могут вызвать нарушение его функций, отравление или гибель. Степень такого воздействия зависит не только от концентрации, превышающей некоторый уровень, но и от природы металла, прежде всего его комплексообразующей способности. Таким образом, если комплексообразующая способность металла-токсиканта достаточно велика, то он может вытеснить биогенный металл-катализатор из активного центра в результате конкурентного взаимодействия или же связать с собой подавляющую часть биологически активных соединений, используемых для синтеза того или иного жизненно важного фермента (Будни-ков, 1998).
Материалы исследования
Изучение влияния сверхмалых доз биологически активных веществ (СМД БАВ) начались в 1983 г. сотрудниками ИБХФ РАН совместно с коллегами из Института психологии. Исследуя влияние антиоксидантной активности изолированного нейрона виноградной улитки, выяснили, что доза на четыре порядка ниже первоначальной оказалась не только менее токсичной, но и более эффективной. Дальнейшее уменьшение массовой доли привело к росту эффекта, он достигал максимума (при 10 15М), затем снижался до уровня (при 10"19М), практически совпадающего с контролем (Бурлакова и др., 1986).
Подобные явления были зафиксированы рядом ученых-исследователей (Ашмарин и др., 1999; Бурлакова и др., 1990; Зайцев и др., 1990). Все они наблюдали общие закономерности биоэффектов физиологически активных веществ в области малых и сверхмалых доз или массовых долей (в интервале 10" -10 М и менее). При уменьшении массовой доли вещества на 1-2 порядка эффект заметно снижался, затем наступала «мертвая зона», а далее, при последующем уменьшении массовой доли, отличной от первоначальной на 4-6 порядков, эффект возникал снова. Это явление получило название эффекта сверхмалых доз (СМД). Условно такую чувствительность биоэффектов можно разделить на пико-(х 10" М) и фемто- (хЮ" М) граммовой чувствительность (Beneniste, Meprill, 1970).
Такой эффект СМД БАВ наблюдался при исследовании разнообразных химических агентов: регуляторов роста растений, противоопухолевых препаратов, нейропептидов и гормонов, иммуномодуляторов, антиоксидантов и других как белковых, так и не белковых соединений.
В то же время была опубликована работа (Beneniste, Meprill, 1970), в которой описывалось воздействие физиологически активных веществ в массовых долях от 10"9 М и менее. В этом случае биоэффект приходится на массовые доли ниже даже тех, которые используются в гомеопатии - системе лечения ничтожно малыми дозами, предложенной в 1796 году немецким врачом С. Ганеманом. Идеология гомеопатии «микродозы по принципу подобия» подкреплена огромным количеством наблюдений и положительных результатов лечения, что дает возможность активного ее сосуществования с официальной медициной, например (Попова, 1988). Но в тоже время значительная часть научного сообщества относят положительные эффекты при использовании гомеопатических средств к эффектам психологического внушения или эффекта плацебо (пустышки).
Трудами Бурлаковой (Патент RU № 2102986) и Ямсковых (Ямскова, Ямсков, 1999) направление СМД БАВ получило интенсивное развитие в медицине. Так, ЗАО Производственное предприятие «Эндо-Фарм-А» запатентовало лекарственное средство на основе физиологически активных глико-продеинов, выделяемых из межклеточного пространства тканей различных органов, сыворотки крови и желчи человека и животных и обладающих био-логической активностью в СМД при массовой доле 10" -10" моль/литр и ниже (Патент RU №2136695).
Работы по проблеме использования СМД БАВ в области биологии и растениеводстве не так распространены, как в медицине, однако роль этих исследований не менее значима.
Первое исследование в этой области представлено И.Ю. Горбатенко (Горбатенко, 1997).
В научной литературе встречается несколько описаний полевых опытов по воздействию препаратов в СМД на развитие растений. Большинство исследований проведено в теплицах и лабораториях. Кроме двух исследований на деревьях, зараженных вирусами (Sinha, 1976,) или грибами (Mclvor, 1980), единственной работой по полевым испытаниям является статья Каупе (Каупе, 1991), в которой сообщены результаты испытаний на райграсе. Применение опрыскивания препаратами в СМД (Sulphur 6с и Sulphur, Silicea и Carbo vegetalis десятикратных потенций) не показало существенного влияния на рост растений.
Работы в этом направлении могут быть разделены на две группы: модели роста и прорастания, где оценивается прорастание семян и рост побегов. И вторая - фитопатологические модели, где рассматривается сопротивление растений воздействию патогенам (таблица 4).
Модель прорастания/роста была выбрана в качестве основной после пионерской работы Kolisko по пшенице (Kolisko, 1959) и много опытов было проведено по этой схеме (Betti et al., 1994; Pongratz, Endl, 1994; Rivas et al., 1996; Binder et al., 2005; Brizzi, Lazzarato, 2005). Группы ученых Betti и Baumgarther совместно исследовали проращивание пшеницы. Ими были получены данные с высокой достоверностью, но противоположными эффектами (Binder et al., 2005; Brizzi et al., 2005).
Особенности прорастания семян льна
Биологическая роль микроэлементов велика. Всем без исключения растениям для построения ферментных систем - биокатализаторов - необходимы микроэлементы, среди которых наибольшее значение имеют цинк, марганец, медь, железо и кобальт. Поэтому исследования проводились именно с этими элементами.
Биологическая активность проверялась на прорастании семян льна (Linum usitatissimum) и оценивалась по энергии прорастания. Использовались растворы в диапазоне массовых долей от См=10 3 М до СМ=10 18М. В качестве контроля выступал раствор NPK, на основе среды Мурасиге-Скуга.
Результаты представлены на рисунках 6 и 7. Из всех микроэлементов семена льна оказались наиболее чувствительными к меди, поэтому с данными растворами было проведено большее количество экспериментов, что дало возможность провести статистическую обработку данных и убедиться в достоверности полученных зависимостей. Влияние массовой доли растворов комплексонатов меди представлено на рисунке 6.
Анализ рисунков 6 и 7 показывает, что все влияние комплексонатов имеет сложный полимодальный характер с несколькими экстремумами в различных диапазонах массовых долей. Обращает на себя внимание факт наличия биологического эффекта в области сверхмалых массовых долей для всех вариантов соединений ЭДТА, после которого биологическая активность снижается ниже контрольного. Следует отметить, что данный сложный вид кривых характерен для эффекта действия СМД БАВ (Гуревич, 2001).
Влияние массовой доли растворов смеси микроэлементов, на прорастание семян льна (Linum usitatissimum)
Биологическая активность оценивалась по энергии прорастания семян льна. Базовый раствор микроэлементов готовился по методу, описанному в главе 2, пункт 2.3. Растворы с массовой долей микроэлементов от См=10 М до См=10" М готовились последовательным десятикратным разведением базового раствора.
На рисунке 8 представлены математическое ожидание энергии прорастания от массовой доли раствора и доверительные границы при доверительной вероятности 0,95. Повторность опытов - десятикратная.
Анализ данных рисунка 8 показывает наличие полимодальной зависимости «массовая доля раствора - энергия прорастания» кроме максимума биологической активности растворов в обычно используемых областях массовых долей (10 3 М) наблюдается увеличение активности и при более низких их значениях. Для массовой доли растворов микроэлементов, 10" М прирост энергии прорастания семян составил 12 % к контролю. Для второго макси-мума активности при массовой доле 10 М прирост равен 15 %, для 10 М -6 %.
Влияние способа приготовление растворов и длительности их хранения на прорастание семян льна
Целью данного раздела было исследование изменения биологической активности водных растворов, содержащих СМД комплексонатов металлов в процессе хранения.
Для изучения изменения биологической активности использовались водные растворы, приготовленные, как описано в главе 2, пункт 2.3. Было приготовлено несколько серий растворов через десятичные, сотенные и тысячные разведения.
Первоначальная активность препаратов измерялась в день приготовления растворов, далее они хранились при комнатной температуре на свету. Энергию прорастания проверяли через 30 суток. В качестве контроля служил раствор на основе питательной среды Мурасиге-Скуга.
На первом этапе исследования были поставлены опыты на сохранность биологической активности препаратов на основе ОЭДФ, они проводились в пятикратной повторности. Для подтверждения полученных результатов были поставлены аналогичные опыты с ЭДТА, однако для повышения достоверности кратность опытов была увеличена до 10. Данные о влиянии массовой доли свежеприготовленных растворов комплексонатов ОЭДФ и
Данные рисунков 9,10 показывают закономерности в полимодальном характере проявления биологической активности. Максимумы величины энергии прорастания при десятичном разведении наблюдались при массовой доле комплексонатов биогенных металлов в растворе 10"3М и 10"ПМ. Для растворов, полученных через сотенные и тысячные разведения, максимумы активности также были при массовой доле 10" М и 10" М. Однако они были несколько меньше по амплитуде, по сравнению с десятичным разведением, для сотенного разведения активность уменьшилась на 4 %, а для тысячного разведения на 6 %. Данные об изменении биологической активности этих растворов представлены на рисунках 11-12.
