Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Аналитический обзор 7
1.1 Мониторинг металлов-экотоксикантов 7
1.1.1 Мониторинг содержания тяжелых металлов биологических в пробах Свинец 9
1.1.2 Мониторинг металлов по биологическим показателям Ртуть 12
1.2.1 Масс-спектрометрия с индуктивно связанной плазмой (МС-ИСП) 16
1.2.2 Атомно-абсорбционная и атомно-флуоресцентная спектрометрии 20
1.2.3 Метод инверсионнй вольтамперометрии (ИВА) 31
1.2.4 Аппаратурное и метрологическое обеспечение выполнения измерений и контроль качества 35
1.3.1 Генотоксические эффекты тяжелых металлов 40
1.3.2 Нейротоксические эффекты тяжелых металлов 44
1.4 Реакции организмов при радиационн- химических воздействиях в низких дозах 51
1.4.1 Генотоксические эффекты малых доз радиационно-химических воздействий 52
1.4.2 Нейротоксические эффекты малых доз радиационно-химических воздействий 58
ГЛАВА 2 ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 64
2.1 Объект исследования 64
2.2 Материалы и реактивы 65
2.3 Облучение животных 65
2.4 Методика измерения массовой концентрации общей ртути в пробах воды 65
2.4.1 Материально-техническое обеспечение метода 67
2.4.2 Подготовка к выполнению измерений 69
2.4.3 Выполнение измерений 73
2.4.4 Вычисление результатов измерений 74
2.4.5 Контроль результатов измерений 74
2.5 Методика измерений массовой концентрации общей ртути в пробах крови и почках крыс 76
2.5.1 Материально-техническое обеспечение метода 77
2.5.2 Подготовка к выполнению измерений 79
2.5.4 Обработка результатов измерений 85
2.5.5 Контроль результатов измерений 86
2.6 Методика измерений содержания свинца в пробах крови, почках и воде 87
2.6.1 Материально-техническое обеспечение метода 88
2.6.2 Подготовка к выполнению измерений 89
2.7 Определение концентрации ДНК в лизатах клеток крови 91
2.8 Двухпараметровый флуоресцентный анализ структуры ДНК нуклеоидов 94
2.9 Метод оценки естественной поведенческой активности животных 100
2.10 Статистическая обработка результатов 100
Глава 3 Результаты инструментального мониторинга тяжелых металлов и биотестирование при радиаиионно-химических воздействий в низких дозах 101
3.1 Результаты биомониторинга ртути и биотестирования радиационно 101
-ртутных воздействий в малых дозах 101
3.1.1 Результаты определения концентрации ртути в крови и почках крыс 101
3.1.2 Результаты биотестирования ранних эффектов и восстановления 102
3.1.3 Изменения естественной поведенческой активности животных после радиационно-ртутных воздействий в малых дозах 104
3.1.4 Отдаленные эффекты 105
3.2 Результаты биомониторинга свинца и биотестирования радиационно-свинцовых воздействий в малых дозах 109
3.2.1 Результаты определения концентрации свинца в пище, крови и почках крыс 109
3.2.2 Результаты биотестирования ранних эффектов и восстановления 111
3.2.3 Изменение естественной поведенческой активности животных 115
3.2.4 Отдаленные эффекты 115
Глава 4 Влияние минеральной воды на цитотоксические эффекты малых доз радиационно-ртутных воздействий 129
4.1 Результаты влияния минеральной воды на биомониторинг ртути при малых дозах радиационно-ртутных воздействий 129
4.2. Результаты влияния минеральной воды на показатели биотестирования малых доз радиационно-ртутных воздействий 130
Выводы 135
Список литературы 137
- Масс-спектрометрия с индуктивно связанной плазмой (МС-ИСП)
- Подготовка к выполнению измерений
- Изменения естественной поведенческой активности животных после радиационно-ртутных воздействий в малых дозах
Масс-спектрометрия с индуктивно связанной плазмой (МС-ИСП)
Масс-спектрометрия используется для определения различных элементов в следовых и ультраследовых количествах в биологических жидкостях и тканях (обычно ниже 10 нг/мл) [35]. Следует сразу отметить, что анализ крови, проводимый этим методом, требует сравнительной большой предварительной подготовки образца. Обычные органические компоненты, присутствующие в такой пробе (в основном белки), необходимо удалить перед анализом и это часто осуществляется путем гидролиза биологического образца минеральными кислотами в течение определенного периода времени. Более быстрый способ состоит в простом разбавлении образца соответствующим растворителем, а затем производится или простое осаждение под действием естественной силы тяжести, или центрифугирование пробы перед измерением следов металлов в супернатанте. Последний способ подготовки проб имеет ряд преимуществ. В частности, снижается риск значительного загрязнения холостой пробы; удается избежать потери легкоиспаряющихся элементов, таких как ртуть. Такая пробоподготовка является сравнительно быстрой и удобной; исключается необходимость в специальном оборудовании для проведения гидролиза. В возможных случаях отдается предпочтение подготовке пробы путем разбавления образца, если только степень разбавления позволяет осуществить измерение. Ниже описано определение тяжелых металлов в цельной крови при 20-кратном разбавлении образца и последующего прямого анализа с использованием прибора Agilent 7500 ICP-MS (фирмы Agilen Technologies, Palo Alto, CA, USA). В качестве стандартов были использованы эталонные соединения сертифицированной цельной крови содержащие свинец или ртуть [36]. Для каждого образца был приготовлен свой эталонный стандарт. Для анализа использовались реактивы высокой степени чистоты: деионизированная вода (18 Мом см 1 ), полученная на установке Millipore, Bedford, MA, USA и азотная кислота качества optima grade, фирмы Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA. Для приготовления калибровок и образцов были использованы стандарты таких элементов как германий, иттрий, ртуть, свинец и тербий в концентрациях 1000 ррт, золото было использовано в концентрации 100 ppm (SPEX, Netuchem, NY, USA). Рабочий маточный раствор смеси Международного Стандарта (включающего германий, иттрий и тербий) приготовлялся в концентрации 1 ррт в 5% азотной кислоте из маточных растворов для каждого элемента. Использование висмута в качестве внутреннего стандарта не рекомендуется, так как он является составным компонентом в некоторых протокольных схемах лечения больных.
Вследствие сложной природы состава отдельных компонентов крови, для всех этих процедур предпочтительной является калибровка путем внесения добавок в анализируемую пробу [37]. Для оценки степени влияния компонентов крови на измерение величин стандартов в 10- или 12-мл пробирку вносили 9,48 мл воды и туда же добавляли 0,5 мл цельной крови. После этого добавляли 0,01 мл смеси Международного Стандарта и 0,01 мл раствора золота. Такая последовательность добавления соответствующих растворов обеспечивала минимальное осаждение белков. Супернатант был проанализирован или после краткого (1 мин) центрифугирования пробы, или после, по крайней мере, 20 минутной декантации, чтобы дать возможность осадку самопроизвольно осесть на дно пробирки. Если в наличие имелось менее 0,5 мл цельной крови, то все объемы могли быть пропорционально изменены. Важно в итоге, чтобы конечный фактор разбавления был равен 20, конечная концентрация внутренних стандартов составляла 1 ppb, а конечная концентрация золота - 100 ppb.
Существует 3 способа приготовления крови для анализа: 1) разбавление 0,2% азотной кислотой с последующим центрифугированием; 2) разбавление 5% тетраметиламмонийгидроксидом (ТМАГ); 3) расщепление концентрированной азотной кислотой с последующей фильтрацией.
В первом способе кровь разбавляется (1 : 20) 0,2% азотной кислотой и добавляется внутренний стандарт. Образцы затем центрифугируют в течение 5 мин и фильтруют таким образом, чтобы отделить твердые частицы от раствора. Отделение этих твердых частиц является важным, чтобы уменьшить вероятность засорения распылителя и конуса пробоотборника.
Вторая процедура включает 10-кратное разбавление крови 5% ТМАГ -сильного щелочного комплексообразующего агента, который стабилизирует анализируемую пробу и расщепляет матрикс. После того как ТМАГ смешивается с кровью, образуется прозрачный красноватый раствор без какого-либо осадка. Эта процедура является выигрышной вследствие ее простоты и скорости. Так как она представляет собой простое разбавление пробы, то это позволяет снизить вероятность внесения других дополнительных загрязнений в измеряемый образец.
Третий способ включает расщепление (гидролиз) пробы концентрированной азотной кислотой перед разбавлением ее в 10 раз деионизированной водой. Эта процедура приводит к образованию значительного количества сгустков, которые необходимо отфильтровать, чтобы полностью удалить частицы из пробы.
Ртуть определяется методом МС-ИСП, когда этот металл превращен в пар [38]. Необходимо отметить, что ртуть является сложным элементом для анализа, так как при концентрации 100 ррт имеется склонность к её сорбции на поверхности системы введения образца. В этом случае следует использовать распылительную камеру из кварца, потому что распылители, сделанные из полимерных материалов, таких как РТЕТ и Ryton имеют склонность больше повреждаться при определении ртути, чем кварц. Кроме того, использование избытка золота также помогает снизить эффект последствий предыдущего измерения. Добавление солей золота для этих целей к образцам, в которых определялась ртуть, было впервые осуществлено «Агенством по охране окружающей среды» США в 1994 г. [ЕРА Method, 1994] и теперь успешно используется во многих коммерческих лабораториях.
Стандартный комплект прибора Agilent 7500 benchop ICP-MS, снабженный поперечно-проточным впрыскивалетем и кварцевой распылительной камерой, в настоящее время используется во многих лабораториях США. Калибровочные стандарты и образцы, сертифицированные эталонными материалами, вводятся с помощью автоматического пробоотборника. Программное обеспечение перистальтической помпы Agilent 7500 устанавливается таким образом, что скорость введения образца увеличивалась во время цикла промывки. В результате сокращается общее время анализа. Все растворы для промывки содержали соль золота в концентрации 100 ppb. В конце работы данные автоматически вносились в указанную базу данных. Ёмкость автоматического пробоотборника составляла 270 образцов, в дополнение ко всем необходимым вспомогательным растворам. В случае необходимости прибор мог автоматически выключаться в конце работы.
Калибровочная кривая была построена на основании 6 точек в водных растворах (1% азотная кислота). Предпочтительными единицами для представления данных о содержании микроэлементов в жидкостях и тканях тела человека являются микрограммы на литр - мкг/л (согласно документа С38 NCCLS [39]) или в качестве приемлемой эквивалентной единицы - нанограммы на миллилитр (нг/мл).
Анализ сертифицированных эталонных материалов (СЭМ) из Центра Токсикологии Квебека показал следующее. Так как каждый эталонный материал был сертифицирован для определения только одного элемента в цельной крови, то были использованы следующие СЭМ: для определения свинца - L-98-02, для определения ртути - М-98-01. Согласно данным количественного определения концентраций СЭМ и тяжелых металлов в пробах содержание в крови человека, не подвергавшегося профессиональным вредным воздействиям составляло: для свинца - 86,5 мкг/л, а ртути - 7,82 мкг/л.
Подготовка к выполнению измерений
Приготовление бромазотной смеси - Приготовление бромид-броматной смеси: В 100 см дистиллированной .воды растворяют навески 1,44 г КВг и 1,86 г КВЮз- Раствор устойчив для хранения.
- Приготовление азотной кислоты концентрации 10 моль/ дм3: Доводят дистиллированной водой 67 см3 концентрированной азотной кислоты до 100 см3.
- Смешивают равные объемы бромид-броматной смеси и азотной кислоты концентрации 10 моль/ дм3. За счет выделяющегося брома раствор приобретает бурую окраску. Раствор используют в течение дня.
Приготовл?ение раствора восстановительного реагента. Для приготовления восстановительного реагента берут навеску гидроксида натрия величиной 1,0 г и помещают в мерную колбу вместимостью 200 см3. Заполняют колбу на 2/3 объема дистиллированной водой и растворяют навеску. В полученный раствор гидроксида натрия помещают таблетку боргидрида натрия массой 1,00 г, растворяют ее и дополняют объем раствора дистиллированной водой до 200 см3 . Полученный раствор содержит 0,5% гидроксида натрия и 0,5% боргидрида натрия. Раствор переливают в склянку с притертой крышкой и хранят в холодильнике до использования. Срок хранения раствора 1 месяц. Приготовление раствора азотной кислоты (раствора разбавления) Мерным цилиндром вместимостью 25-50 см3 отмеривают 25см3 концентрированной азотной кислоты (d=l,37 см3). В мерную колбу вместимостью 500 см3 помещают от 200 до 250 см3 дистиллированной воды и осторожно переливают из цилиндра азотную кислоту в воду. Перемешивают содержимое и дополняют объем раствора дистиллированной водой до 500 см3. Полученный раствор содержит 5% азотной кислоты. Раствор используют для приготовления градуировочных растворов. Срок хранения не ограничен. Приготовление градуировочных растворов. - Градуировочный раствор С і с массовой концентрацией ртути 10 мкг/см3 готовят из ГСО, находящегося в ампуле вместимостью около 6 см3 с массовой концентрацией ртути 1 мг/см3. Ампулу вскрывают, отбирают сухой пипеткой 1 см3 раствора ГСО и помещают в мерную колбу вместимостью 100 см3. Заполняют колбу на 2/3 объема раствором разбавления, тщательно перемешивают содержимое и дополняют до 100 см3 раствором разбавления. В 1 см3 этого раствора содержится 10 мкг ртути. Раствор может храниться в холодильнике в течение 3 месяцев. - Градуировочный раствор Сі с массовой концентрацией ртути 0,1 мкг/см готовят из раствора С. Пипеткой вместимостью 1 см3 отбирают 1 см3 раствора Сі и помещают в мерную колбу вместимостью 100 см3. Заполняют колбу на 2/3 объема раствором разбавления, тщательно перемешивают содержимое и дополняют до 100 см3 раствором разбавления. В 1 см3 этого раствора содержится 0,1 мкг ртути. Раствор может храниться в холодильнике в течение 1 месяца.
- Градуировочный раствор Сз с массовой концентрацией ртути 0,005 мкг/см3 готовят из раствора Сг. Пипеткой вместимостью 5 см отбирают 5 см раствора Сг и помещают в мерную колбу вместимостью 100 см3. Заполняют колбу на 2/3 объема раствором разбавления, тщательно перемешивают содержимое и дополняют до 100 см3 раствором разбавления. В 1 см3 этого раствора содержится 0,005 мкг (5 нг) ртути. Раствор должен быть использован в течение дня.
- Градуировочный раствор С4 с массовой концентрацией ртути 0,0025 мкг/см3 готовят из раствора Сг. Пипеткой вместимостью 5 см3 отбирают 2,5 см3 раствора Cj и помещают в мерную колбу вместимостью 100 см3. Заполняют колбу на 2/3 объема раствором разбавления, тщательно перемешивают содержимое и дополняют до 100 см3 раствором разбавления. В 1 см3 этого раствора содержится 0,0025 мкг (2,5 нг) ртути. Раствор должен быть использован в течение дня.
- Градуировочный раствор С5 с массовой концентрацией ртути 0,001 мкг/см3 готовят из раствора Сз. Пипеткой вместимостью 10 см3 отбирают 10 см3 раствора Сз и помещают в мерную колбу вместимостью 50 см3. Заполняют колбу на 2/3 объема раствором разбавления, тщательно перемешивают содержимое и дополняют до 50 см3 раствором разбавления. В 1 см3 этого раствора содержится 0,001 мкг (1,0 нг) ртути. Раствор должен быть использован в течение дня.
- Градуировочный раствор С6 с массовой концентрацией ртути 0,0005 мкг/см3 готовят из раствора Сз. Пипеткой вместимостью 5 см3 отбирают 5 см3 раствора С3 и помещают в мерную колбу вместимостью 50 см3. Заполняют колбу на 2/3 объема раствором разбавления, тщательно перемешивают содержимое и дополняют до 50 см3 раствором разбавления. В 1 см этого раствора содержится 0,0005 мкг (0,5 нг) ртути. Раствор должен быть использован в течение дня.
- Градуировочный раствор С7 с массовой концентрацией ртути 0,0001 мкг/см3 готовят из раствора Сз. Пипеткой вместимостью 1 см3 отбирают 1 см3 раствора Сз и помещают в мерную колбу вместимостью 50 см3. Заполняют колбу на 2/3 объема раствором разбавления, тщательно перемешивают содержимое и дополняют до 50 см раствором разбавления. В 1 см3 этого раствора содержится 0,0001 мкг (0,1 нг) ртути. Раствор должен быть использован в течение дня.
Анализатор ЭГРА-01 готовят к работе в соответствии с Руководством по эксплуатации. Перед измерением определяют фоновые показания прибора в соответствии с техническим описанием и инструкцией по эксплуатации. Порядок выполнения градуировки
Градуировку прибора выполняют в соответствии с Руководством по эксплуатации ЭГРА-01 перед введением прибора в эксплуатацию или после перерыва в работе более 1 месяца. При проведении следует учитывать величину «фона» раствора разбавления.
Градуировку прибора выполняют путем анализа градуировочных растворов C7-Ci (см. выше) не менее, чем в двухкратной повторности.. Для градуировки используют растворы (не менее трех), концентрации ртути в которых охватывают ожидаемый диапазон концентраций анализируемых растворов. Объем пробы в реакторе при градуировке должен быть равен объему анализируемой пробы. Измерения проводят от низких концентраций к высоким. В процессе выполнения градуировки проводят оперативный контроль сходимости результатов. Градуировочную характеристику представляют в виде
Изменения естественной поведенческой активности животных после радиационно-ртутных воздействий в малых дозах
Через 3 месяца после облучения у крыс, подвергшихся воздействию ртути и облучения в дозе 25 сГр, наблюдалось более чем 2-кратное возрастание времени поиска пищи в лабиринте (до 155,5+18,4 сек; n = 20; р 0.01) по сравнению с животными контрольной группы (66,8+5,9 сек; n = 15). Это свидетельствовало о том, что после периода пострадиационного восстановления при малых дозах радиационно-ртутных воздействий у животных наблюдались существенные изменения естественной поведенческой активности даже после восстановления показателя стабильности генома в лейкоцитах.
Данные других авторов, использовавших в качестве нейротоксиканта такое соединение как соль аммония, показали, что 50% изменение поведенческого ответа у нематод Caenorhabditis elegans имело место в случае, если концентрация токсиканта была примерно в 15 раз ниже СД5о [247]. Для свинца такое изменение поведенческой активности наблюдалось, когда его концентрация была в 22 раза ниже, чем СД50- Таким образом, изменения поведенческой активности являются гораздо более чувствительным критерием токсического эффекта, чем гибель животных.
Согласно нашим данным, радиационно-ртутное воздействие в гораздо более низких дозах (близким к допустимым), приводило к значительным изменениями естественной поведенческой активности животных, что может отражать повреждения их нервной системы после нанесенных сочетанных воздействий. Выявленные нами изменения в поведении крыс согласуются с результатами морфологических изменений в ЦНС, которые были зарегистрированы другими исследователями [179]. Эти авторы показали, что через 3 месяца после гамма-облучения в дозе 25 сГр увеличивалось (примерно на 19%) количество нейронов сенсомоторной части коры головного мозга крыс с легкими и дистрофическими изменениями. Соответственно уменьшалась частота неизмененных нейронов. Таким образом, есть основания полагать о достаточно высокой морфофункциональной чувствительности нервной ткани к малым дозам радиационно-ртутных воздействий. 3.1.4 Отдаленные эффекты
Наблюдение за динамикой гибели крыс показало, что изолированное облучение в дозах 25 или 50 сГр, или введение соли ртути в допустимых концентрациях не приводило к значимым изменениям смертности животных по сравнению с аналогичными показателями в группе интактного контроля (табл.6). Вместе с тем, после облучения в дозе 25 сГр наблюдалось ускорение гибели животных, которые получали соль ртути в питьевой воде, как по сравнению с интактным контролем, так и по сравнению с облученными крысами (сокращение средней продолжительности жизни примерно на 15%). В случае дозы облучения 50 сГр продолжительность жизни животных, получавших соль ртути, сокращалась только по сравнению с группой облученных крыс не получавших токсиканта, но не относительно аналогичного параметра в группе интактного контроля.
Изменения показателей продолжительности жизни после ртутно-радиационных воздействий коррелировали с вышеупомянутыми изменениями величин параметров ИД в конце периода пострадиационного восстановления (R=0,892, р 0,05), но не с данными, полученными при прямом определении ртути в крови или почках крыс. Аутопсия показала, что гибель животных была обусловлена различными интеркуррентными заболеваниями, преимущественно пневмонией.
Таким образом, биотестирование сочетанного действия малых доз ионов ртути и гамма-облучения позволило выявить определённую специфичность молекулярно-клеточных механизмов обусловливающих отдаленные последствия этих воздействий. При изолированном действии в допустимой концентрации ионы ртути не проявляли значимой токсичности, что согласуется с известными данными [248]. Повышение содержания ртути в почках после подведённых доз радиации свидетельствует о том, что малые дозы гамма-облучения могут потенцировать аккумуляцию ртути в определенных тканях организма. Однако, отсутствие достоверной корреляции между содержанием ртути в этих органах и выживаемостью животных свидетельствует о том, что на основании только одного биомониторинга металла в отдельных тканях организма невозможно прогнозировать отдаленные биологические эффекты. В то же время биотестирование (например, по определению ИД лейкоцитов) позволило установить, что в сочетании с лучевым воздействием ионы ртути могут модифицировать ранние генотоксические эффекты радиации в лейкоцитах крови, а также выявить определенные различия в течение 30-суточного пострадиационного восстановления. Биотестирование использованных малых доз соли ртути в питьевой воде при её изолированном воздействии в ранние сроки не выявило значимых гематотоксических или генотоксических реакций, но при
Изменение продолжительности жизни крыс после радиационно-ртутных воздействий
Группа животных Число крыс Средняя продолжительность жизни (сутки)
Интактный контроль Облучение в дозе 25 сГр Облучение в дозе 50 сГрВведение ртутиВведение ртути + облучение в дозе 25сГрВведение ртути + облучение в дозе 50сГр 42 34 3418 19 20 531+22 540+25 598+30512+37 456+30 483+27
Примечание: знаком помечены величины, достоверно (р 0,05) отличающиеся от значений интактного контроля. сочетанном действии наблюдалось снижение величины ИД после действия ртути в низкой концентрации и облучения как в дозе 25 сГр, так и в дозе 50 сГр. Это свидетельствовало о генотоксическом эффекте сочетанного радиационно-ртутного воздействия в низких дозах, б усилении генотоксического эффекта Через 30 сут после облучения не наблюдалось достоверных генотоксических реакций при изолированном действии низких доз радиации или токсиканта. Однако, после комбинированного действия этих агентов содержание ДНК лейкоцитов крови снижалось на 45% (ртуть + 25 сГр) - 34% (ртуть + 50 сГр). Показатели, полученные нами при биотестировании, могут быть применены для прогнозирования отдаленных последствий радиационно-ртутных повреждающих воздействий в малых дозах.
Похожие диссертации на Оценка и минимизация влияния низких доз техногенного радиационно-химического воздействия на млекопитающих
