Введение к работе
Актуальность проблемы. Таксономический состав микробного населения является одной из наиболее важных характеристик естественных морских экосистем Молекулярно-биологические методы, применяемые для исследования этих сложных биологических образований, существенно обогатили наши знания о видовом разнообразии и структуре микробных сообществ, включая как некультивируемые, так и культивируемые микроорганизмы Применение методов изоляции и культивирования морских бактерий остается существенным для понимания физиологии и экологии морских организмов
Тип Bacteroidetes, или тип Cytophaga-Flavobactenum-Bacteroides (CFB), представляет одну из основных филогенетических ветвей домена Bacteria и объединяет гетеротрофных грамотрицательных и палочковидных бактерий, которые способны передвигаться посредством скольжения Бактерии данного типа являются одним из доминирующих компонентов микробиоты морских экосистем и характеризуются большим видовым разнообразием и широким спектром адаптации к различным условиям обитания (Bernardet et al, 2006, Bowman, Abel, 2005, Kirchman, 2002) В настоящее время тип Bacteroidetes включает морских бактерий, которые представлены 65 валидно описанным родом и 114 видами, а также 8 видами с неопределенным таксономическим положением Следует отметить, что 52 рода, включающих 76 видов, представлены облигатно морскими бактериями Среди них преобладают члены сем Flavobacteriaceae, которые отнесены к 42 родам и 80 видам Бактерии, принадлежащие к 29 родам и 44 видам, встречались только в морской среде Морские Cytophaga-поюобтле. бактерии обладают широким спектром физиологических адаптации, что позволяет им осваивать разнообразные экониши Мирового океана, а мультиферментные системы помогают утилизировать любые субстраты в качестве источников углерода и энергии, необходимые для метаболизма (Reichenbach, 1992) Изучение ферментов, гидролизующих природные соединения в океане, актуально, поскольку дает представление о механизмах и скорости трансформации бактериями органического вещества в морских экосистемах
Несмотря на постоянный интерес микробиологов к поиску и изучению новых бактерий типа Bacteroidetes в различных экосистемах Мирового океана, бактерии данной таксономической группы, обитающие в Тихоокеанском бассейне, почти неизучены с позиции их экофизиологических и таксономических особенностей Таким образом, фундаментальное значение с точки зрения их биоразнообразия, имеет изучение экофизиологических свойств и таксономического состава морских бактерий типа Bacteroidetes Исследование метаболического потенциала и особенностей строения Cytophaga-подобных. бактерий обогатит наши знания о биологической активности данных микроорганизмов и о занимаемых ими экологических нишах Совокупность знаний о таксономическом разнообразии, местах обитания и биологическом потенциале позволит оценить роль бактерий типа Bacteroidetes в преобразовании органического вещества в морских экосистемах Создание коллекций культур является необходимым условием сохранения штаммов
новых морских бактерий, а также штаммов-продуцентов ценных биологически-активных веществ
Цель настоящей работы - охарактеризовать экофизиологические свойства и таксономический состав аэробных гетеротрофных бактерий типа Bacteroidetes, изолированных из морей бассейна Тихого океана
Для выполнения поставленной цели предстояло решить следующие задачи
Выделить чистые культуры морских аэробных гетеротрофных бактерий типа Bacteroidetes из различных микробных сообществ морей бассейна Тихого океана и культивировать полученные штаммы бактерий
Охарактеризовать изолированные штаммы бактерий на основе метода полифазной таксономии
Установить таксономический статус выделенных штаммов, определить таксономическую структуру и описать новые таксоны морских аэробных гетеротрофных бактерий типа Bacteroidetes.
4 Исследовать экофизиологические свойства изолятов и определить их
v метаболический потенциал
5 Провести поиск штаммов-продуцентов гидролитических ферментов и других
биологически активных веществ, перспективных для биотехнологии
Основные положения, выносимые на защиту:
Гетеротрофные бактерии типа Bacteroidetes широко распространены и являются постоянным компонентом мезофильных микробных сообществ экосистем морей бассейна Тихого океана
Морские Cytophaga-подобные бактерии характеризуются значительным таксономическим разнообразием Применение метода полифазной таксономии позволило идентифицировать представителей 32 родов и 49 видов бактерий и описать 45 новых видов в составе 8 известных и 18 новых родов
Метаболически активные бактерии родов Cellulophaga, Maribacter и Zobelha являются доминирующими таксономическими группами среди культивируемых бактерий сем Flavobacteriaceae и типа Bacteroidetes в целом
Морские бактерии типа Bacteroidetes являются продуцентами уникальных биологически-активных веществ, в том числе ферментов, инактивирующих групповые вещества крови человека
Научная новизна работы. Впервые детально изучены экологические особенности, распространение, видовой состав и таксономическая структура бактерий типа Bacteroidetes, изолированных из акваторий Тихого океана Показано, что выделенные бактерии являются таксономически гетерогенной группой и принадлежат к 32 родам и 49 видам в составе типа Bacteroidetes Фундаментальное значение имеет детальная характеристика и описание новых эволюционных линий бактерий, отнесенных к 18 новым родам и 45 новым видам В результате проведенного таксономического исследования впервые идентифицированы и описаны бактерии новых родов Algibacter, Aquimanna, Arenibacter, Bizioma, Echinicola, Fulvivirga, Gramella, Leeuwenhoelaella, Maribacter, Mariniflexile, Mesonia, Pibocella, Pontibacter, Reichenbachiella, Roseivirga, Ulvibacter, Vitelhbacter и Winogradskyella Описаны также новые виды в составе известных родов
Algoriphagus, Cellulophaga, Cyclobacterium, Formosa, Gilhsia, Polanbacter, Salegentibacter и Zobellia В данном исследовании уточнен и дополнен диагноз рода Formosa, члена сем Flavobactenaceae класса Flavobacteria, на основании вновь полученных результатов Род и вид Gaetbulimicrobium brevivitae реклассифицирован как Aquimarina brevivitae comb nov на основании филогенетического анализа и сходства в составе клеточных жирных кислот Два вида с неопределенным таксономическим положением [Cytophaga] latercula и [Cytophaga] marmoflava реклассифицированы в новые роды Aquimarina и Leeuwenhoekiella, соответственно Роды Hongiella и Chimaereicella, принадлежащие к классу Sphingobacteria, реклассифицированы в род Algoriphagus на основании близкого филогенетического родства, генотипических и фенотипических характеристик
Установлено, что члены сем Flavobactenaceae являются доминирующей таксономической группой среди бактерий типа Bacteroidetes, изолированных из микробных сообществ морей Тихого океана, и впервые показано, что бактерии этого семейства, принадлежащие к родам Cellulophaga, Maribacter и Zobellia, существенно численно превосходят другие культивируемые бактерии типа Bacteroidetes Полученные новые знания значительно расширили наши представления о биологии, экологии и таксономическом разнообразии, видовом составе и филогенетических взаимосвязях морских Cytophaga-noji,o6iiu% бактерий
При изучении морфологии клеток штамма нового вида бактерий Formosa aganphila КММ 3901Т впервые обнаружен неизвестный ранее для Cytophaga-подобных бактерий тип размножения - почкование
Практическое значение. Изучены экофизиологические особенности, распространение и таксономическая структура аэробных морских бактерий типа Bacteroidetes, изолированных из различных микробных сообществ Тихого океана на основе применения современных молекулярно-биологических методов, показано, что Cytophaga-подобные бактерии бассейна Тихого океана являются таксономически разнообразной группой, включающей членов 32 родов и 49 видов
В результате исследования метаболической активности выявлено присутствие протеаз, гликозилгидролаз, липаз и ДНК-аз у более чем 50% исследованных штаммов и проведен отбор перспективных для биотехнологии штаммов бактерий, обнаружен и запатентован штамм новой морской бактерии Arembacter latericius КММ 42бт - продуцент а-Л'-ацетилгалактозаминидазы, способной конвертировать вещества группы крови человека А в группу О в физиологических условиях, что может найти применение в трансфузионной медицине, полученные и охарактеризованные гликозилгидролазы могут использоваться в структурных и биохимических исследованиях и быть основой для биотехнологического производства ферментов с заданной субстратной специфичностью Выявление особенностей распространения бактериальных продуцентов гликозидаз может способствовать более успешному поиску данных ферментов
Создана, поддерживается и постоянно пополняется коллекция штаммов морских бактерий типа Bacteroidetes в составе Коллекции морских микроорганизмов ТИБОХ ДВО РАН, которая содержит типовые штаммы, штаммы-продуценты биологически активных веществ и микроорганизмы, идентификация которых продолжается в настоящее время,
Изучение таксономической структуры морских микроорганизмов, как свободноживущих, так и ассоциированных с макрогидробионтами и их способности синтезировать физиологически активные вещества служит источником новых знаний о роли ассоциативной микрофлоры в жизнедеятельности населяющих океан организмов и, в конечном счете, функционировании морских экосистем, которые могут быть использованы для обучения экологов и морских микробиологов
Место проведения работы. Работа выполнялась в лаборатории микробиологии ТИБОХ ДВО РАН с 1989 по 2007 гг
Благодарности Автор выражает глубокую благодарность директору ТИБОХ ДВО РАН академику В А Стонику и чл -корр РАН В.В Михайлову за всестороннюю поддержку в проведении работы, искреннюю признательность Prof Dr Н -Y Park, Dr К -S Bae, Dr M Suzuki, Dr S В Kim, Prof Dr J Swings, Dr M Vancanneyt, Prof Dr Stackebrandt, Dr M Rohde и другим коллегам за помощь в работе Автор признателен своим соавторам - сотрудникам лаборатории микробиологии, химии ферментов, химии углеводов и химии микробных метаболитов ТИБОХ ДВО РАН, Института микробиологии им С Н Виноградского РАН и лаборатории сравнительной биохимии Института биологии моря ДВО РАН за участие в работе и дружескую помощь
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на International Science Conference "Bridges of Science between North America and the Russian Far East", Anchorage, USA -Vladivostok, Russia, 1994, International Conference of North Pacific Marine Science Organization (PICES) «Workshop on the Okhotsk Sea and adjancent Areas» Vladivostok, Russia, 1995, Conference Oceanology International 97 Pacific Rim, Singapore, 1997, 8-th International Symposium on Microbial Ecology (ISME-8), Halifax, Canada, 1998, II Дальневосточной региональной конференции "Новые медицинские технологии на Дальнем Востоке", Владивосток, Россия, 1998, 2-м Международном симпозиуме «Химия и химическое образование», Владивосток, Россия, 2000, региональной научной конференции ТИБОХ ДВО РАН «Биоактивные вещества из морских макро- и микроорганизмов и наземных растений Дальнего Востока», Владивосток, Россия, 2001, Meeting of the Microbial Society of Korea, Cheonan, Korea, 2004, International Meeting of the Federation of Korean Microbiological Societies, Seoul, Korea, 2004", Региональной научной конференции "Исследования в области физико-химической биологии и биотехнологии", Владивосток, Россия,
"Isolation and identification of the novel flexibactena using polyphasic approach", International Union of Microbiological Societies (IUMS) Congress, San-Francisco, USA,
II Региональной научной конференции "Исследования в области физико-химической биологии и биотехнологии", Владивосток, Россия, 2006
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 72 печатные работы 51 экспериментальная статья, 20 тезисов докладов и 1 патент.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (главы 1-3), экспериментальной части объектов и методов исследования (глава 4), результатов и обсуждения (главы 5-6), заключения и выводов, изложенных на 240 страницах, включая 40 таблиц, 25 рисунков и списка цитируемой литературы из 361 наименования, из них 25 — на русском и 336 — на иностранных языках
